3D-Drucktechnologie Verwendung MRI mit Histologie fusionieren: Ein Protokoll für Hirn Sectioning

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, MRT-Bilddatensätze präzise mit Histologieschnitten durch die Herstellung maßgeschneiderter, 3D-gedruckter Gehäuse und Schneideboxen für das Gehirn zu registrieren. Obwohl sich dieses Video auf aus Marmosetengehirnen entnommenes Gewebe konzentriert, kann dieses Protokoll auf jedes Gehirn angewandt werden, unabhängig davon, ob es von einem Nagetier, einem nichtmenschlichen Primaten oder einem Menschen stammt. Bereiten Sie einen Arbeitsplatz gemäß der Beschreibung im Protokoll vor.

Füllen Sie das Reagenzglas mit Fomblin und Gazetupfer bis zur 20-Milliliter-Marke. Drücken Sie die Gazetupfer zusammen, um unterwegs Luftblasen zu entfernen. Trocknen Sie das Gehirn vorsichtig vom Formalin ab.

Danach das Gehirn mit der Vorderseite nach unten in die Röhre einsetzen. Das Gehirn vorsichtig mit Gazetüchern an den Seiten fixieren, um seine Position in der Röhre zu sichern. Den verbleibenden Raum in der Röhre mit Gazetüchern und Fomblin auffüllen.

Entfernen Sie sorgfältig Luftblasen während des Vorgangs. Danach verschließen Sie die Kappe und versiegeln das Gefäß mit Paraffin. Kennzeichnen Sie die Kappe und markieren Sie die Linie entlang des Interhemisphärenspalts.

Wickeln Sie das Gefäß dann in ein Papierhandtuch ein und führen Sie es mit der Markierung in der oberen Mittelposition in die Spule ein. Führen Sie die Spule in den MRT-Scanner ein. Nach der Aufnahme und der Nachbearbeitung erhalten wir ein T2-gewichtetes Bild, das wir zur Erstellung eines digitalen Modells des Gehirns verwenden können.

Öffnen Sie die MRT in koronarer Ausrichtung. Verwenden Sie anschließend die Transformationswerkzeuge, um das Bild auf 1 Millimeter isotrope Voxel neu zu interpolieren. Wenden Sie danach einen nichtlinearen Rauschreduktionsfilter an.

Wählen Sie die Look-up-Tabelle für die Anzeige aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Doppelschwelle. Ziehen Sie den Schieberegler auf dem Graphen, um das gesamte Gehirn abzudecken.

Erstellen Sie eine binäre Gehirnmaske mithilfe des Segmentierungsalgorithmus Schwellenwert mit Min/Max. Geben Sie den Wert, der sich in der unteren linken Ecke des Intensitätsdiagramms direkt unterhalb der Skala befindet, in das Feld Untere Grenze ein. Wählen Sie anschließend Binär und deaktivieren Sie die Option Schwellenwert invertieren.

Wählen Sie den morphologischen Algorithmus „Löcher füllen“. Aktivieren Sie die Option „In 2,5D verarbeiten“. Um die Lücke zwischen dem Kleinhirn und der Großhirnrinde zu füllen, wählen Sie die Linien-VOI.

Zeichnen Sie eine Verbindung zwischen dem Kleinhirn und der Großhirnrinde auf beiden Seiten des Gehirns am am stärksten lateralen Punkt ein. Setzen Sie das Zeichnen von VOI-Verbindungen durch das Gehirn fort. Konvertieren Sie die VOIs in eine binäre Maske.

Verwenden Sie den Bildrechner, um die VOI- und die binäre Gehirnmaske durch Auswahl der ODER-Operation zu kombinieren. Wählen Sie „Zielbildtyp erweitern“. Wählen Sie nun den morphologischen Algorithmus „Löcher füllen“.

Und überprüfen Sie den Prozess in 2,5D. Wählen Sie den Algorithmus „Oberfläche extrahieren“, wählen Sie „Maskenbild“, geben Sie einen Namen ein und wählen Sie dann den Dateityp ply. Die Lücken im Ausschnittfeld, die der Position der Schnittebene entsprechen, können ausgehend von der Vorderseite des Gehirns, der Rückseite des Gehirns oder relativ zu einem interessierenden Bereich, wie hier den Läsionen in der weißen Substanz, platziert werden.

Verwenden Sie das Box-VOI, um einen Rahmen um das Gehirn zu zeichnen. Kopieren und fügen Sie den Rahmen auf die Anzahl der MRT-Schnitte entsprechend der vorgesehenen Plattenabstanddicke ein. Gehen Sie dann um die Anzahl der MRT-Schnitte pro Abschnitt weiter und setzen den Rahmen wie zuvor zusammen, um einen weiteren Plattenabstand zu erzeugen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang durch das Gehirn hindurch. Invertieren Sie die VOIs des Kastens zu einer binären Maske. Anschließend extrahieren Sie die Oberfläche mithilfe der Funktion „Oberfläche extrahieren“, wie zuvor für das Gehirn durchgeführt.

Wählen Sie die binäre Maske des Klingenspalts aus. Verwenden Sie die Bildmathematik, um sie mit 10.000 zu multiplizieren. Verwenden Sie dann den Bildrechner, um die multiplizierte binäre Maske zum resampelten isotropen MRT-Bild hinzuzufügen.

Nun kann durch die Auswahl der triplanaren Ansicht eine MRT-Blade-Karte, die die Schnittlage im Gehirn zeigt, in drei orthogonalen Ansichten gesehen werden. Wählen Sie in Netfabb Professional „Teil hinzufügen“ und anschließend das Blade-Gap-Modell sowie die Brain-Model-Plys aus.

Wählen Sie das Gehirnmodell aus und klicken Sie auf den Reparaturmodus. Verwenden Sie die Schaltauswahl-Schaltfläche, um das Gehirn auszuwählen. Wechseln Sie dann zur Auswahl der anderen Schalen und löschen Sie diese.

Danach die Reparatur durchführen und das alte Teil entfernen. Bei ausgewähltem Gehirn „Verschieben“ auswählen. Auf den Ursprung klicken und die Parameter in den Feldern X, Y und Z aufzeichnen.

Sie sind erforderlich, um die Spaltbreite der Klinge zu gewährleisten. Klicken Sie auf Übersetzen und schließen Sie das Fenster.

Wählen Sie das Blade-Gap-Modell aus und übersetzen Sie es mithilfe der aus dem vorherigen Schritt aufgezeichneten Parameter. Wählen Sie das Brain-Modell aus und klicken Sie auf Reparaturmodus. Verwenden Sie die Schalenauswahl-Schaltfläche, um das Gehirn auszuwählen.

Danach wählen Sie „Glatte Dreiecke“. Geben Sie vier als Anzahl der Iterationen ein und aktivieren Sie „Schrumpfen des Volumens verhindern“.

Wählen Sie „Dreiecke reduzieren“ aus und geben Sie im Feld „Zielanzahl Dreiecke“ den Wert 200000 ein. Wählen Sie anschließend „Automatische Reparatur“ und führen Sie eine Standardreparatur durch. Wenden Sie die Reparatur an.

Exportieren Sie anschließend das geglättete Gehirnmodell als STL-Datei. Importieren Sie das geglättete Gehirnmodell in Meshmixer. Nutzen Sie die Skulpturwerkzeuge, um die Bereiche entlang der linienförmigen VOIs zu glätten.

Und beheben Sie alle weiteren geringfügigen Fehler am Modell. Importieren Sie das geglättete, bearbeitete Gehirnmodell in Netfabb Professional. Fügen Sie anschließend das Bauteil, Gehirnschneider-Bauteile Marmoset, hinzu.

Wählen Sie Schalen zu Teilen. Benennen Sie anschließend jeden Teil wie im Protokoll beschrieben um. Nutzen Sie die im Protokoll beschriebenen Auswahleinstellungen, klicken und ziehen Sie die Teile, um das Gehirn in der Mitte des Feldes zu positionieren.

Klicken und ziehen Sie die Teile, um die Tiefe des Gehirns in der Box anzupassen. Wählen Sie das geglättete, bearbeitete Gehirnmodell im ausgeschnittenen Box-Modell und wählen Sie boolesche Operation. Klicken Sie auf das Gehirnmodell, um es rot einzufärben.

Und boolesche Subtraktion auswählen. Die Berechnungen anwenden. Das Kästchen für Überhänge markieren, die verhindern würden, dass das Gehirn korrekt platziert wird.

Verweisen Sie auf den ergänzenden Abschnitt des Protokolls für eine Methode, um sie zu entfernen. Wählen Sie das Klingenspaltmodell aus und klicken Sie auf Verschieben. Notieren Sie die Z-Position.

Dies wird die Position der hintersten Klingenspalte sein. Schließen Sie dann das Fenster. Wählen Sie das Klingenteil aus den Teilen des Gehirnschneiders aus und klicken Sie auf Verschieben.

Geben Sie den Z-Wert aus dem vorherigen Schritt ein. Geben Sie außerdem die aktuellen X- und Y-Werte der Position ein. Wählen Sie absolute Translation und führen Sie die Translation durch.

Klicken Sie auf Duplizieren. Wenn die Schnittdicke konstant ist, wie hier gezeigt, geben Sie die Gesamtanzahl der Klingen sowie die Gesamtanzahl und die Z-Anzahl ein, und tragen Sie die Schnittdicke in das Feld Z-Abstand ein. Wählen Sie dann Duplizieren aus.

Wählen Sie den Mikrotomklingen-Teil aus den Bestandteilen des Gehirnschneiders aus. Wiederholen Sie die gleichen Schritte zum Verschieben und Duplizieren, die bereits mit dem Klingen-Teil durchgeführt wurden. Wählen Sie alle Mikrotomklingen und den Hauptklingenhalter aus und klicken Sie auf die boolesche Operation.

Wählen Sie alle Mikrotomklingen aus, um sie rot zu färben, und klicken Sie auf boolesche Subtraktion. Anschließend führen Sie die Berechnungen durch. Betreten Sie den Reparaturmodus und wählen Sie „Automatische Reparatur“.

Führen Sie eine erweiterte Reparatur durch und wenden Sie diese an. Exportieren Sie den Blattträger als STL. Wählen Sie alle Blätter, die Haupt- und Nebenboxen sowie das geglättete, bearbeitete Brain-Modell aus, und klicken Sie auf die boolesche Operation.

Verwenden Sie das Fenster „Teile auswählen“, um alle Teile mit Ausnahme der Hauptbox rot einzufärben. Wählen Sie dann die boolesche Subtraktion aus. Führen Sie die Berechnungen durch.

Wechseln Sie in den Reparaturmodus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für scharfe Kanten, die das Gehirn verletzen könnten. Diese können im Netfabb-Reparaturmodus oder mithilfe der Skulpturwerkzeuge in Meshmixer repariert werden.

Danach Automatische Reparatur auswählen. Eine erweiterte Reparatur durchführen. Anschließend die Reparatur anwenden.

Exportieren Sie die Gehirnbox als STL. Wählen Sie in Cura „Laden“ und importieren Sie die Gehirnbox. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Drehen“.

Klicken Sie dann und ziehen Sie, um die Box flach zu legen. Bearbeiten Sie die Druckeinstellungen, wie im Protokoll gezeigt. Speichern Sie anschließend den Werkzeugpfad.

Führen Sie denselben Vorgang für den Klingelhalter durch und duplizieren Sie das Objekt ebenfalls. Speichern Sie anschließend den Werkzeugweg. Nachdem eine dünne Schicht Klebstoff auf die Druckplatte aufgetragen wurde, drucken Sie die Gehirnbox und die Klingenhalter mit dem 3D-Drucker unter Verwendung der im Protokoll beschriebenen Einstellungen.

Nachdem der Druck abgeschlossen ist, kann das Gehirn zum Schneiden vorbereitet werden. Richten Sie eine Arbeitsstation wie in dem Protokoll beschrieben ein. Positionieren Sie das Gehirn vorsichtig in der Box und stellen Sie sicher, dass es fest sitzt.

Platzieren Sie die Mikrotomklingen im Klingenhalter in die entsprechenden Aussparungen der Box. Unter Verwendung von Schutzhandschuhen drücken Sie die Klingenhalter fest nach unten. Üben Sie langsam und gleichmäßig Druck aus, um das Gehirn zu schneiden.

Entfernen Sie die Scheiben nacheinander, beginnend von der Vorderseite des Gehirns. Obwohl dieser Ansatz einfach ist, erfordert die Methode zahlreiche Schritte sowie die Verwendung mehrerer Softwaretypen, und die Untersucher sollten sich vor Beginn des Verfahrens mit den Benutzeroberflächen vertraut machen. Dieser Arbeitsablauf fasst das Protokoll zur Herstellung der Marmoset-Gehirnschneidevorrichtung zusammen.

Das Gehirn wird mit Formalin fixiert und eine T2-gewichtete MRT-Aufnahme mit 150 Mikrometer Auflösung angefertigt. Die Bilder werden verarbeitet und schwellenwertbasiert maskiert, um eine binäre Maske zu erzeugen. Die Oberfläche wird anschließend in einer 3D-Modellierungssoftware dargestellt.

Ein boolescher Subtraktionsvorgang zwischen einer Schablonenvorlage und dem Gehirnmodell erzeugt das digitale Modell des Gehirnschneiders. Die Gehirnschneiderbox wird anschließend auf einem 3D-Drucker ausgedruckt. Danach wird das Gehirn fest in der Schneidebox zur Durchtrennung platziert.

Nachdem das Gehirn geschnitten wurde, zeigt ein visueller Vergleich zwischen den In-vivo- und den postmortalen MRT-Bildern sowie den Aufnahmen der Oberflächen der Schnittblöcke eine gute Übereinstimmung der Orientierung über mehrere Blöcke hinweg. Ein gründlicherer Vergleich zwischen den hochauflösenden postmortalen MRT-Bildern und den LFB-CV-gefärbten histologischen Schnitten aus mehreren Gehirnblöcken zeigt eine genaue und konsistente Übereinstimmung über alle Strukturen des Marmosett-Gehirns hinweg. In diesem Tiermodell der Multiplen Sklerose entwickeln die Tiere weiße Materie-Läsionen, die sich über das gesamte Gehirn verteilen.

Mithilfe dieser Technik können kleine Läsionen, die bei der In-vivo-MRT erkannt wurden, sowohl in der postmortalen MRT als auch in den histologischen Schnitten verfolgt werden. Die Histologie und die postmortale MRT können zudem Läsionen aufdecken, die bei der In-vivo-MRT übersehen wurden. Hier zeigte die In-vivo-MRT keine überzeugenden Hinweise auf normale, hyperintense Signale, die auf Läsionen in einem der beiden Sehbahnen hindeuten würden.

Trotzdem wurden in der postmortalen MRT Hyperintensitätszeichen im Sehnervtrakt beobachtet. Und diese Bereiche entsprachen direkt den myelinisierten Läsionen, die im LFB-CV-Histologiepräparat zu sehen waren. Zusammenfassend lässt sich daher sagen, dass die hier vorgestellte Methodik es Untersuchern ermöglicht, die der MRT-Befunde zugrunde liegende Pathologie genau zu bewerten.

Wir halten dies für einen aussichtsreichen Ansatz zur Identifizierung neuartiger Biomarker für Erkrankungen des Gehirns sowie für spezifische pathologische Prozesse wie Entzündungen und Remyelinisierung.