Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugetierzellen auf ultrastruktureller Ebene zu visualisieren, und zwar mit Hilfe einer dreidimensionalen hochauflösenden Mikroskopiemethode namens iPALM. Die iPALM-Bildgebung bietet eine räumliche Auflösung im Nanometerbereich in allen drei Dimensionen. Dies ermöglicht die Visualisierung von Ultrastrukturen mit Hilfe von Floreszenzsonden, was eine hohe Markierungsspezifität ermöglicht.

Das in diesem Video vorgestellte Verfahren sollte schnell anpassbar und lehrreich für die Visualisierung anderer ultrastruktureller Merkmale in Zellen durch Einzelmoleküllokalisierung auf der Grundlage der hochauflösenden Mikroskopie sein. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Zellen auf Deckgläsern in einer Sechs-Well-Platte vorbereiten. Um die bildgebende Probe zusammenzusetzen, verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Deckglas der Probe vorsichtig aus der Puffervertiefung zu entfernen.

Klopfen Sie dann schnell und vorsichtig überschüssigen Puffer ab, indem Sie den Rand des Deckglases mit gefaltetem, saugfähigem Papier berühren. Legen Sie die Deckglaszellenseite mit der Vorderseite nach oben auf ein Blatt sauberes Linsenpapier. Spülen Sie die Probe, indem Sie 30 bis 50 Mikroliter des Bildgebungspuffers auf die Probe geben.

Entfernen Sie überschüssigen Puffer durch Kippen und Klopfen mit gefaltetem saugfähigem Papier. Nachdem Sie den Spülschritt einige Male wiederholt haben, geben Sie 30 bis 50 Mikroliter Bildgebungspuffer auf die Probe. Tupfen Sie den Rand des Deckglases trocken und geben Sie mehrere sehr kleine Punkte aus schnell aushärtendem Epoxidharz auf die getrocknete Fläche.

Senken Sie ein weiteres vorgereinigtes Deckglas der Nummer 1,5 langsam auf die Mitte der Zelle mit 22 Millimeter Deckglas ab. Lassen Sie den Bildgebungspuffer beide Deckgläser durch Kapillarwirkung benetzen. Die kleinen Punkte aus schnell aushärtendem Epoxidharz sollten auf beiden Deckgläsern haften.

Drücken Sie vorsichtig mit gefaltetem saugfähigem Papier auf die zusammengesetzte Probe, um den Druck gleichmäßig zu verteilen. Üben Sie ausreichend Druck aus, um die Probenzelle dünn und gleichmäßig zu machen, aber nicht so sehr, dass die Zellen zerquetscht werden. Messen Sie die richtige Dicke, indem Sie das Muster der Newton-Ringe beobachten.

Achten Sie darauf, diesen Schritt vorsichtig durchzuführen, um Luftblasen zu minimieren. Üben Sie bei Bedarf vorher mehrmals mit leeren Deckgläsern. Versiegeln Sie anschließend die Probe mit geschmolzenem Vaseline-Lanolin-Paraffin.

Spülen Sie dann die versiegelte Probe mit entionisiertem Wasser ab. Föhnen Sie die Probe mit Druckluft, um sie für die Montage am Mikroskop vorzubereiten. Bewegen Sie die federbelastete obere Objektivlinse nach oben, um das Entfernen des Probenhalters zu ermöglichen.

Legen Sie die versiegelte Probe auf den Probenhalter und sichern Sie sie mit mehreren kleinen Seltenerdmagneten. Tragen Sie Immersionsöl auf beide Seiten der Bildgebungsprobe auf. Setzen Sie den Probenhalter wieder in den Strahlengang ein und senken Sie die obere Objektivlinse vorsichtig ab.

Schalten Sie die Anregungslaser ein. Schalten Sie die EMCCD-Kameras auch im Frame-Transfer-Modus ein. Drehen Sie anschließend die richtigen Emissionsfilter ein.

Aktivieren Sie einen mechanischen Verschluss, um den oberen Strahlengang zu blockieren und den unteren Strahlengang zu öffnen. Bringen Sie die untere Objektivlinse durch Translation in kleinen Schritten mit dem Piezoaktor in den Fokus. Sobald das Passerzeichen scharf ist, öffnen Sie den oberen Strahlengang, während Sie den unteren Strahlengang blockieren, und bringen Sie die obere Objektivlinse auf ähnliche Weise in den Fokus.

Überwachen Sie die Breite des Passerzeichens auf dem Computerdisplay, um eine optimale Fokussierung zu gewährleisten. Für eine korrekte Zentrierung öffnen Sie sowohl den oberen als auch den unteren Strahlengang. Stellen Sie das obere Objektiv manuell ein, während das untere Objektiv mit einem Paar mikrofeiner Stellschrauben konstant gehalten wird, bis die Passerbilder so eng wie möglich überlappen, idealerweise innerhalb eines Pixels.

Führen Sie anschließend Feineinstellungen durch, sodass sich die Passermarkenbilder innerhalb eines Zehntels eines EMCCD-Pixels überlappen. Stellen Sie die oberen beiden Achsen der piezomontierten Spiegel über die Steuerungssoftware ein, während Sie beide Objektive und die unteren Reflexionsspiegel konstant halten. Vergleichen Sie die Zentren der Passermarken der oberen und unteren Zielansicht über das Computerdisplay, um den Prozess zu steuern.

Wenn die Laser eingeschaltet sind, die Kameras kontinuierlich strömen und sowohl der obere als auch der untere Strahlengang offen sind, oszillieren Sie den Z-Piezo des Probenhalters mit einer sinusförmigen Spannungswellenform, die von der Steuerungssoftware für eine kontinuierliche Schwingung der Z-Achse über eine Größenordnung von 400 Nanometern erzeugt wird. Verschieben Sie die motorisierte Strahlteilerbaugruppe manuell nach oben oder unten, bis die Intensität der Passermarkenschwingungen zunimmt. Aufgrund des gewünschten Einzelphotonen-Interferenzeffekts bedeutet dies eine enge Übereinstimmung der optischen Weglängen.

Im Optimalfall kann ein Peak-to-Valley-Verhältnis von mehr als 10 erreicht werden. Um sicherzustellen, dass sowohl die Amplitude als auch die Phase an jeder Oberfläche über das gesamte Feld so gleichmäßig wie möglich sind, stellen Sie den unteren Spiegel der Strahlteilerbaugruppe in kleinen Schritten ein, um den Spalt und die Neigungswinkel fein abzustimmen. Führen Sie eine Feinausrichtung des Strahlteilers durch, indem Sie die Probe in Z-Schritten von acht Nanometern über 800 Nanometer verschieben.

Überwachen Sie die Passermarkenintensität zwischen den Kameras eins bis drei. Stellen Sie die Höhe, Position und Neigung des unteren Spiegels innerhalb der Strahlteilerbaugruppe in kleinen Schritten so ein, dass die Schwingungsphase der ersten Kamera relativ zur zweiten Kamera maximiert wird, idealerweise bei 120 Grad. Sobald die anfängliche Ausrichtung abgeschlossen ist, verschieben Sie die Probe in den Scan, um ein geeignetes Sichtfeld zu erhalten, das sowohl Zellen zum Bild als auch mehrere Passermarken in der Nähe enthält.

Platzieren Sie ein Gehäuse um das System, um Streulicht und Umgebungsstörungen zu blockieren. Sobald der Bildgebungsbereich gefunden wurde, verschieben Sie die Probe erneut und zeichnen Sie die Kalibrierungskurve auf, um sie für nachfolgende Z-Koordinaten-Extraktionen zu verwenden. Mit dem Befehl zur Erfassung der Kalibrierung werden Scans im Vergleich zur Position des Probenpiezos in der Hauptschnittstelle erfasst.

Sobald ein gewünschter Bereich gefunden und die Kalibrierungskurve erhalten wurde, geben Sie die entsprechenden Dateinamen in die Software ein. Öffnen Sie sowohl den oberen als auch den unteren Strahlengang und erhöhen Sie dann die Anregungsleistung des 642-Nanometer-Lasers auf das Maximum. Für Alexa Fluor 647 kann eine anfängliche Phase des Ausschaltens von Fluor-4 erforderlich sein.

Mit einer konstanten Anregung von 642 Nanometern fünf Minuten lang, bei Bedarf länger, belichten, bis ein einzelnes Molekül blinkt. Die Software ermöglicht eine automatische Erhöhung der Photoaktivierung um 405 Nanometer während der Erfassung. In der Regel ist eine große Anzahl von Erfassungsrahmen erforderlich, damit filamentöse Merkmale deutlich sichtbar sind.

Wenn Sie fertig sind, beginnen Sie mit der Erfassung von Rohbildsätzen mit dem Befehl start iPALM acquisition in der Hauptoberfläche. Passen Sie während der Aufnahme die Lichtaktivierungsstufe an, indem Sie die Intensität des 405-Nanometer-Lasers anpassen, um die richtige Blinkdichte nach Bedarf beizubehalten. Wenn der Probendeckglas richtig montiert ist, können Newtonsche Ringe mit bloßem Auge bei Umgebungslicht oder Standard-Leuchtstofflampen beobachtet werden.

Die Extraktion der axialen Positionen von Fluoreszenzemittern erfordert eine simultane Mehrphaseninterferenz in der iPALM-Bildgebung, die durch die Intensitätsänderungen eines gegebenen Referenzbildes in drei EMCCDs kalibriert wird. Die Intensitäten werden dann normiert und angepasst, um die Phasendifferenzen zu bestimmen. Hier ist das Rekonstruktions-iPALM-Bild mit jeder Lokalisierungskoordinate, die von einem 2D-Gauß-Schema gerendert wird, wobei die Breite der Lokalisierungsunsicherheit entspricht.

Die Z-Koordinate wird entsprechend dem Farbbalken eingefärbt. Bereiche mit dichten und spärlichen filamentösen Merkmalen sind zu sehen. Hier sind rekonstruierte iPALM-Bilder des Aktin-Zytoskeletts von HUVEC-Zellen, die mit Alexa Fluor 647 Phalloidin markiert sind.

Die Bildfarbe gibt die Z-Koordinaten entsprechend dem Farbbalken an. Das Histogramm des Querschnitts wird aus den XY-Lokalisierungskoordinaten entlang der Längsachse des geschachtelten Bereichs generiert. Die Gaußsche Anpassung zeigt die volle Breite bei einem halben Maximum von 43,88 Nanometern, das mit dem Querschnitt verbunden ist.

Dieses Histogramm zeigt die Z-Position der Lokalisierungskoordinaten im geschachtelten Bereich. Die Gaußsche Anpassung zeigt die volle Breite bei einem halben Maximum von 17,50 Nanometern. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 90 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie das Aktin-Zytoskelett mit iPALM durch einfache Vorbereitung und Montage, optische Ausrichtung, Rohdatenerfassung und die anschließende Analyse zur Rekonstruktion von hochauflösenden Bildern an der Ultrastruktur visualisieren können. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der Zellbiologie, um die nanoskalige Architektur des Aktin-Zytoskeletts sowie Zelladhäsionsstrukturen wie die fokalen Adhäsionen zu erforschen.