Name: 3D-Drucktechnologie Verwendung MRI mit Histologie fusionieren: Ein Protokoll für Hirn Sectioning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie MRT-Bilder präzise mit Histologie-Schnitten ausrichten können. Dieses Protokoll nutzt 3D-gedruckte Gehirnhalter und Schneideboxen für exakte radiologisch-histopathologische Korrelationen.

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Das Intramurale Forschungsprogramm von NINDS unterstützte diese Studie. Wir danken der NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. Wir danken Jennifer Lefeuvre und Cecil Chern-Chyi Yen für ihre Unterstützung bei der postmortalen MRT-Akquisition. Wir danken John Ostuni und der Section on Instrumentation Core Facility für die Unterstützung beim 3D-Druck. In Abbildung 1 dieser Arbeit wurden Schnappschüsse aus MeshLab verwendet, einem Tool, das mit Unterstützung des Projekts 3D-CoForm entwickelt wurde.

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<li>Gaitán, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivenular+brain+lesions+in+a+primate+multiple+sclerosis+model+at+7-tesla+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging.</a> Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das Protokoll hier skizzierte ermöglicht einen genauen Vergleich zwischen MRT und Histologie Abschnitte. Das Protokoll wird in einem einheitlichen Format dargestellt, das Gehirn von Menschen oder Kleintieren, wie Nagetieren oder marmosets angewendet werden kann. Bedingte Unterschiede zu groß (Mensch) und kleine (nicht-menschlichen Primaten und Nagetieren) Gehirne markiert sind, und im zugehörigen Video und Figuren zeigen wir die Anwendung in der Seidenäffchen. Obwohl das Konzept einfach ist, erfordert das Verfahren viele Schritte, sowie die Verwendung von mehreren Arten von Software. Darüber hinaus möglicherweise einige Probleme für die Richtigkeit dieser Methode beeinflussen, sind wichtig, zu erwähnen. Die Bildqualität der in vivo MRI ist ein wichtiger Faktor. Zur Minimierung sollten die Unterschiede in der Bildauflösung zwischen MRI und digitalisierter Histologie Bilder, die kleinste mögliche MRI Voxelgröße verwendet werden. Dieses Konzept gilt auch für die Bildqualität des postmortalen MRI. Während die erhöhteAkquisitionszeit in Obduktion MRT erlaubt viel höhere Bildauflösung, kann das Präparat Bildartefakte einführen, wie fokale Signalausfälle im Zusammenhang mit Luftblasen. Diese Artefakte können Bereiche des Gewebes verdunkeln sowie dessen Kontur beeinflussen. Außerdem sind die Dimensionen des Gewebes auf der postmortalen MRI wahrscheinlich durch die Fixierungsprozess und der Dauer beeinflusst. Während die in vivo zu ex vivo kann MRI Spiel eng durch die Verwendung von anatomischen Landmarken in Schichtgeometrie Setup während der Erfassung angenähert werden, eine nichtlineare Registrierung wäre immer noch notwendig sein , ein höheres Maß an Genauigkeit zu erreichen in diesen beiden MRT - Bilder passen. Das Design des Gehirns Halters und Slicer ist auch ein entscheidender Schritt. Beim Erzeugen des digitalen Modells des Gehirns wird ein Glättungsalgorithmus angewendet, daß das Modell relativ zur festen Gehirn leicht vergrößert. Dies ermöglicht ein leichtes Einführen des Gehirns in die Halterung und Slicer und reduziert scharfe Kanten im Halter &amp;# 39; s Kontur. Wenn jedoch das Modell zu groß ist (beispielsweise um mehr als 5%), kann das Gehirn während der postmortalen MRI und / oder der Schnitt bewegen. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Gestaltung des Gehirns Modell anzupassen, so dass das Cerebellum richtig in die 3D-gedruckten Objekt platziert wird. Dies kann besonders schwierig sein, wenn das Kleinhirn hat während des Gehirns Extraktion bei der Autopsie beschädigt wurde. Beim Drucken mit dem Gehirn Slicer und Halter, muss die Art der 3D-Drucker auch sorgfältig ausgewählt werden. Einige Multi-Jet-Drucker benötigen Nachbearbeitung unter Verwendung eines Ofens Trägermaterial zu entfernen. Während diese Drucker Objekte erzeugen können, die fusionierten als Deposition Modelling Desktop wasserdicht und relativ haltbarer sind (FDM) Drucker, um die Erwärmung Stützen entfernen Sie die Box leicht verziehen kann, Schaufelzwischenräume zu schaffen, die zum Gehirn Kontur nicht perfekt senkrecht stehen. Das Gehirn sectioning Prozess ist ein weiterer entscheidender Schritt. Vor dem Schneiden the ganze Gehirn in Platten, ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Gehirn dicht im Inneren des Gehirns Slicer sitzt: Es gibt keine Bewegung sein sollte, wenn leichter Druck auf das Gehirn angewendet wird. Dadurch wird es möglich machen, die Blätter durch das Gehirn an den genauen Ort von den Ermittlern festgelegt zu schneiden. Eine kontinuierliche, ausgeglichene Druck sollte auf beide Blatthalter angewendet werden beim Schneiden. In Abhängigkeit von der Schärfe der Messer und die Steifigkeit des Gewebes, eine leichte Querschnittbewegung könnte für die Aufrechterhaltung der flachen Schnittflächen von Vorteil sein. Das Paraffin-Einbettungsprozess kann auch eine Quelle der Fehlausrichtung zwischen den MRT und Histologie sein. Wenn die Gewebeplatte ist nicht flach gegen die Kassette während des Einbettungsprozesses sitzt, gibt es eine Neigung zwischen der Schneidebene des Mikrotoms und der Oberfläche anstelle der Platte sein. Dies wird Schneiden unbrauchbar Abschnitte erfordern eine flache Ebene zu finden, bei dem alle Gewebe ausgesetzt ist. Eine Möglichkeit für die Neigung zu korrigierenwird durch den Winkel der Betrachtungsebene auf dem hochauflösenden isotropen postmortale MRI ändern. Dies ist jedoch nahezu unmöglich, auf die in vivo MRI durchzuführen, die normalerweise mit anisotropen Auflösung (typischerweise dicke koronale Schnitte) erfasst wird. Schließlich kann das Gewebe eine gewisse Deformation während der Periode Formalinfixierung erfahren und Paraffineinbettung (Schrumpfung), sowie bei der Herstellung von Folien (Falten, Risse, Falten). Einige dieser Verformungen kann, indem man die 4-5 &amp; mgr; m Abschnitte in einem Wasserbad korrigiert werden, bevor auf Objektträger übertragen. Andere Verformungen können teilweise durch Ausführen einer verformbaren Bild Koregistrieren der histologischen digitalisierten Bilder auf die postmortale MRT-Bilder gelöst werden. Dennoch ist die Verformungen mit einer sorgfältigen und qualifizierten Praxis minimiert der effektivste Ansatz, um passende MRI Bände Abschnitte Histologie. Abschließend stellte die Methodik hier ermöglicht investigators, um genau die zugrundeliegende Pathologie der MRT-Befunde zu bewerten. Allgemeiner gesagt, ist es ein vielversprechender Ansatz zur Identifizierung und / oder neuartigen Biomarker für MRI Studien validiert, die bestimmte pathologische Prozesse, wie Entzündungen oder Remyelinisierung zielen.

In vivo MRT bietet ein nicht-invasives und sensitives Maß für die Gewebeintegrität auf makroskopischer Ebene. Veränderungen der MRT-Signalintensität, die in vivo beobachtet werden, sind Ergebnismaße in vielen laufenden klinischen Studien. 1 Die Intensitätsänderungen, die im MRT zu sehen sind, können zwar Bereiche von Anomalien im Kontext des gesamten Gehirns identifizieren, sind aber oft nicht spezifisch genug, um pathologische Prozesse zu unterscheiden. Dies gilt insbesondere für dynamische Prozesse, an denen mehrere Pathologien beteiligt sind. Bei der Multiplen Sklerose (MS) oder ihrem Tiermodell überschneiden sich beispielsweise die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), Entzündungen, Ödeme, Myelinabbau, axonale Zerstörung, Gliose und neuronaler Tod. 2, 3 Um die notwendige Spezifität in Bezug auf die zugrunde liegende Pathologie zu erhalten, muss der Kontext berücksichtigt werden, zusammen mit der Kenntnis der Histologie der MRT-identifizierten abnormalen Gewebe.
Allerdings ist selbst in gut kontrollierten Tierversuchen die Abstimmung von Histologie und in vivo MRT aus verschiedenen Gründen grundsätzlich schwierig. Erstens ist der Unterschied in den dimensionalen Skalen zwischen histologischen Schnitten und MRT von mehreren Größenordnungen. 4 Zweitens muss für einen korrekten Vergleich die Ausrichtung der MRT-Schnittebene mit der Schnittebene des Hirngewebes übereinstimmen, wenn sie geschnitten wird. Aufgrund der Form des Gehirns ist es sehr schwierig, gleichbleibend gerade und genaue Schnitte zu machen, wenn das Gehirn auf einer ebenen Fläche sitzt. Drittens schafft die Größe des Gehirns im Verhältnis zu einem potenziell kleinen Interessenbereich (Läsion, Tumor usw.) ein "Nadel im Heuhaufen"-Szenario für den Pathologen, der das Gewebe bearbeitet. Viertens, selbst wenn das Zielgewebe gefunden wird, wird es üblicherweise so verarbeitet, dass eine Assoziation mit den ursprünglichen MRT-Daten praktisch unmöglich ist. Schließlich ist die traditionelle pathologische Schnittung von Hirngewebe oft ungenau und inkonsistent, was den Vergleich zwischen histologischen Schnitten und MRT-Bildern weiter erschwert. 
 Frühere Versuche, diese Herausforderungen zu überwinden, beruhten auf der Verwendung von Verformungsalgorithmen, um die Daten und/oder die Platzierung von Referenzmarkern innerhalb oder um das Gewebe herum als Referenz zu registrieren. 5, 6, 7, 8 Der erste Ansatz erfordert komplexe Rechenmodelle, die aufgrund von Datenformatierungen, Bildgebungsartefakten und Veränderungen, die durch die Gewebeverarbeitung verursacht werden, besonders anfällig für Komplikationen sind. 4 Dagegen eröffnet der letztgenannte Ansatz die Möglichkeit, das Gewebe selbst zu kontaminieren oder anderweitig zu schädigen. 9
Der hier beschriebene Ansatz verbessert den Übergang zwischen den Modalitäten durch den Einsatz der postmortalen MRT, um die Lücke zwischen in vivo MRT und Histologie zu schließen. Die postmortale MRT liefert dreidimensionale (3D) Bilder des Gehirns in höherer Auflösung, als dies in vivo möglich ist, und liefert darüber hinaus die Daten, die für die Erstellung eines morphologisch genauen Modells der Hirnoberfläche erforderlich sind. Dieses digitale Modell kann dann verwendet werden, um eine 3D-gedruckte benutzerdefinierte Halterung für das Gehirn zu erstellen. Bei sorgfältiger Positionierung ermöglicht der Gehirnhalter eine präzise, MRT-orientierte Hirnschnittbildung, wodurch der Bedarf an komplexen mathematischen Algorithmen reduziert wird, und die Fokussierung auf bestimmte Regionen für eine gezielte Probenentnahme ermöglicht wird. 
Unser Labor hat kürzlich neue Methoden zur Erstellung von individuellen Gehirnhaltern und -schneidern unter Verwendung von postmortaler MRT- und 3D-Drucktechnologie für menschliche10- und Weißbüschelaffen-Gehirne eingeführt. 4 Die beiden Methoden ermöglichen eine genauere Korrelation zwischen MRT und Histologie in einem Forschungsumfeld und ermöglichen letztendlich ein tieferes Verständnis der spezifischen Pathologie, die MRT-Anomalien zugrunde liegt. Sorgfältig konzipierte Experimente, bei denen das Gehirn im Laufe der Zeit wiederholt in vivo entnommen wird, können einen Kontext für die Interpretation der Pathologie liefern, was wiederum die Spezifität der Interpretation der MRT erhöhen kann. Hier stellen wir ein modifiziertes Protokoll in einem einheitlichen Rahmen vor, das auf jedes Hirngewebe angewendet werden kann, unabhängig davon, ob es von nichtmenschlichen Primaten, Nagetieren oder Menschen stammt. Wir stellen eine detaillierte Anleitung und ein entsprechendes Video für die Weißbüschelaffen-Sektion zur Verfügung. Obwohl das Gesamtprotokoll für jeden Gehirntyp gilt, gibt es aufgrund von Unterschieden in der MRT-Erfassung und der Gewebegröße sowie der Herausforderungen, die beim Umgang mit bestimmten Gehirntypen auftreten, je nach Art des zu verarbeitenden Gehirns einige Unterschiede im Ansatz. In dieser Präsentation werden Abschnitte mit dem Zusatz "Mensch" Unterschiede im Protokoll bezeichnen, die für das menschliche Gehirn spezifisch sind.

<table><tbody><tr><td>7T/30cm USR AVIII Bruker MRT</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>38 mm Bruker Biospin Volumenspirale</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fomblin</td><td>Solvay Solexis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril</td><td>Corning</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mullschwämme</td><td>Fisher Scientrific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Allzweck-Laborfilm</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica RM2235 Rotationsmikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Einwegklingen, flaches Profil (819)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresylviolettacetat, 0,1 % wässrige</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 26089-01</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue, 0,1 % in 95 % Alkohol</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>26056-15</td><td></td></tr><tr><td>ETOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2 Extended&nbsp;</td><td>Ultimaker.75</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kg Offizielles Ultimaker-Marken-PLA&nbsp; Filament, 2.85 mm, Silber Metallic</td><td>Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 (Blue Edition)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Netfabb Professional 5.0.1</td><td>Netfabb</td><td>http://www.netfabb.com/professional.php</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer 10.9.332</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/download.html</td><td></td></tr><tr><td>Mipav 7.2</td><td>NIH CIT</td><td>http://mipav.cit.nih.edu</td><td></td></tr><tr><td>Cura</td><td>Ultimaker</td><td>https://ultimaker.com/en/products/cura-software</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-drucktechnologie verwendung mri mit histologie fusionieren: ein protokoll für hirn sectioning

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Die Magnetresonanztomographie (MRT) ermöglicht die Abgrenzung zwischen normalem und abnormalem Gewebe auf makroskopischer Skala, indem ein ganzes Gewebevolumen dreidimensional abgetastet wird. Während die MRT ein äußerst empfindliches Instrument zur Erkennung von Gewebeanomalien ist, ist die Assoziation von Signalveränderungen mit einem zugrunde liegenden pathologischen Prozess in der Regel nicht einfach. Im Zentralnervensystem zum Beispiel können Entzündungen, Demyelinisierung, axonale Schäden, Gliose und neuronaler Tod zu ähnlichen Befunden in der MRT führen. Daher hängt die Interpretation von MRT-Scans vom Kontext ab, und daher ist die radiologisch-histopathologische Korrelation von größter Bedeutung. Leider ist die traditionelle pathologische Schnittung von Hirngewebe oft ungenau und inkonsistent, was den Vergleich zwischen histologischen Schnitten und MRT erschwert. In diesem Artikel wird eine neuartige Methodik vorgestellt, mit der das Hirngewebe von Primaten genau geschnitten werden kann und somit eine präzise Abstimmung zwischen Histologie und MRT möglich ist. Das in diesem Artikel beschriebene detaillierte Protokoll wird den Forschern bei der Anwendung dieser Methode helfen, die auf der Erstellung von 3D-gedruckten Gehirnschneidemaschinen beruht. Leicht modifiziert kann es leicht für Gehirne anderer Spezies, einschließlich des Menschen, implementiert werden.

Der Arbeitsablauf dieses Verfahrens ist in Figur 1 zusammengefaßt Sobald das Gehirn in Scheiben geschnitten wird, wird ein visueller Vergleich zwischen den MR-Bildern und Bildern der oberflächlichen Oberflächen der Brammen zeigt eine gute Orientierungsspiel über mehrere Platten (Abbildung 2). Nachdem die Platten in Paraffin eingebettet sind, werden sie auf einem Mikrotom und gefärbt geschnitten. Eine gründlichere Vergleich zwischen der hochauflösenden MRT Obduktion und den gefärbten Histologieschnitten zeigt eine genaue und konsistente Übereinstimmung über alle Strukturen des Seidenäffchen Gehirns (Abbildung 3). In diesem Tiermodell der MS, entwickeln die Tiere Läsionen der weißen Substanz in der gesamten weißen Hirnsubstanz zu verbreiten. Diese Läsionen können nichtinvasiv erfasst werden durch MRI durchgeführt wird. Figur 4 zeigt die Fähigkeit dieser Technik, um die pathologischen Substrat der MRT aufzuklären. Kleine Läsionen in vivo MRI nachgewiesen kannsowohl postmortalen MRT und Histologie werden verfolgt. Wie in den Einschüben gezeigt, ist Demyelinisierung innerhalb der Läsionen eine der Hauptkomponenten des MR-Signaländerung (hyperintenser im Vergleich zu umliegenden Gewebe) zu fahren. Die Histologie und postmortalen MRT kann auch Läsionen zeigen verpasste in vivo MRI (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig1.jpg" /> Abbildung 1. Arbeitsablauf für ein Seidenäffchen Gehirn Slicer Feld zu schaffen. Das Gehirn ist mit Formalin (A1) befestigt und ein T2-gewichteten MRT mit isotropen Voxel von 150 &amp; mgr; m pro Kante (A2) erworben. Bilder werden verarbeitet und Schwellwertbildung eine binäre Maske (A3) zu erstellen. Die Oberfläche wird dann in 3D-Modellierungssoftware (A4) wiedergegeben. Eine Boolesche Subtraktion zwischen einem Slicer-Vorlage und dem Gehirn-Modell erstellt ein digitales Modell des Gehirns Slicer (B1). Das Gehirn Slicer-Box ist auf einem 3D-Drucker (B2) gedruckt. Das Gehirn ist dann fest in der Slicer Kasten gelegt fürSchneiden (B3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig2.jpg" /> Abbildung 2. Von links nach rechts: In - vivo - MRT, MRI postmortalen und Gewebeplatte Fotografie. Schnittebenen wurden auf der Grundlage der postmortalen MRI (B) festgelegt und visuell im Vergleich zu den entsprechenden in vivo MRI slice (A). Das Gehirn wurde dann geschnitten, und die resultierenden Platten gefunden wurden konsistent (C) zu sein. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig3.jpg" /> Abbildung 3. Hochauflösende Obduktion MRT und HistologieAbschnitt Anpassung. Brammen wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten mit einem Mikrotom in 4 um Abschnitte, und gefärbt mit schnell blau und Kresylviolett (B). Die Schnitte wurden dann visuell mit dem 100 &amp; mgr; m abgestimmt T2 * -gewichteten MRI basiert auf Hirnstrukturen (A). Details zum Erwerb dieses Bild sind in dem zusätzlichen Abschnitt des Protokolls und Tabelle 1. Hirnstrukturen: (1) roter Pfeil = innere Kapsel, blauer Pfeil = Commissura anterior; (2) roter Pfeil = Putamen, blauer Pfeil = Tractus; (3) roter Pfeil = Nucleus caudatus, blauer Pfeil = Hippocampus; (4) roter Pfeil = Corpus callosum, blauer Pfeil = zerebrale Aquädukt; (5) roter Pfeil = Colliculus inferior, blauer Pfeil = Pyramidenbahn. Die gestrichelten Kasten in B1 zeigt eine Scheibe, wo, entweder während der Hirnschneiden oder Paraffineinbettung, ein Fehler eine leichte Drehung um die Y-Achse verursacht wird, auf der linken Seite Mismatch der anterioren Kommissur führt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier anzuschauen</a>Größere Version der Figur. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig4.jpg" /> Abbildung 4. Läsionen von in - vivo - MRT Histologie Abschnitt der Spur. Die in - vivo - MRT zeigte keine überzeugenden Hinweise auf eine anomale hyperintenser Signal Läsionen in beiden Tractus (A1) vorzuschlagen. Allerdings zeigt die hochauflösende Obduktion MRI klar hyper intensive Linien in beiden Optik Bahnen (A2). Die schnelle blau / Kresylviolett Fleck eines 4 um Histologie Abschnitt zeigt , dass die hyperintensen Bereiche auf der Ex - vivo - MRT zu sehen sind demyelinierten (A3). In der weißen Hirnsubstanz, zeigt die in vivo MRI subtile hyperintenser bilateral (B1, vergrößerte in den Einsätzen). Die hyperintensen Bereiche sind offensichtlich auf dem hochauflösenden Obduktion MRI (B2). Der LFB Fleck eines 4 um Histologie Abschnitt zeigt, dass diese Bereiche (B3) sind demyelinierten. Nach dem Vergleich mit dem Ausgangswert in vivo MRI und Hämotoxylin-and-Eosin - Färbung wurde die rechte Seite bestimmt eine anatomische Anomalie zu sein, nicht ein demyelinisierten Läsion. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Supplemental-Code-Dateien" src="/files/ftp_upload/54780/54780supplementalfiles.jpg" /> Zusätzliche Codedateien. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Brain_Slicer_Parts_Human.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Human.stl" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Human.stl" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Cap_Insert.stl: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Cap_Insert.stl" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Cap_Insert.stl" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, genau zu der Magnetresonanztomographie (MRT) Bildvolumen mit Histologieschnitten über die Erstellung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Gehirn Halter und Slicer Boxen ausrichten.

3D-Drucktechnologie Verwendung MRI mit Histologie fusionieren: Ein Protokoll für Hirn Sectioning

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, MRT-Bilddatensätze präzise mit Histologieschnitten durch die Herstellung maßgeschneiderter, 3D-gedruckter Gehäuse und Schneideboxen für das Gehirn zu registrieren. Obwohl sich dieses Video auf aus Marmosetengehirnen entnommenes Gewebe konzentriert, kann dieses Protokoll auf jedes Gehirn angewandt werden, unabhängig davon, ob es von einem Nagetier, einem nichtmenschlichen Primaten oder einem Menschen stammt. Bereiten Sie einen Arbeitsplatz gemäß der Beschreibung im Protokoll vor.Füllen Sie das Reagenzglas mit Fomblin und Gazetupfer bis zur 20-Milliliter-Marke. Drücken Sie die Gazetupfer zusammen, um unterwegs Luftblasen zu entfernen. Trocknen Sie das Gehirn vorsichtig vom Formalin ab.Danach das Gehirn mit der Vorderseite nach unten in die Röhre einsetzen. Das Gehirn vorsichtig mit Gazetüchern an den Seiten fixieren, um seine Position in der Röhre zu sichern. Den verbleibenden Raum in der Röhre mit Gazetüchern und Fomblin auffüllen.Entfernen Sie sorgfältig Luftblasen während des Vorgangs. Danach verschließen Sie die Kappe und versiegeln das Gefäß mit Paraffin. Kennzeichnen Sie die Kappe und markieren Sie die Linie entlang des Interhemisphärenspalts.Wickeln Sie das Gefäß dann in ein Papierhandtuch ein und führen Sie es mit der Markierung in der oberen Mittelposition in die Spule ein. Führen Sie die Spule in den MRT-Scanner ein. Nach der Aufnahme und der Nachbearbeitung erhalten wir ein T2-gewichtetes Bild, das wir zur Erstellung eines digitalen Modells des Gehirns verwenden können.Öffnen Sie die MRT in koronarer Ausrichtung. Verwenden Sie anschließend die Transformationswerkzeuge, um das Bild auf 1 Millimeter isotrope Voxel neu zu interpolieren. Wenden Sie danach einen nichtlinearen Rauschreduktionsfilter an.Wählen Sie die Look-up-Tabelle für die Anzeige aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Doppelschwelle. Ziehen Sie den Schieberegler auf dem Graphen, um das gesamte Gehirn abzudecken.Erstellen Sie eine binäre Gehirnmaske mithilfe des Segmentierungsalgorithmus Schwellenwert mit Min/Max. Geben Sie den Wert, der sich in der unteren linken Ecke des Intensitätsdiagramms direkt unterhalb der Skala befindet, in das Feld Untere Grenze ein. Wählen Sie anschließend Binär und deaktivieren Sie die Option Schwellenwert invertieren.Wählen Sie den morphologischen Algorithmus „Löcher füllen“. Aktivieren Sie die Option „In 2,5D verarbeiten“. Um die Lücke zwischen dem Kleinhirn und der Großhirnrinde zu füllen, wählen Sie die Linien-VOI.Zeichnen Sie eine Verbindung zwischen dem Kleinhirn und der Großhirnrinde auf beiden Seiten des Gehirns am am stärksten lateralen Punkt ein. Setzen Sie das Zeichnen von VOI-Verbindungen durch das Gehirn fort. Konvertieren Sie die VOIs in eine binäre Maske.Verwenden Sie den Bildrechner, um die VOI- und die binäre Gehirnmaske durch Auswahl der ODER-Operation zu kombinieren. Wählen Sie „Zielbildtyp erweitern“. Wählen Sie nun den morphologischen Algorithmus „Löcher füllen“.Und überprüfen Sie den Prozess in 2,5D. Wählen Sie den Algorithmus „Oberfläche extrahieren“, wählen Sie „Maskenbild“, geben Sie einen Namen ein und wählen Sie dann den Dateityp ply. Die Lücken im Ausschnittfeld, die der Position der Schnittebene entsprechen, können ausgehend von der Vorderseite des Gehirns, der Rückseite des Gehirns oder relativ zu einem interessierenden Bereich, wie hier den Läsionen in der weißen Substanz, platziert werden.Verwenden Sie das Box-VOI, um einen Rahmen um das Gehirn zu zeichnen. Kopieren und fügen Sie den Rahmen auf die Anzahl der MRT-Schnitte entsprechend der vorgesehenen Plattenabstanddicke ein. Gehen Sie dann um die Anzahl der MRT-Schnitte pro Abschnitt weiter und setzen den Rahmen wie zuvor zusammen, um einen weiteren Plattenabstand zu erzeugen.Wiederholen Sie diesen Vorgang durch das Gehirn hindurch. Invertieren Sie die VOIs des Kastens zu einer binären Maske. Anschließend extrahieren Sie die Oberfläche mithilfe der Funktion „Oberfläche extrahieren“, wie zuvor für das Gehirn durchgeführt.Wählen Sie die binäre Maske des Klingenspalts aus. Verwenden Sie die Bildmathematik, um sie mit 10.000 zu multiplizieren. Verwenden Sie dann den Bildrechner, um die multiplizierte binäre Maske zum resampelten isotropen MRT-Bild hinzuzufügen.Nun kann durch die Auswahl der triplanaren Ansicht eine MRT-Blade-Karte, die die Schnittlage im Gehirn zeigt, in drei orthogonalen Ansichten gesehen werden. Wählen Sie in Netfabb Professional „Teil hinzufügen“ und anschließend das Blade-Gap-Modell sowie die Brain-Model-Plys aus.Wählen Sie das Gehirnmodell aus und klicken Sie auf den Reparaturmodus. Verwenden Sie die Schaltauswahl-Schaltfläche, um das Gehirn auszuwählen. Wechseln Sie dann zur Auswahl der anderen Schalen und löschen Sie diese.Danach die Reparatur durchführen und das alte Teil entfernen. Bei ausgewähltem Gehirn „Verschieben“ auswählen. Auf den Ursprung klicken und die Parameter in den Feldern X, Y und Z aufzeichnen.Sie sind erforderlich, um die Spaltbreite der Klinge zu gewährleisten. Klicken Sie auf Übersetzen und schließen Sie das Fenster.Wählen Sie das Blade-Gap-Modell aus und übersetzen Sie es mithilfe der aus dem vorherigen Schritt aufgezeichneten Parameter. Wählen Sie das Brain-Modell aus und klicken Sie auf Reparaturmodus. Verwenden Sie die Schalenauswahl-Schaltfläche, um das Gehirn auszuwählen.Danach wählen Sie „Glatte Dreiecke“. Geben Sie vier als Anzahl der Iterationen ein und aktivieren Sie „Schrumpfen des Volumens verhindern“.Wählen Sie „Dreiecke reduzieren“ aus und geben Sie im Feld „Zielanzahl Dreiecke“ den Wert 200000 ein. Wählen Sie anschließend „Automatische Reparatur“ und führen Sie eine Standardreparatur durch. Wenden Sie die Reparatur an.Exportieren Sie anschließend das geglättete Gehirnmodell als STL-Datei. Importieren Sie das geglättete Gehirnmodell in Meshmixer. Nutzen Sie die Skulpturwerkzeuge, um die Bereiche entlang der linienförmigen VOIs zu glätten.Und beheben Sie alle weiteren geringfügigen Fehler am Modell. Importieren Sie das geglättete, bearbeitete Gehirnmodell in Netfabb Professional. Fügen Sie anschließend das Bauteil, Gehirnschneider-Bauteile Marmoset, hinzu.Wählen Sie Schalen zu Teilen. Benennen Sie anschließend jeden Teil wie im Protokoll beschrieben um. Nutzen Sie die im Protokoll beschriebenen Auswahleinstellungen, klicken und ziehen Sie die Teile, um das Gehirn in der Mitte des Feldes zu positionieren.Klicken und ziehen Sie die Teile, um die Tiefe des Gehirns in der Box anzupassen. Wählen Sie das geglättete, bearbeitete Gehirnmodell im ausgeschnittenen Box-Modell und wählen Sie boolesche Operation. Klicken Sie auf das Gehirnmodell, um es rot einzufärben.Und boolesche Subtraktion auswählen. Die Berechnungen anwenden. Das Kästchen für Überhänge markieren, die verhindern würden, dass das Gehirn korrekt platziert wird.Verweisen Sie auf den ergänzenden Abschnitt des Protokolls für eine Methode, um sie zu entfernen. Wählen Sie das Klingenspaltmodell aus und klicken Sie auf Verschieben. Notieren Sie die Z-Position. Dies wird die Position der hintersten Klingenspalte sein. Schließen Sie dann das Fenster. Wählen Sie das Klingenteil aus den Teilen des Gehirnschneiders aus und klicken Sie auf Verschieben.Geben Sie den Z-Wert aus dem vorherigen Schritt ein. Geben Sie außerdem die aktuellen X- und Y-Werte der Position ein. Wählen Sie absolute Translation und führen Sie die Translation durch.Klicken Sie auf Duplizieren. Wenn die Schnittdicke konstant ist, wie hier gezeigt, geben Sie die Gesamtanzahl der Klingen sowie die Gesamtanzahl und die Z-Anzahl ein, und tragen Sie die Schnittdicke in das Feld Z-Abstand ein. Wählen Sie dann Duplizieren aus.Wählen Sie den Mikrotomklingen-Teil aus den Bestandteilen des Gehirnschneiders aus. Wiederholen Sie die gleichen Schritte zum Verschieben und Duplizieren, die bereits mit dem Klingen-Teil durchgeführt wurden. Wählen Sie alle Mikrotomklingen und den Hauptklingenhalter aus und klicken Sie auf die boolesche Operation.Wählen Sie alle Mikrotomklingen aus, um sie rot zu färben, und klicken Sie auf boolesche Subtraktion. Anschließend führen Sie die Berechnungen durch. Betreten Sie den Reparaturmodus und wählen Sie „Automatische Reparatur“.Führen Sie eine erweiterte Reparatur durch und wenden Sie diese an. Exportieren Sie den Blattträger als STL. Wählen Sie alle Blätter, die Haupt- und Nebenboxen sowie das geglättete, bearbeitete Brain-Modell aus, und klicken Sie auf die boolesche Operation.Verwenden Sie das Fenster „Teile auswählen“, um alle Teile mit Ausnahme der Hauptbox rot einzufärben. Wählen Sie dann die boolesche Subtraktion aus. Führen Sie die Berechnungen durch.Wechseln Sie in den Reparaturmodus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für scharfe Kanten, die das Gehirn verletzen könnten. Diese können im Netfabb-Reparaturmodus oder mithilfe der Skulpturwerkzeuge in Meshmixer repariert werden.Danach Automatische Reparatur auswählen. Eine erweiterte Reparatur durchführen. Anschließend die Reparatur anwenden.Exportieren Sie die Gehirnbox als STL. Wählen Sie in Cura „Laden“ und importieren Sie die Gehirnbox. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Drehen“.Klicken Sie dann und ziehen Sie, um die Box flach zu legen. Bearbeiten Sie die Druckeinstellungen, wie im Protokoll gezeigt. Speichern Sie anschließend den Werkzeugpfad.Führen Sie denselben Vorgang für den Klingelhalter durch und duplizieren Sie das Objekt ebenfalls. Speichern Sie anschließend den Werkzeugweg. Nachdem eine dünne Schicht Klebstoff auf die Druckplatte aufgetragen wurde, drucken Sie die Gehirnbox und die Klingenhalter mit dem 3D-Drucker unter Verwendung der im Protokoll beschriebenen Einstellungen. Nachdem der Druck abgeschlossen ist, kann das Gehirn zum Schneiden vorbereitet werden. Richten Sie eine Arbeitsstation wie in dem Protokoll beschrieben ein. Positionieren Sie das Gehirn vorsichtig in der Box und stellen Sie sicher, dass es fest sitzt.Platzieren Sie die Mikrotomklingen im Klingenhalter in die entsprechenden Aussparungen der Box. Unter Verwendung von Schutzhandschuhen drücken Sie die Klingenhalter fest nach unten. Üben Sie langsam und gleichmäßig Druck aus, um das Gehirn zu schneiden.Entfernen Sie die Scheiben nacheinander, beginnend von der Vorderseite des Gehirns. Obwohl dieser Ansatz einfach ist, erfordert die Methode zahlreiche Schritte sowie die Verwendung mehrerer Softwaretypen, und die Untersucher sollten sich vor Beginn des Verfahrens mit den Benutzeroberflächen vertraut machen. Dieser Arbeitsablauf fasst das Protokoll zur Herstellung der Marmoset-Gehirnschneidevorrichtung zusammen.Das Gehirn wird mit Formalin fixiert und eine T2-gewichtete MRT-Aufnahme mit 150 Mikrometer Auflösung angefertigt. Die Bilder werden verarbeitet und schwellenwertbasiert maskiert, um eine binäre Maske zu erzeugen. Die Oberfläche wird anschließend in einer 3D-Modellierungssoftware dargestellt.Ein boolescher Subtraktionsvorgang zwischen einer Schablonenvorlage und dem Gehirnmodell erzeugt das digitale Modell des Gehirnschneiders. Die Gehirnschneiderbox wird anschließend auf einem 3D-Drucker ausgedruckt. Danach wird das Gehirn fest in der Schneidebox zur Durchtrennung platziert.Nachdem das Gehirn geschnitten wurde, zeigt ein visueller Vergleich zwischen den In-vivo- und den postmortalen MRT-Bildern sowie den Aufnahmen der Oberflächen der Schnittblöcke eine gute Übereinstimmung der Orientierung über mehrere Blöcke hinweg. Ein gründlicherer Vergleich zwischen den hochauflösenden postmortalen MRT-Bildern und den LFB-CV-gefärbten histologischen Schnitten aus mehreren Gehirnblöcken zeigt eine genaue und konsistente Übereinstimmung über alle Strukturen des Marmosett-Gehirns hinweg. In diesem Tiermodell der Multiplen Sklerose entwickeln die Tiere weiße Materie-Läsionen, die sich über das gesamte Gehirn verteilen.Mithilfe dieser Technik können kleine Läsionen, die bei der In-vivo-MRT erkannt wurden, sowohl in der postmortalen MRT als auch in den histologischen Schnitten verfolgt werden. Die Histologie und die postmortale MRT können zudem Läsionen aufdecken, die bei der In-vivo-MRT übersehen wurden. Hier zeigte die In-vivo-MRT keine überzeugenden Hinweise auf normale, hyperintense Signale, die auf Läsionen in einem der beiden Sehbahnen hindeuten würden.Trotzdem wurden in der postmortalen MRT Hyperintensitätszeichen im Sehnervtrakt beobachtet. Und diese Bereiche entsprachen direkt den myelinisierten Läsionen, die im LFB-CV-Histologiepräparat zu sehen waren. Zusammenfassend lässt sich daher sagen, dass die hier vorgestellte Methodik es Untersuchern ermöglicht, die der MRT-Befunde zugrunde liegende Pathologie genau zu bewerten.Wir halten dies für einen aussichtsreichen Ansatz zur Identifizierung neuartiger Biomarker für Erkrankungen des Gehirns sowie für spezifische pathologische Prozesse wie Entzündungen und Remyelinisierung.

utilizing-3d-printing-technology-to-merge-mri-with-histology-protocol

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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