Name: Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Nachweismethode für DNA- und RNA-Pathogenen in Atemwegserkrankungen von Hunden und Pferden mittels nanoskaliger PCR. Diese Technik verbessert die Testeffizienz erheblich und unterstützt OneHealth-Überwachungsmaßnahmen.

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Die Arbeit an respiratorischen Erreger Assays hier beschrieben wurde von der Cornell Animal Health Diagnostic Center interne Entwicklungsfonds unterstützt. Die Entwicklung der nanoskaligen PCR-Workflow und die damit verbundenen Qualitätssicherungssysteme wurde teilweise finanziert (FOA PA-13-244) und in Zusammenarbeit mit der Food and Drug Administration Veterinary Laboratory Investigation and Response Network (FDA Vet-LIRN) unter Grant No 1U18FD005144- ausgeführt 01. Die Gebühren für die Veröffentlichung wurden von VWR und Quanta Biosciences gefördert. Wir danken Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, und Katrina Walker für ihre Unterstützung beim Schreiben und das Protokoll zu überprüfen. Wir danken Mike Carroll, die Autor Interviews für die Dreharbeiten. Wir danken schließlich den Editor und drei anonymen Gutachtern für ihre hilfreichen Kommentare.

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Marcia Slater und Elen Ortenberg sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific Inc., der in diesem Artikel verwendeten Reagenzien und Instrumente produziert.

Dieses Verfahren wurde für die Routineprüfung von respiratorischen Pathogenen in unserem Labor im Laufe von sechs Monaten (2-3 mal pro Woche) verwendet. Wir haben auch Erfolg das gleiche Verfahren für magensaftresistente Erreger Profilierung in Kotproben und bakterielle Isolate auf einem separat angepasst Platte verwenden. Sobald die Platten hergestellt werden, können erfahrene Mitarbeiter Schritte abgeschlossen innerhalb einer Standard Arbeitstag 2-7. Die kritischsten Schritte sind die einwandfreie Abdichtung des Vorverstärkers Platte, wobei die Übertragung von vorverstärkt Proben zwischen den Platten, und die endgültige Überdeckung der Verstärkungsplatte (die schnell Verdampfung durchgeführt werden müssen, um zu verhindern). Verwendung des Makro-Tabelle als Leitfaden für die Ergebnisanalyse (Kurven für Proben und Kontrollen Kontrolle) war ebenfalls wichtig, da sie stark die Menge an Zeit und Papiere für diesen Prozess benötigt reduziert. Die bereitgestellte Makro-Tabelle ist ein Beispiel; es müssten für Platten mit unterschiedlichen Konfigurationen modifiziert oder neu erstellt werden. Dies kann leicht sein performed von jemandem mit grundlegenden Tabellen Wissen. Aufgrund der sehr geringen Menge an Probe geladen auf die Verstärkungsplatte (33 nl) wird Vorverstärkung erforderlich. Bei der Optimierung dieses Protokolls (nicht gezeigt) verglichen wir eine Reihe von Vorverstärkung Parameter einschließlich der Master-Mix, Zugabe von Zufallsprimern, die Anzahl der Zyklen, Glühzeit und Verdünnung vor der Amplifikation. Jedes Ziel hatte seine eigenen optimalen Bedingungen und die hier beschriebenen repräsentieren diejenigen, die die besten Nachweisgrenze insgesamt für unsere Platte ergab. Dieses Panel deckt ein breites Spektrum von pathogenen Ziele und Probentypen, die in der Routine Veterinärdiagnostik angetroffen werden, aber Änderungen an den Vorverstärkung Verfahren können für verschiedene Platten erforderlich sein. Die Hersteller optimierte Amplifikationsbedingungen sind auf einem Standard-Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Protokoll mit einem 10 min bei 95 ° C Enzymaktivierung, gefolgt von einer Denaturierung bei 95 ° C und ann basierendEaling / Extension bei 60 ° C. Die Primer und Sonden sind vorgedruckt auf den Platten auch hersteller optimierten Bedingungen verwenden und benötigen daher keine Titration. die Reverse-Transkription und Vorverstärkung Schritte Kombination für alle Proben (unabhängig von der Art des Ziels) war notwendig, um die Effizienz in der Arbeitsablauf zu halten. alle Proben transkribierten umkehren zu haben, ist auch von Vorteil für die Maximierung der Empfindlichkeit. Weiterhin kann die Verwendung eines Master-Mix für den Vorverstärker, die zur Minimierung Inhibitoren optimiert ermöglicht Vielseitigkeit in verschiedenen Probentypen auf der gleichen Platte verbinden. Das Center for Disease Control (CDC) Influenza - Matrix - Test von Shu et al. 7 und hier für Nano- Maßstab Reaktionen angepasst ist ein universelles Influenza - A - Test, der für die Prüfung Proben von Menschen und Haustieren geeignet ist. Es wurde für den universellen Erfassung des Matrix-Gen aller Influenza-A-Viren mit Mikrolitermaßstab rea entworfenctions. Es wurde auf der ganzen Welt als Teil einer CDC humanen Influenzavirus-Panel und einer CDC Schweinegrippe-Panel verwendet. Der EHV-1 - Test 8 angepasst hier erkennt einen wichtigen respiratorischen Erreger der Pferde , die Abtreibungen und neurologische Krankheit (rezensiert von Pusterla und Hussey 10) verursachen können. Die Bedeutung dieser Tests zu einer Hochdurchsatz-Plattform mit einer Spezies-unabhängige interne Kontrolle der Anpassung ist, dass sie in eine OneHealth Überwachung Ansatz integriert werden können. beide dieser Tests auf einem Hochdurchsatz-Testplattform hat, wird die Notfallplanung für die klinische Einrichtungen, Schutz und Performance-Events erleichtern. Die oben beschriebenen Ergebnisse waren repräsentativ für alle Ziele auf der Platte mit Ausnahme von Mycoplasma Cynos, die in der analytischen Leistung deutlich mehr Variation zeigte. Dies war wahrscheinlich auf die suboptimale Schmelztemperatur (T m) der Primer, die im Idealfall sein sollte 58-60 &amp;# 176; C (die ideale Sonde Tm 68-70 ° C). Eine Einschränkung dieser Plattform ist, dass es länger als die Platten für die Bestellung von einzelnen Sonden, die die Fähigkeit, Sequenzen zu schnell ändern begrenzt zu entwerfen und herzustellen braucht. Eine weitere Einschränkung der Echtzeit-PCR in der Regel ist die Unfähigkeit, neuartige und unerwartete Pathogene zu erkennen. Dies kann durch die Gestaltung Assays zu einem gewissen Grad überwunden werden , die Sequenzen in mehreren Spezies entsprechen, aber unvoreingenommene ganze Genom - Sequenzierung basierte Methoden sind besser geeignet für die Entdeckung von neuen Wirkstoffen. 11,12 Nanoskalige real-time PCR ermöglicht ein neues Paradigma für Syndrom-basierte eher als Spezies-basierte Tests, die für die Reduktionsmittel und Arbeitskosten im Hochdurchsatz-Molekulardiagnostik nützlich ist. Groß Panel Test durch diesen Ansatz kann OneHealth Überwachungs Bemühungen erleichtern, wie jene , die von Dunne und Gurfield 13 und Moutailler et al. 14. Sammlung von Tupferproben früh,Regel innerhalb von 3 Tagen nach dem Auftreten klinischer Symptome, bietet die beste Chance, das Vorhandensein von Atemwegserreger zu identifizieren. Infektionskrankheit Auflaufen ist oft unvorhersehbar, und Tests, die auf verschiedene Arten, ohne die Notwendigkeit einer Änderung der Reagenzien durchgeführt werden können für Bereitschafts- ideal sind. Zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind wahrscheinlich in Pathotypisierung, Antibiotikaresistenz Profilierung zu sein, und weitere Syndrom basierten klinischen Diagnostik-Panels. Nanoskalige real-time PCR ist besonders nützlich für eine schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Mehrfachproben und Erregertypen, und würde durch unvoreingenommene oder teilweise voreingenommen Sequenzierung basierte Ansätze zur Identifizierung neuer und entstehender Erreger ergänzt werden.

Mit der Nachfrage nach schnellen und umfassenden Nachweis von mehreren Agenten in der klinischen Diagnostik für Mensch und Tier, Einzelorganismus molekulardiagnostischen Methoden zur Erregernachweis sind beschwerlich verwendet, es sei denn für eine große Anzahl von Proben für eine einzelne Krankheit getestet. Im Veterinär Zusammenhang sind Hochdurchsatz-Diagnosemethoden besonders wichtig aufgrund der zusätzlichen Bedarf an Pathogenen aus einer Vielzahl von Arten abdecken. OneHealth Ansätze zur Verwaltung von lebensmittelbedingten Erkrankungen und Schwellen Erreger Überwachung Beispiele für Testanforderungen sind, die eine Reihe von Bakterien enthalten, Viren (DNA oder RNA-Basis), Parasiten und Pilze. Die Herausforderung an Tests für mehrere Analyten kombiniert zusammen (Multiplexing), um Testeffizienz zu verbessern, ist ein möglicher Verlust der Empfindlichkeit und eine große Belastung für die Optimierung und Validierung von Assays. Nano- Maßstab real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein alterauf die Praxis der Multiplex nativen , die viele getrennte Reaktionen laufen gleichzeitig auf derselben Probe 1 ermöglicht. Die Openarray - Plattform ist eine Anwendung dieses Prinzips 2; es kombiniert Microarray-Technologie mit Echtzeit-PCR. Basierend auf dem Konzept der räumlichen Multiplexen wird jede Probe für eine Vielzahl von Zielen in getrennten Durchgangslöchern getestet. Diese Plattform wurde zunächst mit Cyanin-basierten doppelsträngigen DNA - Bindungs Chemie 2 und ist jetzt für sondenbasierte Chemie mit dunklen Lösch Sonden 3 verwendet. Diese Plattform hat in den Menschen 4 und Tiere für die genetische Profilierung 5 verwendet in erster Linie sind. Es wurde vor kurzem durch Blut übertragbaren DNA und RNA Pathogenen durch Grigorenko et al zu erfassen. 6 einen zweistufigen Reverse-Transkriptions / Vorverstärkung (Vorverstärker) Verfahren. Wir beschreiben hier ein Ein-Schritt-Vorverstärker-basierte Verfahren für beide Arten von Krankheitserregern in der Atem sec Erkennungretions und eine Vielzahl von anderen Probentypen, die vollständig in einem Standard-Arbeitstag durchgeführt werden kann. Nach Beendigung der Ein-Schritt-Vorverstärker werden Proben auf eine Platte mit 384 Vertiefungen überführt, die das Format durch das automatisierte Flüssigkeitshandhabungssystem angenommen ist, die mit dieser nanoskaligen PCR Plattform kommt. Das System zeichnet die Master-Mix und die Probe über die Oberfläche von bis zu 4 Platten (192 Proben und Kontrollen) zu einer Zeit. Im Anschluss an diese Ladevorgang beschreiben wir, wie Proben verstärkt und analysiert, um eine Makro-Tabelle verwenden, die den Durchschnitt der drei technische Replikate für jede Probe / Ziel-Kombination in einer Tabelle zusammengefasst, die auf einer gedruckten Seite passt. Ein einheitliches Verfahren zur Analyse von extrahierten DNA und / oder RNA aus Proben mit Hilfe dieser Plattform etabliert. Eine große Vielfalt von Proben wurden extrahiert, revers transkribiert und in einer 96-Well-Format-Pre verstärkt, das Potenzial für Fehler zu minimieren. Atemproben getestet enthalten Nasenabstrichen, tiefe Pharynxabstriche,trans-tracheale wäscht, Bronchiallavage und Lungengewebe. Da einige der Agenten im peripheren Blut vorhanden sein können, auch getestet oder Kot, eingebaut wir diese Arten von Proben in das Verfahren. durch eine effiziente Prüfung durch Panel-basierte Erreger und Toxin-Gen Detektion anstelle einzelner Test Diese optimierten Workflow hilft, Zeit und Ressourcen zu sparen im Vergleich zu Experimenten in mehreren Platten ausgeführt wird. Die Atem Panel hier gezeigt hatte 18 Assays in dreifacher Ausfertigung Durchgangslöcher gedruckt jeweils zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Die Pferde-Erreger nachgewiesen enthalten Pferde-Adenovirus 1 und 2, Pferde-Arteriitis - Virus, Pferde-Rhinitis Virus A und B, Pferde - Herpesvirus (EHV) Typen 1 und 4 und Streptococcus equi. Die Hunde-Erreger enthalten Hunde-respiratorischen corona (betacoronavirus), Hundestaupevirus, Hunde - Adenovirus, Hunde-Parainfluenza - Virus, Eckzahn Pneumovirus, Bordetella bronchiseptica und Mycoplasma Cynos. EINuniversellen Influenza-A-Test und eine interne Kontrolle (MS2 RNA-Phagen) wurden ebenfalls enthalten.

<table><tbody><tr><td>Zap-OGlobin II lytisches Reagenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Optionales Reagenz zur Vorbereitung von Blutproben.</td></tr><tr><td>Extraktionskit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>Andere Extraktionskits, die für die gewünschten Probentypen geeignet sind, können ersetzt werden. Dieses Kit wird mit PBS, Lysepuffer und Waschpuffer geliefert.</td></tr><tr><td>2x One-Step RT-qPCR Mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Genspezifischer Primerpool</td><td>IDT</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Kann vom Benutzer generiert oder mit den Amplifikationsplatten erworben werden.</td></tr><tr><td>Random Primer Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Standard 96-Well-Platte</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>Dies kann jede Platte sein, die in die verwendete herkömmliche PCR-Maschine passt.</td></tr><tr><td>Amplifikations-Mastermix (OpenArray-Mastermix)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Klarer Klebeverschluss</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Folienversiegelung</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>384-Well-Platte</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikationsplatte (QuantStudio 12K Flex OpenArray-Platte)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Kann mit allen Assays angepasst werden, die den Standard-TaqMan-Bedingungen entsprechen.</td></tr><tr><td>Zubehörset</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Enthält die Gehäusedeckel, Stopfen und Tauchflüssigkeit.</td></tr><tr><td>AccuFill Spitzen</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikationsmaschine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>Dies wird mit der Amplifikationsmaschine erworben.</td></tr><tr><td>Primer-Design-Software (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>Detaillierte Spezifikationen für Primer und Sonde finden Sie in den Anweisungen des Herstellers.</td></tr><tr><td>Bildanalyseprogramm (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Verfügbar bei http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Tabellenkalkulationsprogramm (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Verfügbar bei https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Gewebedisruptor (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Konventioneller Thermocycler (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Es kann jeder herkömmliche Thermocycler mit beheiztem Deckel verwendet werden.</td></tr><tr><td>PCR-Plattenschleuder</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>Dieses Gerät hat nur eine Geschwindigkeit (2.500 U/min); der Rotor startet beim Schließen des Deckels und stoppt, wenn der Knopf gedrückt wird.</td></tr><tr><td>TE-Puffer</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,0</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-nachweis von respiratory pathogens in tier proben durch nanoskalige pcr

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano- Maßstab real-time PCR verwendet Spatial Multiplexing mehrere Tests zu ermöglichen, parallel auf einer einzigen Platte ohne die typischen Nachteile der Kombination von Reaktionen zusammen ausgeführt werden. Wir entwarfen und ausgewertet, um eine Platte auf diesem Prinzip beruhen, um schnell das Vorhandensein von gemeinsamen Krankheitserregern bei Hunden und Pferden mit akuten Atemwegserkrankungen zu identifizieren. Dieses Manuskript beschreibt einen nanoskaligen diagnostischen PCR-Workflow für die Probenvorbereitung, Amplifikation und Analyse von Zielpathogens Sequenzen, auf Verfahren konzentrieren, die von Mikrolitermaßstab Reaktionen unterschiedlich sind. In der Atem Panel vorgestellt wurden 18 Tests jeweils dreifach angesetzt, zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Eine universelle Extraktion und Vorverstärkung Workflow wurde für Hochdurchsatz-Probenvorbereitung optimiert, um mehrere Matrizen und DNA- und RNA-basierte Krankheitserreger beherbergen. Repräsentative Daten sind für eine Ziel-RNA (Influenza-A-Matrix) und eine Ziel-DNA (Pferde-Herpesvirus vorgestellt1). Die Fähigkeit, schnell und genau zu prüfen, für eine umfassende, Syndrom-basierte Gruppe von Krankheitserregern ist ein wertvolles Instrument zur Verbesserung der Effizienz und Ergonomie von Diagnostik-Tests und für akute Atemwegserkrankungen Diagnose und Behandlung.

Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 für einen repräsentativen RNA - Assay (Influenza Matrix) und DNA - Test (EHV-1) mit einer Kombination von positiven Kontrollen und klinischen Proben abgegeben für diagnostische Routinetests gezeigt. Die Fluoreszenzsignale in dieser typischen Reaktion emittiert werden , in Abbildung 1 gezeigt , die rohen Fluoreszenzwerte pro Zyklus plottet. Alle relativen cycle threshold (Ct) -Werte wurden durch die Verstärkung Maschine Software automatisch generiert. Die Hintergrundfluoreszenz wurde als separate Metrik für die Beurteilung der Belastungs Qualität verwendet, anstatt sie in die Fluoreszenzmesswerte vor der Berechnung der Ct-Werte enthält. Die analytische Nachweisgrenze (LOD) für jedes Ziel wurde auf dem Gesamtmittelwert der Ct-Werte bei 95% Erkennungspegel plus 2 Standardabweichungen in einem Pool von Kontrollen berechnet füralle Ziele. Die höchste Verdünnung, bei denen mindestens 95% der Replikate positiv für den repräsentativen Assays wurden war 50 Kopien; Nachweis von 5 Kopien war in 50% der Wiederholungsversuche erfolgreich. Weder Test wurde bei unterhalb einer Kopie erkannt. Die LOD für die RNA und DNA-Test wurden bei Ct-Werte von 21,92 und 20,05 berechnet. Diese Werte wurden als die Cutoffs für die Berichterstattung Werte als positiv gegenüber verdächtig zu sein (möglicherweise nicht wiederholbar). Andere Aspekte der analytischen Leistungsfähigkeit der Ziele wurde mit Reihenverdünnungen von gepoolten positiven Kontrollen laufen bewertet an drei verschiedenen Tagen (Abbildung 2). Die mittleren Wirkungsgrade der repräsentativen RNA und DNA-Tests wurden 101,1% und 106,6%; der Gesamtmitteleffizienz für alle Ziele war 101,3%. Die Tests hatten auch eine gute Linearität (R 2&gt; 0,98). Variation innerhalb Replikation Durchgangslöcher war in der Regel innerhalb von Standardabweichungen von 0,2 für beide klinischen Proben eind Kontrollen. Keine Kreuzreaktivität zwischen jedem der Targets beobachtet. Die endgültigen Ergebnisse Arbeitsblatt in der zusätzlichen Datei zeigt repräsentative quantitative Ergebnisse für 10 klinische diagnostische Proben und 4 steuert. Die klinischen Proben sind eine Teilmenge der Arten von Proben routinemäßig einschließlich nasal / Oropharynxabstriche getestet, Lungengewebe und Stuhlproben. Ein (Pferde-) Stuhlprobe in dieser Reihe zeigt eine gescheiterte MS2 interne Kontrolle, die die Anwesenheit von Inhibitoren in der Probe anzeigt. Dies wird typischerweise durch Verdünnung der eluierten Probe und / oder Wiedergewinnung geleitet. Wie es hier der Fall ist, sollte die negativen Verstärkungssteuerung für alle Ziele negativ sein, und die negative Extraktionskontrolle sollte nur die interne Kontrolle enthält. In der klinischen Satz hergestellten Proben Ct - Werte für betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, Hundestaupevirus A, Hunde-Parainfluenza - Virus, Eckzahn Pneumovirus und GrippeEIN. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Abbildung 1. Amplification Plots. Fluoreszenzablesungen gegen Amplifikationszyklen für die RNA - Assay (A) aufgetragen und DNA - Assay (B). Triangles sind bezeichnet Ct - Werte angezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Abbildung 2. Standardkurven. Standardkurven aus der RNA und DNA - Test an drei verschiedenen Tagen getestet werden aufgetragen , um die Linearität und den Bereich der Amplifikation unter Verwendung von Positivkontrollen zu demonstrieren. Zyklus Schwellenwert (Ct) -Werte gegen log aufgetragen (10) der Anzahl von Kopien von RNA (A) oder DNA ( <strong&gt; B) Standard. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Tabelle 1 : Schematische der Verstärkungsplatte und Zielorten. Die Platten verwendet für nanoskalige real-time PCR - Tests auf dieser Plattform sind Mikroskop - Objektträger-Größe und sind in 48 Sub - Arrays von 64 Durchgangslöcher mit insgesamt 3.072 Durchgangslöcher angeordnet für einzelne Reaktionen. Eine Sub-Array wird hier gezeigt, mit 18 Zielen in dreifacher Ausfertigung. Jede Probe wird hinzugefügt, um ein Subarray der Flüssigkeitshandhabungs. Platten werden mit hydrophilen und hydrophoben Verbindungen beschichtet Reagenzien in Durchgangslöchern durch die Oberflächenspannung zu halten. Der Edelstahl-Chip &quot;photolithographisch strukturiert und nass geätzt von 3072 Mikro bearbeitet, 320 &amp; mgr; m diamete eine geradlinige Anordnung zu bilden. r Löcher von 33 nl jeder &quot;2 Abkürzungen für Ziele sind wie folgt: BCOR, Hunde- Atemcorona (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, Hunde - Adenovirus; CPIV, Hunde-Parainfluenza - Virus; CPNV, Eckzahn Pneumovirus; DISTA / B, Hunde- Staupevirus A und B; EADV1 / 2, Pferde-Adenovirus 1/2; EAV, Pferde-Arteriitis-Virus; EHV1 / 4, Pferde-Herpes-Virus Typ 1/4; ERVA / B, Pferde- Rhinitis Virus A / B; IVM, Influenza-A-Matrix; MCYNOS, Mycoplasma Cynos; MS2, die interne Kontrolle (MS2 RNA - Phagen); TeilAnl, Streptococcus equi. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Tabelle 2. Platte Transfer Karte. Eine farbkodierte Platte Transfer Karte für die Verwendung eines festen 8-Kanal - Pipette aus der 96-Well - Vorverstärker Platte zu übertragen , um die 384-Well - Platte gezeigt. Alternativ kann eine einstellbare Pipette verwendet werden. Das gleiche Verfahren wird jedes Mal durchgeführt, unabhängig von h<html> ow viele Proben sind in der Platte. <img alt="Supplemental Datei" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Supplemental - Datei. Ein Makro-fähigen Tabellenkalkulationsdatei zwei Makros für die Formatierung Ergebnisse in einer Übersichtstabelle enthält (wie im Protokoll beschrieben) vorgesehen ist. Ein typisches Ergebnis Tabelle durch die Makros erzeugt wird in der Datei (unter Jahresergebnis) enthalten. Die beiden Makros werden in den Musternamen in der ersten Spalte (bis zu 48 Proben) und der Durchschnitt der drei Ct-Werte für jedes Ziel für die mit positiven Ergebnissen zu füllen; beachten Sie, dass die Ziele, die nicht verstärken hat in dieser Tabelle leer angezeigt. Dies kann leicht auf ein Blatt Papier gedruckt werden, und als Referenz verwendet effizient die Rohdaten für die Überprüfung. In der abschließenden Ergebnisse Registerkarte repräsentative Ergebnisse für 10 klinische Proben und 4 Kontrollen gezeigt. Abkürzungen für die Assay - Namen sind in der Legende von Tabelle 1 aufgelistet.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Echtzeit-PCR-Testmethode besteht darin, DNA- und RNA-basierte Krankheitserreger gemeinsam hochdurchsatzfähig nachzuweisen. Nukleinsäure aus klinischen Proben wird mit einem gemeinsamen Primer-Pool vorverstärkt, der auf eine OpenArray-Platte aufgetragen wird, und anschließend auf das Vorhandensein von Krankheitserregern analysiert. Diese Methode kann die Überwachungsmaßnahmen im Rahmen des OneHealth-Ansatzes für Infektionskrankheiten unterstützen.Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ermöglicht diese Methode, mehr Proben auf mehr Zielstrukturen zu testen, ohne dass diese miteinander konkurrieren, wodurch die Testeffizienz verbessert wird. Die Methode verwendet eine maßgeschneiderte nanoskalige PCR-Platte. Die Primer und Sonden werden an den Rändern von Durchgangslöchern aufgebracht, und die Proben werden mithilfe eines Flüssigkeitsmanipulators zugegeben.Wir werden die Methode an klinischen Proben demonstrieren, die auf ein Panel von Atemwegserregern bei Pferden und Hunden getestet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, gestalten Sie die Platte wie im textlichen Protokoll beschrieben. Die hier verwendete Platte ist mit 18 Zielstrukturen in dreifacher Ausführung konfiguriert.Geben Sie Medium zu den Abstrichen und Trachealspülungen hinzu, sodass mindestens ein bis zwei Milliliter Flüssigkeit vorhanden sind. Vortexen Sie den Abstrich und DMEM kräftig im Reagenzglas. Übertragen Sie anschließend mit einer Pipette etwa 1 Milliliter Medium in ein neues Reagenzglas.Fügen Sie 235 µL Lysepuffer und 175 µL Probe zu jedem Befüllrohr hinzu. Setzen Sie gemäß der Anleitung des Herstellers die Extraktion der gesamten Nukleinsäure fort. Bereiten Sie die Reverse Transkription und die Vervielfältigung der Nukleinsäure oder Preamp wie im Textprotokoll beschrieben vor, indem Sie zunächst die Probenzuordnung überprüfen.Fügen Sie 8,5 µL der Vorvermehrungs-Master-Mix und 5,5 µL der DNA/RNA-Probe in jedes Reagenzloch einer Standard-96-Lochplatte nur auf der linken Seite der Platte hinzu. Nach dem Kombinieren der Proben, positiven Kontrollen und negativen Kontrollen mit dem Vorvermehrungs-Mix, verschließen Sie die Standard-96-Lochplatte gründlich mit einer klaren selbstklebenden Abdeckung. Entfernen Sie überschüssige Abdeckung mit einem Rasiermesser, um die Bildung von Lücken in der Abdeckung während des Zyklierens zu verhindern.Zentrifugieren Sie die verschlossene Platte 20 Sekunden lang mit einem PCR-Platten-Zentrifugenadapter. Überprüfen Sie, ob alle Reagenzien am Boden der Plattenmulden vereint sind. Schalten Sie nach dem Einschalten eines herkömmlichen Thermocyclers das Vorverstärkungs-Zyklusprogramm aus und starten Sie das Programm.Setzen Sie die 96-Loch-Platte erst dann in den Thermocycler, wenn der untere Bereich des Thermocyclers die für die cDNA-Synthese erforderliche Temperatur erreicht hat, wie auf dem Bildschirm angezeigte Temperaturüberwachung zeigt. Sobald der Vorverstärkungs-Lauf abgeschlossen ist, überprüfen Sie, ob die Platte weiterhin versiegelt ist. Nachdem Sie doppelte Handschuhe und Ärmelschutz angelegt haben, entfernen Sie die Versiegelung von der Vorverstärkungs-Platte.Entfernen und entsorgen Sie anschließend vorsichtig die äußeren Handschuhe. Verdünnen Sie die Preamp-Produkte im Verhältnis 1 zu 5, indem Sie 56 Mikroliter TE-Puffer zu jedem Well der Spalten eins bis sechs der 96-Well-Preamp-Platte hinzufügen und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Gehen Sie dabei nur bis zum ersten Anschlag des Pipettiers, aspirieren Sie vom Boden und geben Sie die Flüssigkeit weiter oben wieder ab, erzeugen Sie jedoch keine Blasen.Fügen Sie TE-Puffer allen sechs Spalten hinzu, unabhängig von ungenutzten Vertiefungen. Bereiten Sie den Transfer in die 384-Vertiefungs-Platte für die Amplifikation gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Nach Abschluss der Vorbereitungsschritte ziehen Sie neue, gut sitzende Doppelhandschuhe und Ärmelschutz an.Wegen der hohen Verdunstungsraten beim Pipettieren geringer Volumina ist es entscheidend, den Mastermix und die Probe effizient zuzugeben und die Platte unverzüglich zu versiegeln. Geben Sie 2,5 µL Amplifikations-Mastermix in eine 384-Well-Platte. Weiße Platten werden hier zu Demonstrationszwecken verwendet, aber schwarze Platten sollten zur Verringerung der Augenbelastung eingesetzt werden.Übertragen Sie 2,5 µL des verdünnten Vervielfältigungsprodukts gemäß der Abbildung im Textprotokoll in die 384-Loch-Platte. Die hier gezeigten farbigen Würfel veranschaulichen die Übertragungsreihenfolge für eine Festkanalpipette. Verschließen Sie die Platte unverzüglich dicht mit einer Folienabdichtung.Äußere Handschuhe und Ärmelüberzüge entsorgen. Die 384-Loch-Platte 20 Sekunden im PCR-Platten-Zentrifugenapparat zentrifugieren. Die Folienabdichtung nicht entfernen, sondern die 384-Loch-Platte in den Flüssigkeitshandler geben.Öffnen Sie die Verpackung mit der eingeschlossenen Amplifikationsplatte und legen Sie sie vorsichtig in den Flüssigkeitshandler in den ersten Slot, wobei die Seriennummer rechts liegen soll. Halten Sie die Hülle an den Kanten fest, ohne die Oberfläche der Platte zu berühren. Entfernen Sie nach dem korrekten Einsetzen die Folienabdichtung von der 384-Loch-Platte innerhalb des Flüssigkeitshandlers. Klicken Sie auf „Weiter“ und aktivieren Sie anschließend alle Kontrollkästchen, sobald jeder Schritt abgeschlossen ist.Schließen Sie die Tür des Flüssigkeitshandlers und starten Sie umgehend den Befüllvorgang. Bleiben Sie neben dem Flüssigkeitshandler und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, sobald die Platte befüllt ist. Während der Flüssigkeitshandler läuft, entfernen Sie den Schutzfilm von der Unterseite eines Deckels. Lassen Sie die obere Folie an Ort und Stelle. Beaufschlagen Sie das rote Band, indem Sie es leicht ziehen, um es von dem Klebstoff zu lösen. Entnehmen Sie die beladene Amplifikationsplatte vom Flüssigkeitshandler und setzen Sie sie vorsichtig in die Plattenpresse ein, wobei die Seriennummer rechts ist.Setzen Sie den Deckel auf die Platte, wobei die ausgeschnittene Seite rechts und der Klebstoff unten ist. Ziehen Sie vorsichtig am Hebel der Plattenpresse, um diese zu schließen; das Licht blinkt dann 20 Sekunden lang. Berühren Sie die Plattenpresse währenddessen nicht.Sobald die Anzeige dauerhaft grün wird, heben Sie den Hebel an und nehmen Sie die versiegelte Platte vorsichtig auf, wobei Sie sie an den Rändern halten. Halten Sie die versiegelte Amplifikationsplatte senkrecht an den Rändern des Gehäuses und setzen Sie die Spritze unmittelbar in den Ladeanschluss am Ende des Gehäuses ein. Geben Sie dann die Immersionsflüssigkeit langsam in einer einzigen sanften, kontinuierlichen Bewegung ab, um den Raum zwischen Platte und Deckel zu füllen. Lassen Sie eine kleine Luftblase in einer Ecke zurück, sobald die Platte eingetaucht ist.Während Sie die Platte weiterhin vertikal an den Rändern halten, verschließen Sie den Ladeanschluss, indem Sie den Stopfen in die Öffnung einführen und im Uhrzeigersinn drehen; üben Sie ausreichenden Druck aus, bis der Griff abbricht. Reinigen Sie das Gehäuse mit einem fusselfreien Tuch, das gründlich mit Ethanol besprüht wurde. Zum Trocknen des Gehäuses wischen Sie es mit einem sauberen Tuch nach unten ab.Bringen Sie die verschlossene Platte zur Amplifikationsmaschine. Wählen Sie unter dem Reiter Instrument die Instrumentenkonsole aus. Wählen Sie die Amplifikationsmaschine aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche zum Öffnen der Tür.Platzieren Sie die Amplifikationsplatte im ersten Steckplatz des Plattenadapters und prüfen Sie, ob der Adapter korrekt ausgerichtet ist, sodass eine Eins in der oberen linken Ecke sichtbar ist. Richten Sie die Platte so aus, dass sich der Barcode nach oben und nach vorne zum Gerät hin befindet. Klicken Sie nach dem Schließen der Tür auf die Schaltfläche „Tür schließen“ und navigieren Sie anschließend zum Startreiter am unteren Bildschirmrand.Wählen Sie im Menü „Run“ die Option OpenArray aus. Klicken Sie auf „Plate-IDs abrufen“. Um den Lauf zu starten, klicken Sie auf „Run starten“.Öffnen Sie eine Tabellenkalkulation, die das Ergebnismakro enthält. Klicken Sie im exportierten Datendatei mit der rechten Maustaste auf die Registerkarte unten auf dem Bildschirm und wählen Sie „Verschieben oder Kopieren“. Wählen Sie im Feld „In Arbeitsmappe“ das Ergebnismakro aus.Klicken Sie dann auf „Verschieben ans Ende“ und aktivieren Sie das Kontrollkästchen mit der Bezeichnung „Kopie erstellen“. Klicken Sie abschließend auf „OK“. Löschen Sie die alte Export-Registerkarte und benennen Sie die neu hinzugefügte Registerkarte in „Export“ um.Klicken Sie auf Ansicht, dann auf Makros, wählen Sie das Makro aus und klicken Sie auf Ausführen. Wiederholen Sie dies anschließend für Macro2, indem Sie auf Ansicht, dann auf Makros klicken, Macro2 auswählen und auf Ausführen klicken. In der Software der Amplifikationsmaschine überprüfen Sie die Kurven für jede Probe und jede Kontrolle anhand der Makrotabelle, indem Sie auf der linken Seite des Bildschirms Analyse/Amplifikationsdiagramm auswählen.Danach wählen Sie den Reiter „Probe“ aus und klicken auf jede einzelne Probe, um zu überprüfen, ob zwei oder drei positive Verstärfungskurven für jedes der positiven Ergebnisse in der Tabelle vorliegen. Die Fluoreszenzsignale werden über die Amplifikationszyklen aufgetragen, um zu veranschaulichen, dass die Echtzeit-PCR erfolgreich durchgeführt wurde. Die meisten Proben erreichten relative Schwellenwerte zwischen Zyklus zwei und 25 der Echtzeit-PCR-Reaktion.Standardkurven, die an drei verschiedenen Tagen durchgeführt wurden, werden dargestellt, um die Linearität und den Amplifikationsbereich unter Verwendung positiver Kontrollen zu demonstrieren. Die Cycle-Threshold-Werte werden gegen den Logarithmus zur Basis 10 der Kopienzahl des Nukleinsäurestandards aufgetragen. Die beiden Makros tragen die Probennamen in die erste Spalte ein und berechnen den Mittelwert der drei Ct-Werte für jedes Target bei positiven Ergebnissen.Ziele, die sich nicht amplifizierten, erscheinen in dieser Tabelle als leer. Es werden quantitative Ergebnisse für 10 klinische Proben und vier routinemäßige Kontrollen gezeigt; wie hier dargestellt, sollte die negative Amplifikationskontrolle für alle Ziele negativ sein, und die negative Extraktionskontrolle sollte nur die interne Kontrolle enthalten. Eine Probe in diesem Satz zeigt eine fehlgeschlagene interne Kontrolle, was auf die Anwesenheit von Inhibitoren in der Probe hinweist.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein PCR-Experiment im Nanomaßstab durchführt. Dieses Verfahren erleichtert die Durchführung syndrombasierter Testpanels in der tierärztlichen Diagnostik. Diese Methode kann angepasst werden, um Nachweise für die verursachenden Agenten vieler unterschiedlicher Infektionskrankheiten einzubeziehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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