Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Das übergeordnete Ziel des Fast Nano-Positionierungssystems ist es, Echtzeit-Strukturinformationen von Biomolekülen bereitzustellen, indem Einzelmolekül-FRET-Experimente mit strengen statistischen Analysen kombiniert werden. Diese Methode beantwortet Schlüsselfragen im Bereich der Strukturbiologie, wie z.B. die Lokalisierung flexibler Domänen in Makromolekülen, wo Standardwerkzeuge der Strukturbiologie nicht angewendet werden können. Die wesentliche Verbesserung des schnellen NPS im Vergleich zu anderen FRET-basierten Strukturwerkzeugen besteht darin, dass verschiedene Farbstoffmodelle nicht nur anhand der wahrscheinlichsten Positionen, sondern auch anhand einer dreidimensionalen Wahrscheinlichkeitsverteilung verglichen werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Strukturdaten aus der Proteindatenbank mit quantitativen Einzelmolekül-Fluoreszenzmessungen kombiniert. Um den Vorgang zu starten, bauen Sie eine Durchflusskammer und einen Probenhalter zusammen. Um die Einlass- und Auslassschrauben vorzubereiten, schrauben Sie den Silikonschlauch in die Hohllaschenschrauben und schneiden Sie den Schlauch an beiden Enden mit einer Rasierklinge gerade ab.

Schrauben Sie die Laschenschrauben an den Probenhalter. Richten Sie die Quarzschiebelöcher der Durchflusskammer an den Gewinden des Probenhalters aus. Ziehen Sie die Schrauben des Glashalters vorsichtig fest, um die Durchflusskammer zu fixieren.

Schrauben Sie 20 Zentimeter lange Stücke Silikonschlauch in die Ein- und Auslassschrauben. Waschen Sie die Durchflusskammer mit 500 Mikrolitern PBS. Spülen Sie dann die Durchflusskammer mit 100 Mikrolitern Neutravidinlösung in PBS, wobei Sie darauf achten, dass sich am Ende des Einlassschlauchs ein Tröpfchen bildet, um zu verhindern, dass Luft in die Probenkammer eindringt.

Klemmen Sie den Einlass- und Auslassschlauch nach jeder Manipulation zu, um Luft aus der Durchflusskammer auszuschließen. Inkubieren Sie die Kammer 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Neutravidin-Lösung mit 500 Mikrolitern PBS aus.

Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Prisma und schrauben Sie das Prisma auf die Probenkammer. Die Einzelmolekül-FRET-Daten werden mit einem Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Starten Sie die Kamerasoftware und die Piezomotor-Software der Bühne.

Montieren Sie die Kammer horizontal, so gerade wie möglich und so, dass sie alle drei Laser schneidet, auf dem Mikrometertisch des TIRF-Mikroskops. Fügen Sie Immersionsflüssigkeit hinzu und fokussieren Sie das Mikroskopobjektiv, indem Sie die IR-Reflexionen überprüfen. Legen Sie die Kameraparameter, den Dateipfad und die Parameter für die automatische Inkrementierung fest.

Starten Sie den Live-Kamera-Feed und bleichen Sie die Hintergrundfluoreszenz mit allen drei Lasern mit voller Intensität. Verringern Sie dann die Laserintensitäten. Laden Sie dann 100 Mikroliter einer fluoreszierenden Bead-Lösung in die Kammer.

Warten Sie 10 Minuten, bis sich die Kügelchen an der Kammeroberfläche festgesetzt haben. Nehmen Sie einen Film mit einem Sichtfeld von 50 bis 100 Kügelchen auf und führen Sie eine Batch-Analyse mit einer hohen Peak-Findungsschwelle durch. Laden Sie die Filmdatei und wählen Sie zwei Perlen mit unterschiedlichen Mittelpunkten an gegenüberliegenden Ecken des Sichtfelds aus.

Wählen Sie die Pixel mit der maximalen Intensität in diesen Perlen aus. Entfernen und reinigen Sie das Prisma. Bereiten Sie eine zweite Probenkammer vor und schrauben Sie den Prismenhalter auf die Kammer.

Montieren Sie die Kammer auf dem Mikrometertisch. Laden Sie dann 100 Mikroliter einer 50 bis 100 pikomolären Lösung einer biotinylierten fluoreszenzmarkierten Probe in die Kammer. Warten Sie, bis sich die Moleküle an die Kammeroberfläche gebunden haben.

Klicken Sie gleichzeitig auf Signal nehmen, um die Aufzeichnung zu starten und den Donoranregungslaser einzuschalten. Passen Sie die Laserleistung an, um sicherzustellen, dass mindestens 80 % der Moleküle im Sichtfeld gebleicht sind. Bewegen Sie dann die Kammer, um einen ungebleichten Bereich zu zeigen, und nehmen Sie den nächsten Film auf. Bleichen Sie den Rest der Probenkammer auf diese Weise.

Nach den Messungen am TIRF-Mikroskop müssen die erfassten Einzelmolekül-FRET-Daten analysiert werden, um die mittlere FRET-Effizienz zu erhalten. Führen Sie eine Batch-Analyse der Spender- und Akzeptorfilme der Probe durch. Laden Sie dann die gestapelten Filmdateien in die Datenanalysesoftware.

Klicken Sie auf die Schaltfläche NOT Selected, um die einzelnen FRET-Phasen anzuzeigen. Klicken Sie auf den Beginn der FRET-Periode, dann auf den Zeitpunkt, an dem die Akzeptorintensität aufgrund des Bleichens abnimmt, und schließlich auf den Zeitpunkt, an dem die Spenderintensität aufgrund des Bleichens abnimmt. Wählen Sie im nächsten Fenster Ja aus, um die ausgewählte FRET-Effizienzkurve beizubehalten.

Sobald jedes Molekül analysiert wurde, speichern Sie die Spuren und analysieren Sie den nächsten Film. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, führen Sie ein Skript aus, um die FRET-Ergebnisse zu kombinieren. Importieren Sie die kombinierte frameweise FRET-Datei mit der Standardeingabeoption in eine Datenanalysesoftware.

Plotten Sie die Daten als Histogramm, und verwenden Sie das Werkzeug zur nichtlinearen Kurvenanpassung, um sie an einen Gaußschen Histogramm anzupassen. Der Überschreitungswert ist der wichtigste FRET-Wirkungsgrad. Verwenden Sie UV-VIS und Fluoreszenzspektroskopie, um den isotropen Forster-Radius und die stationären Anisotropiewerte für jeden Farbstoff zu bestimmen.

Das Nano-Positionierungssystem wurde vom bekannten GPS inspiriert, da wir eine unbekannte Position, die Antenne, mit mehreren bekannten Positionen, den Satelliten, lokalisieren. Um die NPS-Analyse zu starten, starten Sie die FastNPS-Software und erstellen Sie eine neue Auftragsdatei. Um die Positionsprioren der beschrifteten Antennen und Satelliten zu definieren, geben Sie im Fenster ModelDyePrior die räumliche Auflösung der zu definierenden Position ein.

Schließen Sie das Innere des Makromoleküls aus, indem Sie die entsprechende zentrierte PDB-Datei laden. Geben Sie den Farbdurchmesser und den Skelettierungsabstand ein. Geben Sie die minimalen und maximalen Positionskoordinaten der möglichen Färbeposition ein.

Wenn es sich bei der zu definierenden Position um einen Satelliten handelt, wählen Sie Farbstoffanbindung über flexiblen Linker und geben Sie die Atomkoordinaten aus der zentrierten PDB-Datei ein. Geben Sie die Länge und den Durchmesser des Linkers ein. Klicken Sie auf Verfügbares Volumen berechnen, speichern Sie die vorherige Position und exportieren Sie sie zur Visualisierung.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Satelliten und Antennen. Nachdem Sie die Positionen definiert haben, öffnen Sie das Fenster Messung definieren und erstellen Sie ein neues Farbstoffmolekül. Laden Sie die Position, die diesem Farbstoff zuvor zugeordnet ist.

Geben Sie die Fluoreszenzanisotropie ein, wählen Sie ein geeignetes Farbstoffmodell aus und aktivieren Sie den Farbstoff. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Farbstoffe definiert sind. Erstellen Sie dann eine neue Messung.

Wählen Sie ein FRET-Paar aus den definierten Farbstoffen aus. Geben Sie die Einzelmolekül-FRET-Effizienz mit Fehler und den isotropen Forster-Radius dieses Farbstoffpaares ein und aktivieren Sie die Messung. Wiederholen Sie dies für alle Farbstoffpaare.

Öffnen Sie als Nächstes das Berechnungsfenster. Wenn Farbstoffe verschiedenen Modellen zugewiesen wurden, wählen Sie Benutzerdefiniert. Andernfalls wählen Sie das Modell aus, das für alle Farbstoffe verwendet werden soll.

Führen Sie die Berechnung durch und öffnen Sie das Ergebnisfenster. Bei der Verwendung von FastNPS ist es wichtig, daran zu denken, die Modelle für alle Farbstoffe anzupassen, um die glaubwürdigen Volumina zu minimieren und gleichzeitig natürlich konsistent zu bleiben. Wenn die Konsistenz niedriger als 90 % ist, klicken Sie auf Detaillierte Konsistenz und identifizieren Sie die Farbstoffe, die in Einträgen mit einer Konsistenz von weniger als 90 % vorkommen.

Öffnen Sie das Fenster Messung definieren und ändern Sie das Modell des betreffenden Farbstoffs. Führen Sie die Berechnung im Modus Benutzerdefiniert erneut aus. Exportieren Sie die glaubwürdigen Mengen der Farbstoffe einzeln oder als Charge.

Öffnen Sie die Dichtedateien in der Visualisierungssoftware und stellen Sie die Glaubwürdigkeit auf das gewünschte Niveau ein. Die Effizienz von Einzelmolekül-FRETs wurde zwischen unbekannten Antennenmolekülen und mehreren bekannten Satellitenmolekülen innerhalb eines offenen Promotor-Komplexes der archaealen RNA-Polymerase gemessen. Die NPS-Analyse dieser Daten bestimmte die glaubwürdigen Volumina dieser Farbstoffmoleküle im Verhältnis zum offenen Promotor-Komplex der archaealen RNA-Polymerase.

Fünf verschiedene Modelle, in denen die Farbstoffmoleküle verwendet wurden, und die Ergebnisse wurden verglichen. Die glaubwürdigen Volumina stimmten mit den gemessenen Daten überein, wenn sie mit Modellen berechnet wurden, die davon ausgingen, dass sich der Farbstoff nur innerhalb eines Kegels unbekannter Ausrichtung frei drehen kann. Vor allem das klassische Modell ist am konservativsten, da es weiter davon ausgeht, dass sich der Farbstoff an einem festen Ort befindet.

Dadurch entsteht ein relativ großes glaubwürdiges Volumen, aber das Volumen umschließt in der Regel die richtige Position. Modelle mit höherer Präzision gehen davon aus, dass sich der Farbstoff während seiner Fluoreszenzlebensdauer völlig frei drehen kann. Das Iso-Modell geht wie das klassische Modell davon aus, dass sich der Farbstoff an einer festen Position innerhalb des zugänglichen Volumens befindet.

Das meanpos-iso-Modell geht von einer dynamischen Mittelung über alle möglichen Positionen aus. Während die glaubwürdigen Volumina der ISO-Modelle viel kleiner sind als die von den Nicht-ISO-Modellen berechneten, sind sie inkonsistent mit den gemessenen Daten. Wir wollten eine Technik entwickeln, die es uns ermöglicht, dynamische Strukturinformationen von transienten Komplexen zu erfassen, ein Problem, das mit bestehenden Strukturwerkzeugen nicht gelöst werden konnte.

Sobald die Einzelmolekül-FRET-Daten aufgezeichnet wurden, ist die FastNPS-Analyse in wenigen Stunden abgeschlossen, was einen schnellen Vergleich verschiedener Farbstoffmodelle ermöglicht. Im Anschluss an dieses Verfahren können nachträglich weitere Methoden wie MD-Simulationen durchgeführt werden, um strukturierte Modelle zu erhalten, die mit experimentellen Einzelmolekül-FRET-Daten konsistent sind.