Name: Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie strukturelle Informationen von Einzelmolekül-FRET-Experimenten mit dem Fast Nano-Positionierungssystem gewinnen. Diese Methode lokalisiert flexible Domänen in Biomolekülen mit dreidimensionaler Wahrscheinlichkeitsverteilung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken B. Gruchmann für die mechanischen Zeichnungen der Strömungskammer. Darüber hinaus möchten wir uns bei Max Beckers und Florian Drechsler für die aufschlussreichen Kommentare und Diskussionen zum NPS und der zugrundeliegenden Stichprobenmaschine bedanken.

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
<li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li>
<li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid%2FIntegrative+Methods+Task+Force+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li>
<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
<li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li>
<li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction%3A+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
<li>Schröder, G. F., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0010465504000748">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li>
<li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li>
<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nsmb/journal/v23/n2/full/nsmb.3148.html">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li>
<li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li>
<li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li>
<li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li>
<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li>
<li>Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).</li>
<li>Muschielok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nano-positioning+system+for+macromolecular+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A nano-positioning system for macromolecular structural analysis.</a> Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).</li>
<li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li>
<li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li>
<li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule%5BTitle%5D)+AND+%22FRET+and+NPS.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161(2015).</li>
<li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4%2F5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li>
<li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li>
<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
<li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir präsentieren das Setup und experimentelle Verfahren zur genauen FRET Effizienzen zwischen Farbstoffen gebunden über flexible Linker an Biomakromolekülen, dh Nukleinsäuren und / oder Proteinen bestimmen. Um präzise Messungen smFRET (Abschnitt 3) zu gewährleisten, ist es wichtig, die Luft aus der Strömungskammer jederzeit während der Messung auszuschließen. Darüber hinaus stellen Sie sicher nicht mit Fluorophore die Strömungskammer zu überlasten. Die Fluorophore müssen klar korrekte Analyse, um sicherzustellen, getrennt werden. Als smFRET Paare, die aus der Analyse ausgeschlossen haben nicht Bleichen des Spenders zeigen werden, stellen Sie sicher, dass&gt; 80% der Moleküle in dem Sichtfeld am Ende des Films gebleicht werden. Zur Berücksichtigung von Inhomogenitäten in der Probe der β-Faktor und der γ-Faktor, die Übersprechen und relative Nachweiseffizienz des Spenders und Akzeptorkanal Korrektur bzw. werden für jede berechnete FRET einzeln koppeln. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Die Kameraeinstellungen (Integrationszeit, Elektronen-Vervielfacher zu gewinnen, in Abschnitt 3.9 beschrieben Vorverstärker Verstärkung und Ausleserate) sollten auf Werte eingestellt werden, um das beste Kompromiss zwischen Signal-Rausch-Verhältnis, Dynamikbereich und Zeitauflösung zu geben. Sie müssen für verschiedene Experimente neu eingestellt werden oder wenn unterschiedliche Hardware verwendet wird. Die Anzahlen von Frames müssen hoch genug sein, um sicherzustellen, dass die meisten der Donatormoleküle bleach innerhalb der Beobachtungszeit. Für die Messungen auf dem Fluoreszenzspektrometer (§§ 7 bis 9) einen guten Kompromiss zwischen der Signalintensität und der spektralen Auflösung der aufgezeichneten Daten hat zu finden. Zu diesem Zweck sind die Schlitze in der Anregungs- und Emissions Weg des Fluoreszenz-Spektrometer müssen abhängig von dem Gerät verwendet werden, angepasst und die Probenkonzentration. Darüber hinaus präsentieren wir die Fast-NPS-Analyseverfahren Strukturinformationen von transienten oder dynamischen macrom zu erhaltenMOLEKULARE Komplexe. NPS wurde den Pfad des Nicht-Template-DNA-Strang und die Position der Transkriptionsinitiationsfaktoren bei der archaealen RNA-Polymerase-Komplex offen zu offenbaren aufgetragen. Mit dem Netzwerk von mehr als 60 verschiedenen Entfernungsmessungen haben wir gezeigt, dass Schnell NPS, ausgestattet mit einem neu implementierten Sampling-Engine (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., &amp; Michaelis, J. in Vorbereitung), reduziert die Zeit für die Analyse dieses komplexen smFRET Netzwerk ≈2 Grßenordnungen erforderlich, da 27 zu dem ursprünglichen globalen NPS - Methode verglichen. Die Robustheit des Algorithmus ist in einer Metropole-in-Gibbs-Sampler mit einem parallelen Temperierung Schema kombiniert verwurzelt. Schnell-NPS zeigt exakte Reproduzierbarkeit von Netzwerk - Ergebnisse und steht im Einklang mit den Ergebnissen früherer 30 veröffentlicht. Mehrere verschiedene Methoden wurden von smFRET Messungen Strukturinformationen zu schließen , veröffentlicht Aiming 11 </snach oben&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Alle diese Ansätze liefern nur eine spezifische Farbstoff-Modell. So Farbstoffe, die nicht erfüllen, die vom jeweiligen Modell getroffenen Annahmen nicht auf falsche Strukturinformationen verwendet oder führen werden. Fast-NPS, im Gegenteil, kann für jedes Farbstoffmolekül ein anderes Modell auszuwählen. Dies hilft, für unterschiedliche konformative Verhalten beider zu berücksichtigen, das Farbstoffmolekül selbst, sowie der Linker für seine Befestigung verwendet. Die lokalen molekularen Umgebung des Farbstoffmoleküls sowie ihre physikalischen Eigenschaften wird bestimmen, welches Modell am besten geeignet ist. Für den analysierten smFRET Netzwerk des archaeal Initiationskomplex, eine isotrope Annahme für alle Farbstoffmolekülen führt zu einer drastischen Abnahme in die Größe der glaubhafte Volumen als dem klassischen Modell verglichen. In Kombination mit einer dynamischen Position für alle Farbstoffmoleküle im Durchschnitt den Durchschnitt aller glaubhafte Volumengrößen (bei 95%) reduziert sich auf weniger als 0,5 nm 3. Jedoch sind diese Farbstoffmolekül Zähne nicht mehr mit ihren smFRET Messungen, was darauf hinweist, dass die Annahmen führen zu falschen Strukturinformationen gemacht. Im Gegensatz dazu sind die Seitenzähne im klassischen Modell bestimmt in Übereinstimmung mit den ermittelten smFRET Effizienz. Da die Annahme von isotropen und / oder dynamische Position für alle Farbstoffe mit durchschnittlich führen zu Inkonsistenzen, Fast-NPS Farbstoffmolekül priors, in dem ermöglicht jeder Farbstoff eine der fünf Modelle zugeordnet werden können. Jedes Modell verwendet das gleiche Volumen zugänglich. Der Algorithmus für die Berechnung der Farbstoff AVs macht mehrere Annahmen. Zunächst wird die Raumform des Fluorophors wird durch eine Kugel angenähert. Somit nimmt ein Durchmesser-Konto in das wid des Fluorophorsth, Höhe und Dicke sollte (§ 12) verwendet werden. Ferner wird der Linker die Form durch einen flexiblen Stab angenähert. Die dargestellten Werte in § 12 wurden für den Farbstoff Alexa 647 über einen 12-C Linker gebunden berechnet. Bis heute ist es nicht möglich, genau eine priori bestimmen, welches Modell ist am besten geeignet, da eine experimentelle Geometrie und damit alle Modelle getestet werden sollte. In der Regel wird man das Modell zu wählen, das die kleinstmögliche Größe posterior ergibt, während noch im Einklang mit den Daten ist. Um zu testen, ob eine Auswahl an Modellen mit den smFRET Daten konsistent sind, berechnen wir sowohl die hintere und die Wahrscheinlichkeit. Konsistenz bedeutet, dass mehr als 90% der Proben aus dem hinteren gesammelt sind innerhalb des 95% Konfidenzintervalls der Wahrscheinlichkeit. Während es, dass je niedriger die Anisotropie wahr ist, haben je geringer der Abstand Unsicherheit, in einem smFRET Netzwerk geometrische Anordnungen der Farbstoffmoleküle ebenfalls berücksichtigt werden. Somit wird, während representing Farbstoffmoleküle mit einem niedrigen Fluoreszenzanisotropiemessungen mit einem ISO-Modell eine typische erste Wahl ist, stellt der Konsistenzprüfung ein direkteres Mittel für den richtigen Farbstoff Modell auswählen. Die optimale Wahl der Farbstoff-Modelle können zu einer drastischen Erhöhung der Lokalisierungsgenauigkeit führen und zugleich das Netzwerk der Konsistenz mit seinen FRET Daten behalten. Um es zusammenzufassen, Fast-NPS ermöglicht strukturelle und dynamische Informationen von großer makromolekularer Komplexe zu gewinnen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie diese hochflexible oder transiente Komplexe zur Überwachung ermöglicht und damit unser mechanistisches Verständnis komplexer biologischer Prozesse erheblich zu erweitern.

die Struktur eines Biomoleküls Bestimmung ist eine wichtige Voraussetzung für ihre Funktion zu verstehen. Zwei etablierte Methoden zur Strukturbestimmung sind Kryo-Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie 1, 2. Heute bieten beide Methoden hochauflösende Strukturinformationen mit einer Auflösung bis in den Ångström-Ebene. Diese beiden Methoden wurden ausführlich zu erläutern, die die Struktur großer Biomoleküle wie Protein-Komplexe verwendet. Obwohl die bestehenden Methoden ständig in den letzten Jahrzehnten verbessert worden sind, stellt die Komplexität biologischer Strukturen wie vor eine große Herausforderung für die Strukturbiologie, insbesondere dann , wenn große, dynamische und transiente Komplexe 3 untersucht. Um die Dynamik makromolekularer Komplexe und die Struktur-Funktions-Beziehung insbesondere Einzelmolekülmethoden haben prov zu studierenided nützliche Informationen 4. Mehrere neue Strategien wurden auf den Erwerb von strukturellen und dynamischen Informationen entwickelt eine orthogonale Ansatz bereitstellt. Beispiele dafür sind hohe Geschwindigkeit AFM 5, mechanische Manipulation 6, Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie 7 sowie Einzelmolekül - Förster - Resonanzenergietransfer (smFRET) 8, 9. Da schon früh FRET wurde auf der Längenskala von Biomakromolekülen 10 ein molekulares Lineal, aufgrund der Abstandsabhängigkeit bezeichnet. Eine besonders interessante Anwendung von smFRET ist die Abstandsinformationen aus smFRET Messungen verwenden zu schließen Struktur 11 Informationen, 12, 13, 14, 15 &gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Aufgrund der hohen Zeitauflösung von smFRET kann die Position der beweglichen Teile einer Proteinstruktur lokalisiert werden. Um jedoch quantitative Informationen aus smFRET Daten wichtig Korrekturparameter über die Farbstoffmoleküle zu extrahieren , müssen während der Messung 24 bestimmt werden. Mit diesen Korrekturfaktoren kann der FRET - Effizienz E FRET berechnet werden unter Verwendung der Formel <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg"> . wo I A und I D Abbildung 2). Die β-factor entfallen Übersprechens, um das Austreten von Donoremission in das Akzeptor-Kanal und wird berechnet durch <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg"> wo ich A und I 'D sind die Fluoreszenzintensitäten des Spenders und das Akzeptor - Molekül nach Foto Bleichen des Akzeptor - Molekül. Die γ-Faktor korrigiert die Differenz der relativen Detektionswirkungsgrade in den beiden Kanälen sowie die Unterschiede in der Fluoreszenzquantenausbeute des Donors und dem Akzeptor-Farbstoff. Es wird von jedem einzelnen Zeitverlauf berechnet durch Beachten Sie, dass diese Beschreibung direkte Anregung des Akzeptor-Molekül vernachlässigt, was manchmal wichtig wird und müssten für so gut korrigiert werden. Für diese Korrekturfaktoren bestimmt , ist es sinnvoll , sowohl die Spender als auch als Akzeptor in einem alternierenden Schema 25 , um zwischen den photophysikalischen Veränderungen und Strukturdynamik zu differenzieren zu erregen. Um quantitative smFRET Effizienz nicht nur erhalten , sondern auch quantitative Strukturinformationen, die Nano-Positioning System (NPS) wurde im Jahr 2008 26 eingeführt. Der Name wurde aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem satellitengestützten Global Positioning System (GPS) ausgewählt. Der NPS ist ein Hybrid-Technik kombiniert smFRET und Röntgenkristallographie Daten zur Lokalisierung von unbekannten Farbstoff Positionen in Biomakromoleülkomplexen. Die crystal Struktur dient als Referenzrahmen und die smFRET Ergebnisse werden verwendet , um Entfernungsinformationen zwischen einer unbekannten Fluorophor Position (Antenne) und einer von der Kristallstruktur (Satellit) bekannt erhalten. In aufeinanderfolgenden Experimenten wurden die Abstände zwischen der Antenne und mehreren Satelliten gemessen werden und die Position der Antenne mittels einer statistisch rigorose Analyse Schema bestimmt wird basierend auf Bayesian Parameterschätzung. Als Ergebnis wird nicht nur die wahrscheinlichste Position der Antenne berechnet, aber die komplette 3D Unsicherheitsverteilung, der sogenannte posteriore, glaubwürdige Volumina visualisiert. Außerdem wurde NPS für die Analyse von vollständigen smFRET Netze 27 zu ermöglichen erweitert. Die NPS verwendet wurde eine Reihe von wichtigen Fragen in eukaryotischen Transkription zu lösen, nämlich den Verlauf der vorgeschalteten DNA, die nicht-Matrizen-DNA und dem naszierenden mRNA in der RNA Polymerase II Elongation co12 mplex, 28, auch die Wirkung von Transkriptionsinitiationsfaktoren zeigen 26 und die dynamische Architektur eines offenen Promotorkomplex 29. Darüber hinaus wurde die NPS verwendet , um die Struktur der Archaea - RNA Polymerase offenen Komplex 30 und insbesondere die Position der Transkriptionsinitiationsfaktor TFE zu erläutern, die als Transkriptions - Elongationsfaktor Spt4 / 5 31 kompetitiv an derselben Stelle bindet. Seitdem haben sich eine Reihe von smFRET basierend strukturelle Ansätze veröffentlicht 15, 18, 21, 23. Wenn verschiedene smFRET basierten Strukturmethoden vergleicht, wird deutlich, daß die scheinbare Genauigkeit des Verfahrens auf die besondere Wahl der Farbstoff Modellen in hohem Maße abhängig ist. Man sollte beachten, dassFarbstoffmoleküle Verhalten unterschiedlichen räumlichen und Orientierungs abhängig von ihrer lokalen Umgebung aufweisen. Zu diesem Zweck wurde Schnell NPS 32 eingeführt. Schnell-NPS nutzt eine fortschrittliche Sampling-Algorithmus drastisch die Rechenzeiten zu reduzieren. Des Weiteren, Fast-NPS ermöglicht man eine Strukturanalyse durchzuführen und für jedes Farbstoffmolekül kann der Benutzer aus einem Satz von fünf verschiedenen Farbstoff Modelle wählen, die als nächstes beschrieben wird. Die konservativste Modell, genannt klassisch, geht davon aus, dass der Farbstoff nur eine, sondern unbekannt einnimmt, Stellung. In dieser Position kann das Fluorophor frei drehbar innerhalb eines Kegels, dessen Größe von seiner jeweiligen (zeitabhängige) Fluoreszenzanisotropie bestimmt wird. Die Ausrichtung des Kegels ist nicht bekannt, was zu großen Unsicherheiten führt, wenn gemessen smFRET Effizienzen in Abständen umwandelt. In dieser Hinsicht ist das Modell konservativ, da er auf die kleinste Genauigkeit im Vergleich zu anderen Farbstoffmodus führenls. Nur für sehr kurze Entfernungen sollten die durch das klassische Modell führen zu einer deutlich falsche Positionsbestimmung getroffenen Annahmen. Für typische smFRET Werten wird die richtige Position stets in der vergleichsweise großen glaubhafte umschlossene Volumen. Da jedoch eine höhere Genauigkeit erwünscht ist, ist es wichtig, alternative Farbstoffmodelle zu entwickeln und zu testen, was die Genauigkeit zu verbessern, könnte helfen. Wenn der Farbstoff sehr viel schneller als seine inhärente Fluoreszenzlebensdauer dreht, die sogenannte ISO - Modells angewendet werden kann. Hier wird der Orientierungsfaktor &amp; kgr; 2 (benötigt für die Berechnung der charakteristischen isotropen Förster - Radius <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg"> ) Auf 2/3 gesetzt. Als Ergebnis sind die berechneten glaubhafte Volumina fast zwei Größenordnungen kleiner als im klassischen Modell 32 im Vergleich zu denen. In dem Fall, dass das Fluorophor in einer Umgebung gefunden wird, die nicht nur schnell reori ermöglichtsentation, sondern zusätzlich schnelle Bewegung über seine gesamte zugängliche Volumen, das meanpos-iso - Modell verwendet werden soll. In diesem Modell nimmt der Farbstoff effektiv nur eine mittlere Position, wobei die räumliche Mittelung 15 durch ein Polynom Entfernungsumwandlungs berücksichtigt wird. Dieses Modell gilt , wenn beispielsweise die (allgemein hydrophob) Farbstoff an einen hydrophilen Bereich angebracht ist, beispielsweise der DNA. Anwendung des meanpos-iso - Modell führt zu einer weiteren Reduzierung der Größe der glaubwürdige Volumen um einen Faktor von etwa zwei. Jedoch ist ein Farbstoff an ein Protein gebunden könnte reversibel an mehrere hydrophobe Stellen in seiner sterisch zugänglichen Volumen (AV) binden. Ein Fluorophore , die zwischen diesen Bereichen sofort schaltet, aber innerhalb einer Region Bewegung freie Rotation und schnell lokalisiert erfährt man am besten durch die var-meanpos-iso - Modell beschrieben. Für eine ähnliche Situation , in der der Farbstoff nicht frei , die var-meanpos Modell gilt zu drehen. Mehr d etails über diese Modelle finden Sie in unseren kürzlich erschienenen Publikation 32. Diese Modelle bieten ein umfangreiches Repertoire an speziell Konto für die verschiedenen Umgebungen ein Farbstoff auftreten können und deren Anwendung optimiert weise seine Lokalisierungsgenauigkeit. In der Fast-NPS kann jedes Farbstoffmolekül an eine bestimmte Position an einem einzelnen Modell zugeordnet werden, so dass FRET-Partner verschiedene Modelle haben dürfen. Dies ermöglicht unbegrenzt und in der Nähe zur Natur Modellierung. Allerdings ist es wichtig, dass eine strenge statistische Tests durchführt, um sicherzustellen, dass das Ergebnis durch das endgültige Modell Kombination erhalten wird, ist immer noch in Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Diese Tests werden in der Fast-NPS-Software enthalten. Um eine schnelle-NPS auf experimentelle Daten anzuwenden, um die Messung von (nur) drei Eingangsparameter benötigt. Zunächst wird der Farbstoff-Paar spezifische isotropen Förster Radien (/54782/54782eq5.jpg "/&gt;) Ermittelt werden müssen. Daher ist die Quantenausbeute (QY) des Donor-Farbstoff kann die Donor-Fluoreszenz-Emissionsspektren und die Akzeptor-Absorptionsspektren gemessen werden müssen. Können diese Messungen durchgeführt in bulk, ein Standard - Spektrometer und einer Standardfluoreszenzspektrometer verwendet wird . Für jedes Paar der R 0 wird dann das Freeware PhotochemCAD berechnet und kann in dem NPS - Analyse verwendet werden. Darüber hinaus können die (zeitaufgelöste) Fluoreszenz Anisotropien der Farbstoffmoleküle benötigen erhalten unter Verwendung einer Polarisation (und Zeit) empfindlichen Fluoreszenzspektrometer. Allerdings sind die wichtigsten Eingangsparameter für Fast-NPS sind die smFRET Effizienzen auf einem Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie Einrichtung, wie zum Beispiel ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop (TIRFM) gemessen werden . Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll für smFRET Daten zu erhalten und die Anwendung Schnell-NPS (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Flowchamber preparation</td></tr><tr><td>Kundenspezifischer Metall-Probenhalter</td><td>selbstgebaute</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Quarzglas-Objektträger, 76&nbsp; mm x 26&nbsp; mm</td><td>Deckgläser aus technischem Glas</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>, 60 mm x 24&nbsp; mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>Waschmittel, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser aus Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto Plasmareiniger</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)-triethoxysilan, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Methoxy-PEG-Succinimidylvalerat, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes PEG-Succinimidylvalerat, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbiocarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dichtungsfolie (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Flexible Silikonschläuche, 0,8&nbsp; mm ID, 2,4&nbsp; mm AD</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>Fine-Bore Polyethylen Tubing, 0,58 mm ID, 0,96 mm OD (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>diodengepumpter Festkörperlaser, 491 nm, Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>Diodenlaser 643 nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td> dichroitischer Spiegel<td></td></tr><tr><td>, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>dichroitischer Spiegel, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>akustooptischer abstimmbarer Filter</td><td>AA Opto-Elektronische</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>plankonvexe Zylinderlinse, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>plankonkav zylindrisch, f = -300&nbsp; mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma, PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>Fokussierscheibe, f = 75&nbsp; mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatur</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 Schrittmotoren, Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>piezoelektrischer Aktuator, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IR Diodenlaser</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>Teil des Autofokus-Systems</td></tr><tr><td>dichroitischer Spiegel, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>Positionsdetektor (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>Teil des Wasserimmersionsobjektivs des Autofokussystems</td></tr><tr><td>, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>dichroitischer Spiegel, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>Teil des</td></tr><tr><td>Emissionsweg-Emissionsfilters, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>grüner Kanal der Emissionsfilter des Emissionspfads</td></tr><tr><td>, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>roter Kanal in der EMCCD-Kamera des Emissionspfads</td></tr><tr><td>, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Sonstiges</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>UV-VIS-Spektrometer</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>Fluoreszenzspektrometer</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Andor</td><td></td><td>Steuerungssoftware für die EM-CCD-Kamera</td></tr><tr><td>Apt user utility&nbsp; (V1.022)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Steuerungssoftware für die Piezomotoren</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive 68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Kleber</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nilrot</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>avidinbeschichtete fluoreszierende Multispec-Kügelchen&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>technische Rechensprache für custon geschriebene Software</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>wissenschaftliche Grafik- und Datenanalysesoftware</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>Absorptionsküvette von 1&nbsp; cm Schichtdicke</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>Fluoreszenzküvette mit 3 mm Schichtdicke</td></tr></tbody></table>

strukturelle informationen vom einzelmolekül-fret-experimente unter verwendung des fast nano-positionierungssystem

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) kann verwendet werden, um strukturelle Informationen über biomolekulare Komplexe in Echtzeit zu erhalten. Dabei werden mehrere smFRET-Messungen verwendet, um eine unbekannte Farbstoffposition innerhalb eines Proteinkomplexes mittels Trilateration zu lokalisieren. Um quantitative Informationen zu erhalten, verwendet das Nano-Positioning System (NPS) die probabilistische Datenanalyse, um Strukturinformationen aus der Röntgenkristallographie mit Einzelmolekül-Fluoreszenzdaten zu kombinieren, um nicht nur die wahrscheinlichste Position, sondern die vollständige dreidimensionale Wahrscheinlichkeitsverteilung, die als posterior bezeichnet wird, zu berechnen, die die experimentelle Unsicherheit anzeigt. Das Konzept wurde für die Analyse von smFRET-Netzwerken verallgemeinert, die zahlreiche Farbstoffmoleküle enthalten. Die neueste Version von NPS, Fast-NPS, verfügt über einen neuen Algorithmus, der die Bayes'sche Parameterschätzung auf der Grundlage von Markov-Chain-Monte-Carlo-Sampling und paralleler Temperierung verwendet und die Analyse großer smFRET-Netzwerke in vergleichsweise kurzer Zeit ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht Fast-NPS die Berechnung des posterioren Wertes, indem für jeden Farbstoff eines von fünf verschiedenen Modellen ausgewählt wird, die das unterschiedliche räumliche und Orientierungsverhalten der Farbstoffmoleküle aufgrund ihrer lokalen Umgebung berücksichtigen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zum Abrufen von smFRET-Daten und zum Anwenden des Fast-NPS. Wir geben eine detaillierte Anleitung für die Erfassung der drei Eingangsparameter von Fast-NPS: die smFRET-Werte, sowie die Quantenausbeute und Anisotropie der Farbstoffmoleküle. In jüngster Zeit wurde der NPS verwendet, um die Architektur eines archaealen offenen Promotor-Komplexes zu verdeutlichen. Diese Daten werden verwendet, um den Einfluss der fünf verschiedenen Farbstoffmodelle auf die posteriore Verteilung zu demonstrieren.

Transcription ist der erste Schritt in der Genexpression in allen Organismen. In Archaea, Transkription wird durch einen einzelnen RNA-Polymerase (RNAP) durchgeführt. Im Vergleich zu Eukaryoten trägt der Archaea RNAP eine auffallende strukturelle Ähnlichkeit mit ihren eukaryotischen Kollegen während eine einfachere Transkriptionsmaschinerie hat. Somit kann Archaea als Modellsystem verwendet werden, um eukaryotische Transkriptionsinitiations durch RNA-Polymerase II (Pol II) studieren. Vor kurzem hat die gesamte Architektur der Archaea-RNA-Polymerase offenen Komplex wurde von Einzelmolekül-FRET und NPS bestimmt. Die Daten von NPS-Analyse verwendet wurde, ein Modell des gesamten Archaea offenen Promotorkomplex zu bauen, die nützliche Einblicke in den Mechanismus der Initiation der Transkription zur Verfügung stellt. Um diese Struktur zu verdeutlichen, wurden smFRET Effizienzen zwischen unbekannten Antennenfarbstoffmoleküle gemessen im offenen Promotor com befindetplex und mehrere bekannte Satelliten - Farbstoffmoleküle , die an fünf Referenzstandorte in der RNAP aufgenommen wurden, deren Positionen aus kristallographischen Strukturen bekannt sind (PDB-ID: 2WAQ) 37. Die Antennenfarbstoffe wurden auf der nicht-Matrizen-DNA, um entweder an verschiedenen Positionen angebracht, TFB, TBP oder TFE. Der komplette Netzwerk in dieser Studie verwendet wurde, bestand aus mehr als 60 gemessenen Abstände. 7 zeigt das Modell des kompletten Archaea offenen Promotorkomplex aus dem NPS - Analyse gebaut. Es umfasst die doppelsträngigen Promotor DNA (hell- und dunkelblau), die RNA-Polymerase (grau) und die Transkriptionsinitiationsfaktoren TBP (lila), TFB (grün) und TFE (gelb). Das Modell ist mit den Ergebnissen aus der NPS-Analyse überlagert, die glaubwürdige Bände, die das klassische Modell (A) berechnet wurden, dem ISO-Modell (B), der meanpos-iso-Modell (C), der var-meanpos-iso-Modell (D) und die var-meanpos Modell (E). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow der Erfassung und Verarbeitung der Parameter für die Fast-NPS Berechnung benötigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg"> Abbildung 2: Beispielhafte Fluoreszenzintensität Zeitspur eines smFRET Ereignis. Die Fluoreszenzintensitäten des Spenders (grün) und dem Akzeptor-Molekül (rot) für die drei charakteristischen Phasen zeigt, nämlich I: smFRET, II: Donor-Fluoreszenz nach Acceptor Photobleaching, III: Hintergrundfluoreszenz nach Spender Photobleaching.g2large.jpg "target =" _ blank "&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg"> Abbildung 3: Schematische Darstellung der Strömungskammer für smFRET Experimente. Die Strömungskammer ist mit Acrylglashalter auf einem angepassten Metallhalterung montiert. Das Sandwich-Konstruktion der Strömungskammer besteht aus einem Quarzglas (fused silica) mit zwei Löchern zur Befestigung gleiten Eintritts- und Austrittsrohr, eine Siegelfolie und Deckglas, das die Strömungskammer schließt. Das Prisma für TIRF-Beleuchtung auf die untere Hälfte der Strömungskammer montiert. Hohl Registerkarte Schrauben stellen die Ein- und Auslässe für die Strömungskammer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img> alt = "4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /&gt; Figur 4: Herstellung des Quarzglasschieber und dem Dichtungsfilm. Mechanisches Ziehen des Schiebers Quarzglas, die die Positionen der Löcher (angegeben in Millimeter). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg"> Abbildung 5: Mechanische Zeichnung der Strömungskammer. Die Maßnahmen für die Aluminium-Prismenhalter, Acrylglashalter und Aluminium Einbaurahmen sind in Millimeter angegeben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ild 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/&gt; Abbildung 6: Schematische Darstellung der für smFRET Experimente verwendet TIRF - Setup Prisma-Typ ist . Abkürzungen für optische Komponenten: A, Blende; DM, dichroitische Spiegel; F, Emissionsfilter; L, Linse; M, Spiegel; O, Ziel; P, Prisma; PSD, positionsempfindlichen Photodiode; S, Probe; PS, Positioniertischs; T, Teleskop. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg"> Abbildung 7: Simulationsergebnisse der verschiedenen Modellannahmen. Alle Bilder zeigen die Archaea-RNA-Polymerase (PDB-ID: 2WAQ, Ansicht von oben) zusammen mit dem Modell für die Promotor-DNA (tDNA und ntDNA in Blau und Cyan, beziehungsweise), TBP (lila), TFB (grün) und TFE (gelb)in der Archaea öffnen Komplex 30. Die glaubhafte Volumina werden für die NPS Simulationsergebnisse von (A) das klassische Modell, (B) das ISO - Modell, (C) die meanpos-iso - Modell, (D) das Modell var-meanpos-iso lagert und (E) var -meanpos Modell. Alle Bände sind bei 68% Glaubwürdigkeit gezeigt. Die klassische und die var-meanpos Netzwerke stehen im Einklang mit den smFRET Daten. Im Gegensatz dazu Netzwerken, in denen für alle Farbstoffe die iso, meanpos-iso oder die var-meanpos-iso-Modell wird mit den gemessenen Daten inkonsistent gewählt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir stellen den Aufbau und das experimentelle Verfahren vor, um smFRET-Daten aus großen Donor-Akzeptor-Netzwerken mit einem TIRF-Mikroskop zu erhalten. Die Schritt-für-Schritt-Analyse dieser Messungen mit der Bayes'schen Inferenzsoftware Fast-NPS liefert durch die Anwendung angepasster Farbstoffmodelle hochaufgelöste Strukturinformationen.

Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Das übergeordnete Ziel des Fast Nano-Positionierungssystems ist es, Echtzeit-Strukturinformationen von Biomolekülen bereitzustellen, indem Einzelmolekül-FRET-Experimente mit strengen statistischen Analysen kombiniert werden. Diese Methode beantwortet Schlüsselfragen im Bereich der Strukturbiologie, wie z.B. die Lokalisierung flexibler Domänen in Makromolekülen, wo Standardwerkzeuge der Strukturbiologie nicht angewendet werden können. Die wesentliche Verbesserung des schnellen NPS im Vergleich zu anderen FRET-basierten Strukturwerkzeugen besteht darin, dass verschiedene Farbstoffmodelle nicht nur anhand der wahrscheinlichsten Positionen, sondern auch anhand einer dreidimensionalen Wahrscheinlichkeitsverteilung verglichen werden können.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Strukturdaten aus der Proteindatenbank mit quantitativen Einzelmolekül-Fluoreszenzmessungen kombiniert. Um den Vorgang zu starten, bauen Sie eine Durchflusskammer und einen Probenhalter zusammen. Um die Einlass- und Auslassschrauben vorzubereiten, schrauben Sie den Silikonschlauch in die Hohllaschenschrauben und schneiden Sie den Schlauch an beiden Enden mit einer Rasierklinge gerade ab.Schrauben Sie die Laschenschrauben an den Probenhalter. Richten Sie die Quarzschiebelöcher der Durchflusskammer an den Gewinden des Probenhalters aus. Ziehen Sie die Schrauben des Glashalters vorsichtig fest, um die Durchflusskammer zu fixieren.Schrauben Sie 20 Zentimeter lange Stücke Silikonschlauch in die Ein- und Auslassschrauben. Waschen Sie die Durchflusskammer mit 500 Mikrolitern PBS. Spülen Sie dann die Durchflusskammer mit 100 Mikrolitern Neutravidinlösung in PBS, wobei Sie darauf achten, dass sich am Ende des Einlassschlauchs ein Tröpfchen bildet, um zu verhindern, dass Luft in die Probenkammer eindringt.Klemmen Sie den Einlass- und Auslassschlauch nach jeder Manipulation zu, um Luft aus der Durchflusskammer auszuschließen. Inkubieren Sie die Kammer 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Neutravidin-Lösung mit 500 Mikrolitern PBS aus.Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Prisma und schrauben Sie das Prisma auf die Probenkammer. Die Einzelmolekül-FRET-Daten werden mit einem Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Starten Sie die Kamerasoftware und die Piezomotor-Software der Bühne.Montieren Sie die Kammer horizontal, so gerade wie möglich und so, dass sie alle drei Laser schneidet, auf dem Mikrometertisch des TIRF-Mikroskops. Fügen Sie Immersionsflüssigkeit hinzu und fokussieren Sie das Mikroskopobjektiv, indem Sie die IR-Reflexionen überprüfen. Legen Sie die Kameraparameter, den Dateipfad und die Parameter für die automatische Inkrementierung fest.Starten Sie den Live-Kamera-Feed und bleichen Sie die Hintergrundfluoreszenz mit allen drei Lasern mit voller Intensität. Verringern Sie dann die Laserintensitäten. Laden Sie dann 100 Mikroliter einer fluoreszierenden Bead-Lösung in die Kammer.Warten Sie 10 Minuten, bis sich die Kügelchen an der Kammeroberfläche festgesetzt haben. Nehmen Sie einen Film mit einem Sichtfeld von 50 bis 100 Kügelchen auf und führen Sie eine Batch-Analyse mit einer hohen Peak-Findungsschwelle durch. Laden Sie die Filmdatei und wählen Sie zwei Perlen mit unterschiedlichen Mittelpunkten an gegenüberliegenden Ecken des Sichtfelds aus.Wählen Sie die Pixel mit der maximalen Intensität in diesen Perlen aus. Entfernen und reinigen Sie das Prisma. Bereiten Sie eine zweite Probenkammer vor und schrauben Sie den Prismenhalter auf die Kammer.Montieren Sie die Kammer auf dem Mikrometertisch. Laden Sie dann 100 Mikroliter einer 50 bis 100 pikomolären Lösung einer biotinylierten fluoreszenzmarkierten Probe in die Kammer. Warten Sie, bis sich die Moleküle an die Kammeroberfläche gebunden haben.Klicken Sie gleichzeitig auf Signal nehmen, um die Aufzeichnung zu starten und den Donoranregungslaser einzuschalten. Passen Sie die Laserleistung an, um sicherzustellen, dass mindestens 80 % der Moleküle im Sichtfeld gebleicht sind. Bewegen Sie dann die Kammer, um einen ungebleichten Bereich zu zeigen, und nehmen Sie den nächsten Film auf. Bleichen Sie den Rest der Probenkammer auf diese Weise.Nach den Messungen am TIRF-Mikroskop müssen die erfassten Einzelmolekül-FRET-Daten analysiert werden, um die mittlere FRET-Effizienz zu erhalten. Führen Sie eine Batch-Analyse der Spender- und Akzeptorfilme der Probe durch. Laden Sie dann die gestapelten Filmdateien in die Datenanalysesoftware.Klicken Sie auf die Schaltfläche NOT Selected, um die einzelnen FRET-Phasen anzuzeigen. Klicken Sie auf den Beginn der FRET-Periode, dann auf den Zeitpunkt, an dem die Akzeptorintensität aufgrund des Bleichens abnimmt, und schließlich auf den Zeitpunkt, an dem die Spenderintensität aufgrund des Bleichens abnimmt. Wählen Sie im nächsten Fenster Ja aus, um die ausgewählte FRET-Effizienzkurve beizubehalten.Sobald jedes Molekül analysiert wurde, speichern Sie die Spuren und analysieren Sie den nächsten Film. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, führen Sie ein Skript aus, um die FRET-Ergebnisse zu kombinieren. Importieren Sie die kombinierte frameweise FRET-Datei mit der Standardeingabeoption in eine Datenanalysesoftware.Plotten Sie die Daten als Histogramm, und verwenden Sie das Werkzeug zur nichtlinearen Kurvenanpassung, um sie an einen Gaußschen Histogramm anzupassen. Der Überschreitungswert ist der wichtigste FRET-Wirkungsgrad. Verwenden Sie UV-VIS und Fluoreszenzspektroskopie, um den isotropen Forster-Radius und die stationären Anisotropiewerte für jeden Farbstoff zu bestimmen.Das Nano-Positionierungssystem wurde vom bekannten GPS inspiriert, da wir eine unbekannte Position, die Antenne, mit mehreren bekannten Positionen, den Satelliten, lokalisieren. Um die NPS-Analyse zu starten, starten Sie die FastNPS-Software und erstellen Sie eine neue Auftragsdatei. Um die Positionsprioren der beschrifteten Antennen und Satelliten zu definieren, geben Sie im Fenster ModelDyePrior die räumliche Auflösung der zu definierenden Position ein.Schließen Sie das Innere des Makromoleküls aus, indem Sie die entsprechende zentrierte PDB-Datei laden. Geben Sie den Farbdurchmesser und den Skelettierungsabstand ein. Geben Sie die minimalen und maximalen Positionskoordinaten der möglichen Färbeposition ein.Wenn es sich bei der zu definierenden Position um einen Satelliten handelt, wählen Sie Farbstoffanbindung über flexiblen Linker und geben Sie die Atomkoordinaten aus der zentrierten PDB-Datei ein. Geben Sie die Länge und den Durchmesser des Linkers ein. Klicken Sie auf Verfügbares Volumen berechnen, speichern Sie die vorherige Position und exportieren Sie sie zur Visualisierung.Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Satelliten und Antennen. Nachdem Sie die Positionen definiert haben, öffnen Sie das Fenster Messung definieren und erstellen Sie ein neues Farbstoffmolekül. Laden Sie die Position, die diesem Farbstoff zuvor zugeordnet ist.Geben Sie die Fluoreszenzanisotropie ein, wählen Sie ein geeignetes Farbstoffmodell aus und aktivieren Sie den Farbstoff. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Farbstoffe definiert sind. Erstellen Sie dann eine neue Messung.Wählen Sie ein FRET-Paar aus den definierten Farbstoffen aus. Geben Sie die Einzelmolekül-FRET-Effizienz mit Fehler und den isotropen Forster-Radius dieses Farbstoffpaares ein und aktivieren Sie die Messung. Wiederholen Sie dies für alle Farbstoffpaare.Öffnen Sie als Nächstes das Berechnungsfenster. Wenn Farbstoffe verschiedenen Modellen zugewiesen wurden, wählen Sie Benutzerdefiniert. Andernfalls wählen Sie das Modell aus, das für alle Farbstoffe verwendet werden soll.Führen Sie die Berechnung durch und öffnen Sie das Ergebnisfenster. Bei der Verwendung von FastNPS ist es wichtig, daran zu denken, die Modelle für alle Farbstoffe anzupassen, um die glaubwürdigen Volumina zu minimieren und gleichzeitig natürlich konsistent zu bleiben. Wenn die Konsistenz niedriger als 90 % ist, klicken Sie auf Detaillierte Konsistenz und identifizieren Sie die Farbstoffe, die in Einträgen mit einer Konsistenz von weniger als 90 % vorkommen.Öffnen Sie das Fenster Messung definieren und ändern Sie das Modell des betreffenden Farbstoffs. Führen Sie die Berechnung im Modus Benutzerdefiniert erneut aus. Exportieren Sie die glaubwürdigen Mengen der Farbstoffe einzeln oder als Charge.Öffnen Sie die Dichtedateien in der Visualisierungssoftware und stellen Sie die Glaubwürdigkeit auf das gewünschte Niveau ein. Die Effizienz von Einzelmolekül-FRETs wurde zwischen unbekannten Antennenmolekülen und mehreren bekannten Satellitenmolekülen innerhalb eines offenen Promotor-Komplexes der archaealen RNA-Polymerase gemessen. Die NPS-Analyse dieser Daten bestimmte die glaubwürdigen Volumina dieser Farbstoffmoleküle im Verhältnis zum offenen Promotor-Komplex der archaealen RNA-Polymerase.Fünf verschiedene Modelle, in denen die Farbstoffmoleküle verwendet wurden, und die Ergebnisse wurden verglichen. Die glaubwürdigen Volumina stimmten mit den gemessenen Daten überein, wenn sie mit Modellen berechnet wurden, die davon ausgingen, dass sich der Farbstoff nur innerhalb eines Kegels unbekannter Ausrichtung frei drehen kann. Vor allem das klassische Modell ist am konservativsten, da es weiter davon ausgeht, dass sich der Farbstoff an einem festen Ort befindet.Dadurch entsteht ein relativ großes glaubwürdiges Volumen, aber das Volumen umschließt in der Regel die richtige Position. Modelle mit höherer Präzision gehen davon aus, dass sich der Farbstoff während seiner Fluoreszenzlebensdauer völlig frei drehen kann. Das Iso-Modell geht wie das klassische Modell davon aus, dass sich der Farbstoff an einer festen Position innerhalb des zugänglichen Volumens befindet.Das meanpos-iso-Modell geht von einer dynamischen Mittelung über alle möglichen Positionen aus. Während die glaubwürdigen Volumina der ISO-Modelle viel kleiner sind als die von den Nicht-ISO-Modellen berechneten, sind sie inkonsistent mit den gemessenen Daten. Wir wollten eine Technik entwickeln, die es uns ermöglicht, dynamische Strukturinformationen von transienten Komplexen zu erfassen, ein Problem, das mit bestehenden Strukturwerkzeugen nicht gelöst werden konnte.Sobald die Einzelmolekül-FRET-Daten aufgezeichnet wurden, ist die FastNPS-Analyse in wenigen Stunden abgeschlossen, was einen schnellen Vergleich verschiedener Farbstoffmodelle ermöglicht. Im Anschluss an dieses Verfahren können nachträglich weitere Methoden wie MD-Simulationen durchgeführt werden, um strukturierte Modelle zu erhalten, die mit experimentellen Einzelmolekül-FRET-Daten konsistent sind.

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Eine Methode zur Untersuchung der Struktur eines Protein-Photorezeptors mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) wird in diesem Artikel beschrieben. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) zeigt intakte Proteindimere auf einer Glimmeroberfläche.

Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Ein Protokoll zur kovalenten Kopplung einer Vielzahl von Einzelmolekülen an eine AFM-Spitze wird vorgestellt. Es werden Verfahren und Beispiele zur Bestimmung der Adhäsionskraft und freien Energie dieser Moleküle auf festen Trägern und Bio-Grenzflächen vorgestellt.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Vor kurzem wurde eine Reihe von FRET-basierten Kraft-Biosensoren entwickelt, die die proteinspezifische Auflösung der intrazellulären Kraft ermöglichen. In diesem Protokoll zeigen wir, wie einer dieser Sensoren, der für den Linker des Nukleoskelett-Zytoskelett (LINC)-Komplexproteins Nesprin-2G entwickelt wurde, zur Messung von Aktomyosinkräften auf den nukleären LINC-Komplex verwendet werden kann.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

Ein Protokoll für hochpräzise FRET-Experimente auf der Ebene der einzelnen Moleküle wird hier vorgestellt. Zusätzlich kann diese Methodik verwendet werden, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Die Bestimmung von präzisen Abständen ist der erste Schritt zum Aufbau von Strukturmodellen auf der Basis von FRET-Experimenten.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Die zeitaufgelöste Einzelmolekül-Protein-induzierte Fluoreszenzverstärkung ist ein nützlicher fluoreszenzspektroskopischer Näherungssensor, der empfindlich auf lokale Strukturveränderungen in Proteinen reagiert. Hier zeigen wir, dass es verwendet werden kann, um stabile lokale Konformationen in α-Synuclein aufzudecken, das auch als globulär unstrukturiert und instabil bezeichnet wird, wenn es mit dem FRET-Lineal mit größerer Reichweite gemessen wird.

Verwendung einer zeitaufgelösten proteininduzierten Fluoreszenzverstärkung zur Identifizierung stabiler lokaler Konformationen jeweils α-Synuclein-Monomer

Dieser Artikel stellt eine Methode zur raumzeitlichen Analyse von mobilen, einzelmolekularen Förster-Resonanz-Energietransfer-basierten (smFRET)-basierten Sonden mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie vor. Das neu entwickelte Software-Toolkit ermöglicht die Bestimmung von smFRET-Zeitspuren bewegter Sonden, einschließlich der korrekten FRET-Effizienz und der molekularen Positionen, als Funktionen der Zeit.

Automatisierte zweidimensionale raumzeitliche Analyse mobiler Einzelmolekül-FRET-Sonden

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Rasterkraftmikroskopie und der nanoskaligen Infrarotspektroskopie zur Bewertung der Leistungsfähigkeit der photothermischen nanoskaligen Infrarotspektroskopie bei der Charakterisierung dreidimensionaler multipolymerer Proben.

Fortschritte in der nanoskaligen Infrarotspektroskopie zur Erforschung mehrphasiger Polymersysteme

Hier stellen wir das Protokoll vor, um die lokale Flexibilität und Dynamik von Biomolekülen unter Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenzanisotropie auf Einzelmolekülebene im konfokalen Mikroskopiemodus zu untersuchen.

Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie von einzelnen Molekülen zur Charakterisierung der lokalen Flexibilität in Biomolekülen

Erfahren Sie, wie Sie strukturelle Informationen von Einzelmolekül-FRET-Experimenten mit dem Fast Nano-Positionierungssystem gewinnen. Diese Methode lokalisiert flexible Domänen in Biomolekülen mit dreidimensionaler Wahrscheinlichkeitsverteilung.

Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Weitere Videos entdecken