Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Das übergeordnete Ziel dieser Echtzeit-PCR-Testmethode ist es, sowohl DNA- als auch RNA-basierte Krankheitserreger zusammen in einem Hochdurchsatz nachzuweisen. Nukleinsäuren aus klinischen Proben werden mit einem gemeinsamen Primerpool voramplifiziert, auf eine OpenArray-Platte geladen und auf das Vorhandensein von Krankheitserregern analysiert. Diese Methode kann dazu beitragen, die OneHealth-Überwachungsbemühungen für Infektionskrankheiten zu fördern.

Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken ermöglicht diese Methode, mehr Proben auf mehr Ziele zu testen, ohne miteinander zu konkurrieren, wodurch die Testeffizienz verbessert wird. Bei der Methode wird eine maßgeschneiderte nanoskalige PCR-Platte verwendet. Die Primer und Sonden werden auf die Ränder der Durchgangslöcher gedruckt und die Proben werden mit einem Liquid Handler geladen.

Wir werden die Methode an klinischen Proben demonstrieren, die auf ein Panel von Atemwegserregern von Pferden und Hunden getestet werden. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, entwerfen Sie die Platte wie im Textprotokoll beschrieben. Die hier verwendete Platte ist mit 18 Zielen in dreifacher Ausfertigung ausgelegt.

Geben Sie Medien zu den Tupfern und Trachealwaschungen, so dass mindestens ein bis zwei Milliliter Flüssigkeit vorhanden sind. Tupfer und DMEM kräftig im Röhrchen einreiben. Verwenden Sie dann eine Pipette, um etwa 1 Milliliter des Mediums in ein neues Röhrchen zu übertragen.

Geben Sie 235 Mikroliter Lysepuffer und 175 Mikroliter Probe in jedes Bead-Röhrchen. Fahren Sie mit dem Protokoll des Herstellers fort, um die Gesamtnukleinsäure zu extrahieren. Bereiten Sie sich auf die reverse Transkription und die Präamplifikation von Nukleinsäure oder Vorverstärker vor, wie im Textprotokoll beschrieben, indem Sie zunächst die Probenkarte überprüfen.

Geben Sie 8,5 Mikroliter Vorverstärker-Mastermix und 5,5 Mikroliter DNA/RNA-Probe in jede Vertiefung einer Standard-96-Well-Platte, indem Sie nur die linke Seite der Platte verwenden. Nachdem Sie die Samples, Positiv- und Negativkontrollen mit dem Preamp-Mix kombiniert haben, versiegeln Sie die Standard-96-Well-Platte gründlich mit einem durchsichtigen Klebesiegel. Entfernen Sie überschüssige Dichtungen mit einer Rasierklinge, um die Bildung von Dichtungsspalten während des Zyklus zu verhindern.

Zentrifugieren Sie die versiegelte Platte 20 Sekunden lang mit einem PCR-Plattenspinner. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien am Boden der Plattenvertiefungen kombiniert sind. Nachdem Sie einen herkömmlichen Thermocycler eingeschaltet haben, wählen Sie das Vorverstärker-Zyklusprogramm und starten Sie das Programm.

Setzen Sie die 96-Well-Platte erst dann in den Thermocycler ein, wenn der untere Teil des Thermocyclers die für die cDNA-Produktion erforderliche Temperatur erreicht, indem die Temperaturanzeige auf dem Bildschirm überwacht wird. Vergewissern Sie sich nach Abschluss des Vorverstärkerlaufs, dass die Platte dicht geblieben ist. Entfernen Sie nach dem Anziehen von Doppelhandschuhen und Ärmelabdeckungen die Dichtung von der Vorverstärkerplatte.

Entfernen Sie dann vorsichtig die äußeren Handschuhe und entsorgen Sie sie. Verdünnen Sie die Vorverstärkerprodukte eins bis fünf, indem Sie 56 Mikroliter TE-Puffer in jede Vertiefung der Säulen eins bis sechs der 96-Well-Vorverstärkerplatte geben und durch Auf- und Abpipettieren mischen. Gehen Sie dazu nur bis zum ersten Anschlag der Pipette, aspirieren Sie von unten und dosieren Sie weiter oben, aber erzeugen Sie keine Blasen.

Fügen Sie allen sechs Säulen TE-Puffer hinzu, unabhängig von ungenutzten Wells. Bereiten Sie sich auf den 384-Well-Transfer auf die Amplifikationsplatte vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Ziehen Sie nach Abschluss der Vorbereitungsschritte neue, gut sitzende Doppelhandschuhe und Ärmelüberzüge an.

Aufgrund der hohen Verdampfungsraten beim Pipettieren kleiner Volumina ist es wichtig, den Mastermix und die Probe effizient zu dosieren und die Platte sofort zu verschließen. Geben Sie 2,5 Mikroliter Amplifikations-Mastermix auf eine 384-Well-Platte. Weiße Platten werden hier zu Demonstrationszwecken verwendet, aber schwarze Platten sollten verwendet werden, um die Belastung der Augen zu verringern.

Übertragen Sie 2,5 Mikroliter des verdünnten Vorverstärkerprodukts auf die 384-Well-Platte gemäß der Karte im Textprotokoll. Die hier gezeigten farbigen Würfel veranschaulichen den Übertragungsablauf für eine Pipette mit festem Kanal. Decken Sie die Platte sofort fest mit einer Folie ab.

Entsorgen Sie die Außenhandschuhe und Ärmelüberzüge. Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte 20 Sekunden lang im PCR-Plattenspinner. Entfernen Sie nicht die Folienversiegelung, sondern setzen Sie die 384-Well-Platte in den Liquid Handler ein.

Öffnen Sie die Verpackung mit einer ummantelten Amplifikationsplatte und legen Sie sie vorsichtig in den Liquid Handler in den ersten Schlitz mit der Seriennummer auf der rechten Seite, halten Sie das Gehäuse an den Rändern, ohne die Oberfläche der Platte zu berühren. Entfernen Sie die Folienversiegelung von der 384-Well-Platte im Inneren des Liquid Handlers, sobald alles an Ort und Stelle ist. Klicken Sie auf Weiter und aktivieren Sie dann alle Kontrollkästchen, wenn jeder Schritt abgeschlossen ist.

Schließen Sie die Tür zum Liquid Handler und starten Sie sofort den Befüllvorgang. Bleiben Sie neben dem Liquid Handler und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, sobald die Platte gefüllt ist. Entfernen Sie bei laufendem Liquid Handler die Schutzfolie von der Unterseite eines Kofferdeckels.

Lassen Sie die obere Folie an Ort und Stelle. Grundieren Sie das rote Klebeband, indem Sie leicht daran ziehen, um es vom Kleber zu lösen. Nehmen Sie die geladene Amplifikationsplatte aus dem Liquid Handler und legen Sie sie vorsichtig mit der Seriennummer auf der rechten Seite in die Plattenpresse.

Legen Sie den Deckel mit dem gekerbten Ende nach rechts und dem Kleber nach unten auf die Platte. Ziehen Sie den Tellerpresshebel nach unten und schließen Sie ihn vorsichtig, das Licht blinkt 20 Sekunden lang. Berühren Sie die Plattenpresse während dieser Zeit nicht.

Sobald das Licht durchgehend grün leuchtet, heben Sie den Hebel an und entfernen Sie vorsichtig die versiegelte Platte, indem Sie sie an den Rändern festhalten. Halten Sie die versiegelte Amplifikationsplatte senkrecht an den Rändern des Gehäuses, führen Sie die Spritzenspitze sofort in die Ladeöffnung am Ende des Gehäuses ein und geben Sie dann die Immersionsflüssigkeit langsam in einer sanften, kontinuierlichen Bewegung ab, um den Raum zwischen der Platte und dem Deckel zu füllen. Lassen Sie eine kleine Luftblase in der Ecke, sobald die Platte eingetaucht ist.

Während Sie die Platte weiterhin senkrecht an den Rändern halten, verschließen Sie die Ladeöffnung, indem Sie den Stecker in die Öffnung einführen und den Stecker im Uhrzeigersinn drehen, und üben Sie ausreichend Druck aus, bis der Griff abbricht. Reinigen Sie das Gehäuse mit einem fusselfreien Tuch, das gründlich mit Ethanol besprüht wurde. Um das Gehäuse zu trocknen, wischen Sie das Gehäuse mit einem sauberen Tuch nach unten.

Bringen Sie die versiegelte Platte zur Amplifikationsmaschine. Wählen Sie auf der Registerkarte "Instrument" die Option "Instrumentenkonsole" aus. Wählen Sie die Amplifikationsmaschine aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Tür öffnen".

Setzen Sie die Verstärkungsplatte in den ersten Schlitz des Plattenadapters ein und überprüfen Sie, ob der Adapter richtig mit einer Eins in der oberen linken Ecke ausgerichtet ist. Richten Sie die Platte so aus, dass der Barcode nach oben und zur Vorderseite des Geräts zeigt. Nachdem Sie auf die Schaltfläche "Tür schließen" geklickt haben, navigieren Sie zur Registerkarte "Start" am unteren Bildschirmrand.

Wählen Sie im Menü "Ausführen" die Option "OpenArray" aus. Klicken Sie auf Platten-IDs abrufen. Um die Ausführung zu starten, klicken Sie auf Ausführung starten.

Öffnen Sie eine Tabelle mit dem Ergebnismakro. Klicken Sie in der exportierten Datendatei mit der rechten Maustaste auf die Registerkarte am unteren Bildschirmrand und wählen Sie Verschieben oder Kopieren. Wählen Sie im Feld An Buchen die Option Ergebnismakro aus.

Klicken Sie dann auf An Ende verschieben und aktivieren Sie das Kontrollkästchen mit der Bezeichnung Kopie erstellen. Klicken Sie abschließend auf OK. Löschen Sie die alte Registerkarte "Exportieren", und benennen Sie die neu hinzugefügte Registerkarte in "Export" um.

Klicken Sie auf Ansicht und dann auf Makros, wählen Sie Makro aus und klicken Sie dann auf Ausführen. Wiederholen Sie dies als Nächstes für Makro2, indem Sie auf Ansicht und dann auf Makros klicken, Makro2 auswählen und auf Ausführen klicken. Überprüfen Sie in der Software des Amplifikationsgeräts die Kurven für jede Probe und steuern Sie sie gegen die Makrotabelle, indem Sie auf der linken Seite des Bildschirms Analyse-/Amplifikationsdiagramm auswählen.

Wählen Sie dann die Registerkarte "Stichprobe" aus und klicken Sie auf jede Probe, um zu bestätigen, dass für jedes der positiven Ergebnisse in der Tabelle zwei oder drei positive Amplifikationskurven vorhanden sind. Die Fluoreszenzmesswerte werden gegen Amplifikationszyklen aufgetragen, um zu veranschaulichen, dass die Echtzeit-PCR erfolgreich durchgeführt wurde. Die meisten Proben erreichten relative Schwellenwerte zwischen dem zweiten und dem 25. Zyklus der Echtzeit-PCR-Reaktion.

Standardkurven, die an drei verschiedenen Tagen laufen, werden aufgetragen, um die Linearität und den Bereich der Verstärkung mit Hilfe von Positivkontrollen zu demonstrieren. Die Zyklusschwellenwerte werden gegen die logarithmische Basis 10 der Anzahl der Kopien des Nukleinsäurestandards aufgetragen. Die beiden Makros geben die Namen der Stichproben in der ersten Spalte und den Durchschnitt der drei Ct-Werte für jedes Ziel für diejenigen mit positiven Ergebnissen ein.

Ziele, die nicht amplifiziert wurden, werden in dieser Tabelle leer angezeigt. Es werden quantitative Ergebnisse für 10 klinische Proben und vier Routinekontrollen gezeigt, wobei die negative Amplifikationskontrolle für alle Ziele negativ sein sollte und die negative Extraktionskontrolle nur die interne Kontrolle enthalten sollte. Eine Probe in diesem Set weist eine fehlgeschlagene interne Kontrolle auf, was auf das Vorhandensein von Inhibitoren in der Probe hinweist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein nanoskaliges PCR-Experiment durchführt. Dieses Verfahren wird die Durchführung von syndrombasierten Panels in der Veterinärdiagnostik erleichtern. Diese Methode kann so angepasst werden, dass sie Aufsätze über Erreger vieler verschiedener Infektionskrankheiten enthält.