Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die NK-Zellzahl und die zytotoxischen Aktivierungsniveaus in einer menschlichen Vollblutprobe schnell, zuverlässig und stabil zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Fragen im immunologischen Bereich zu beantworten, wie z.B. Welche Auswirkungen haben Eingriffe von außen auf die Bioaktivität von NK-Zellen? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell und genau ist und dennoch reproduzierbare Ergebnisse über alle Experimente hinweg liefert.

Um NK-Zellen aus menschlichem Vollblut zu isolieren, platzieren Sie zunächst 15-Milliliter-Röhrchen mit der Aufschrift Vollblutprobe, negative Fraktion und positive Fraktion an den entsprechenden Positionen im Gestell des Zellseparatorröhrchens. Wenn alle Röhrchen geladen sind, setzen Sie das Separatorgestell für die automatische Etikettierung in den Minisampler ein und wählen Sie im Menü Reagenz aus, um die Position hervorzuheben, an der das Fläschchen auf dem Gestell platziert wird. Wählen Sie Reagenz lesen, um den 2D-Codeleser zu aktivieren, und halten Sie das entsprechende Reagenzfläschchen in einem Winkel von 0,5 bis 2,5 Zentimetern von der Abdeckung des Codelesers vor den 2D-Codeleser.

Platzieren Sie das gelesene Fläschchen in die entsprechende Position des Trenngitters. Markieren Sie anschließend auf der Registerkarte Trennung die gewünschten Positionen. Öffnen Sie dann das Untermenü Beschriftung und wählen Sie ein Programm für die automatische Beschriftung aus.

Ordnen Sie die Mikrokügelchen des Zellseparationsreagenzes den Rackpositionen 1, 2, 3 und 4 zu. Und wählen Sie das Posselwb-Separationsprogramm aus. Wählen Sie das Spülprogramm aus.

Geben Sie 1500 Mikroliter für das Probenvolumen im Untermenü Volumen ein und drücken Sie die Eingabetaste. Klicken Sie dann auf Ausführen, um die Zelltrennung zu starten. Klicken Sie auf OK, um zu bestätigen, dass genügend Puffer für die Verarbeitung aller Samples verfügbar ist.

Um eine Zytotoxizitätsassay-Probe vorzubereiten, markieren Sie zunächst 1,5-Milliliter-Röhrchen für jede Probe und/oder jeden Teilnehmer und spritzen Sie das gewünschte Verhältnis von NK-Zellen und DIO-markierten K562-Zellen in jedes Röhrchen aus. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellmischung in 500 Mikrolitern unvollständigem NK-Zellmedium und markieren die Zellen in jedem Röhrchen mit 5 Mikrolitern Propidiumiodid.

Entnehmen Sie die Zellen über eine weitere Zentrifugation und inkubieren Sie die Keulkultur zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen unter den gleichen Zentrifugenbedingungen und resuspendieren Sie das Pellet in 25 Mikrolitern frischem, unvollständigem NK-Zellkulturmedium. Um die Zellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, klicken Sie zunächst auf die Startschaltfläche in der Software für bildgebende Durchflusszytometer, um das System zu spülen.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Streudiagramm, um vier Streudiagramme zu erstellen, und laden Sie das doppelte positive Kontrollrohr. Bestimmen Sie mit der doppelten positiven Kontrollprobe die gewünschte Intensität für den 405-Milliwatt-Laser, damit der Detektor nicht überlastet wird, und stellen Sie den Imager so ein, dass er die entsprechende Anzahl von Zellzahlen erfasst. Die Einstellung des 405-Milliwatt-Lasers auf eine Intensität, die für die Detektion von DIO und PI geeignet ist, erfordert Erfahrung mit beiden Farbstoffen und dem Nachweisbereich des Durchflusszytometers.

Nachdem die Aufnahme der doppelten positiven Kontrollprobe abgeschlossen ist, laden Sie die reine DIO-Kontrollprobe, wählen Sie das 40X-Objektiv aus und schalten Sie den 642-Milliwatt-Laser und den Hellfeldkanal aus. Züchten Sie die entsprechende Anzahl von Zellen und wiederholen Sie die Entnahme für die Probe nur für Propidiumiodid. Wenn alle Kontroll-Samples ausgeführt wurden, schalten Sie den 405-Milliwatt-Laser und den Hellfeldkanal wieder ein und klicken Sie auf "Intensität einstellen".

Geben Sie dann auf der Registerkarte Dateierfassung einen benutzerdefinierten Dateinamen ein und wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Datendateien aus. Geben Sie als Nächstes die Anzahl der Zellen ein, die übernommen werden sollen. Laden Sie das erste experimentelle Probenröhrchen und klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen.

Wenn alle Proben ausgeführt wurden, öffnen Sie die Softwareanwendung für die bildgebende Durchflusszytometer-Analyse und öffnen Sie eine einzelne experimentelle RIF-Datei. Wählen Sie auf der Registerkarte "Vergütung" die Option "Neue Matrix erstellen" aus. Die Software fordert Sie auf, die einzelnen Farbdateien auszuwählen und sie zusammenzuführen, um eine Matrixdatei zu erstellen, die für die Anwendung der Kanalkompensation ausgewählt wird.

Verwenden Sie die Funktion Bausteine, um die entsprechenden Punktdiagramme einzurichten. Klicken Sie dann auf die Statistikfunktion, um auf die Zellennummern in jedem Gate zuzugreifen. In diesem repräsentativen Experiment wurden wie angegeben Blutproben entnommen und die Konzentration von NK-Zellen pro Milliliter Vollblut für jeden Läufer und im Mittel für jeden Zeitpunkt gemessen.

Drei von vier Läufern zeigten nach dem Training einen ähnlich leichten Anstieg der NK-Zellzahl. Unmittelbar gefolgt von einem starken Rückgang, bevor er 24 bis 48 Stunden nach Ende des Ereignisses langsam wieder zur Normalität zurückkehrte. Im Durchschnitt nahm die NK-Zellzahl 1,5 Stunden nach dem Training ab, kehrte aber nach 24 Stunden auf ein nahezu normales Niveau zurück.

Nach der Berechnung der Zellzahl wurde die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen sofort wie gerade gezeigt analysiert, mit einer durchschnittlichen Abnahme der Zytotoxizität der NK-Zellen sofort und 1,5 Stunden nach Beendigung des Trainingsereignisses, die 24 Stunden nach dem Training signifikant anstieg. Die NK-Zytotoxizität blieb im Vergleich zu den Werten vor dem Training hoch, wenn auch nicht signifikant. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Anzahl der NK-Zellen und die zytotoxische Aktivität aus menschlichen Blutproben auf reproduzierbare hydropische Weise erhalten und charakterisieren können.