SILAC Based Proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1-infizierten Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das exosomale Proteom aus HIV-1-infizierten Zellen zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfrage im Bereich der Exosomenbiologie zu beantworten, wie z.B. den Einfluss äußerer Belastungen auf die Zusammensetzung des Exosomenproteoms. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auch mit einem begrenzten Hintergrund in Proteomik und Exosomenbiologie erlernt werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die HIV-Infektion geben kann, kann sie auch auf andere Krankheitsstudien wie bakterielle Infektionen angewendet werden. In diesem Experiment wird die H9-Zelllinie verwendet, obwohl verschiedene Zelllinien verwendet werden können, solange sie sich im aktiv proliferierenden Stadium befinden und anfällig für die gewünschte Testbedingung sind. Säen Sie zweimal 10 bis zur sechsten Stufe neun Zellen in jeweils zwei Zellkulturflaschen.

Züchten Sie eine Population in 10 Millilitern markiertem Medium, das 10 % stilisiertes FBS, 100 Milligramm pro Liter C13-markiertes L-Lysin und 100 Milligramm pro Liter C13- und N15-markiertes L-Arginin enthält. Züchten Sie die andere Population in 10 Millilitern unmarkiertem Medium mit 10 % stilisiertem FBS, L-Lysin und L-Arginin. Züchten Sie die Zellen für sechs Verdopplungen, wobei die Proteine der Zellen im markierten Medium zu mehr als 99 % mit schweren Aminosäuren markiert sind.

Fügen Sie je nach Zelltyp in regelmäßigen Zeitabständen neue Medien hinzu oder wechseln Sie das Medium. Erhöhen Sie am Ende der Markierung das Kulturvolumen auf 30 Milliliter, um das Wachstum von mehr Zellen zu ermöglichen. Infizieren Sie die markierten Zellen mit dem NL4-3-Stamm von HIV-1 unter Verwendung eines Standard-HIV-1-Infektionsprotokolls.

Geben Sie eine angemessene Menge Virus zu den Zellen und inkubieren Sie 48 Stunden lang, während die unmarkierten Zellen in unmarkiertem Medium ohne HIV-1-Infektion weiter wachsen. Am Ende der HIV-1-Infektion werden die Überstände aus beiden Zellpopulationen für die Exosomenisolierung entnommen. Die Überstände der Kulturen werden in konischen 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt, wobei die Zellen vermieden werden.

Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 mal g und vier Grad Celsius, um die verbleibenden Zellen zu entfernen. Die Überstände werden in neuen konischen 50-Milliliter-Röhrchen aufgefangen und 10 Minuten lang bei 2.000 g zentrifugiert, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Übertragen Sie die entstehenden Überstände in handelsübliche rotorkompatible Röhrchen, die einer Ultrazentrifugation standhalten.

Achten Sie darauf, die Ultrazentrifugenröhrchen auszubalancieren. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 10.000 g g, um Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie die Überstände in neuen Ultrazentrifugenröhrchen.

70 Minuten lang bei 100.000 mal g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. Jedes exosomenreiche Pellet wird in fünf Millilitern frischem PBS resuspendiert und die Lösung in ein frisches Ultrazentrifugenröhrchen überführt.

Erneut 70 Minuten bei 100.000 mal g zentrifugieren. Nach der letzten Drehung wird der Überstand abgelegt. Die Zellpellets sind nun bereit für die Proteinextraktion.

Um dieses Verfahren zu beginnen, lösen Sie jedes isolierte exosomale Pellet in 100 bis 200 Mikrolitern fer-pa-lai-ses und Extraktionspuffer mit zugesetzten Proteaseinhibitoren auf, die eine vollständige Palette von Proteasen hemmen können. Zentrifugieren Sie die gelösten Lösungen 10 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius. Die geklärten Überstände werden in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Nach der Quantifizierung der Proteinkonzentration jeder Probe durch Standardassays mischen Sie gleiche Mengen an Proteinen aus den markierten und unmarkierten Proben. Lassen Sie die gleiche Mischung 30 Minuten lang auf ein vier bis 20%iges SDS-PAGE-Gel auflaufen. Das Gel mit Coomassie blue färben und anschließend entfärben.

Schneiden Sie mit einer Rasierklinge die Probenspur aus dem Gel heraus und schneiden Sie die Gelbahn dann in 10 bis 15 gleiche Stücke. Geben Sie jedes Stück in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, also insgesamt 10 bis 15 Röhrchen, und fahren Sie mit dem Proteinextraktionsverfahren fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Verfahren zur proteomischen Datenanalyse werden nicht demonstriert, sondern in diesem Flussdiagramm zusammengefasst.

Die extrahierten Proteine werden zunächst mittels Flüssigchromatographie, Tandem-Massenspektroskopie, analysiert und die Qualität der Daten beurteilt. Als nächstes werden die Daten vorbehandelt, indem Proteine entfernt werden, die weniger als zwei quantifizierte Peptide enthalten. Anschließend werden deutlich hoch- und herunterregulierte Proteine identifiziert.

Schließlich werden die Replikate der signifikanten Kandidaten verglichen, um Konsistenz zu erreichen, und die Daten aus allen Replikaten werden zusammengeführt. Um mit der Charakterisierung der identifizierten Proteine zu beginnen, verwenden Sie ihre GenBank-Zugangsnummern oder UniProt-IDs, um mit aktuellen Exosomendatenbanken zu suchen. ExoCarta wird in dieser Demonstration zum Einsatz kommen.

Klicken Sie auf Abfrage und geben Sie entweder den Gen- oder Proteinnamen oder die Zugangsnummer ein. Jeder Nachweis in Exosomen bestätigt, dass die Kandidatenproteine zuvor in Exosomen gefunden wurden, und es fügt eine Vertrauensebene hinzu, dass sich die Kandidaten tatsächlich in Exosomen befinden. Suchen Sie als Nächstes die Kandidaten mit der Datenbank für HIV-1 und menschliche Proteininteraktionen.

Geben Sie im Eintrag für den Protein-Domain-Namen die Namen oder Zugangsnummern des Kandidaten ein und klicken Sie auf Suchen. Die Suchergebnisse können Aufschluss über die Wechselwirkungen zwischen HIV-1 und den Proteinkandidaten geben und Aufschluss darüber geben, welcher der Kandidaten wirklich HIV-1-assoziiert sein könnte. Der dritte Schritt besteht darin, mit Hilfe einer Gen-Ontologie- oder GO-Analysesoftware wie fun-brich einen globalen Einblick in die Kandidaten zu gewinnen.

Klicken Sie unter Anreicherungsanalyse auf Datensatz hinzufügen, laden Sie die GenBank-Zugangsnummern oder UniProt-IDs der Kandidaten hoch und wählen Sie dann den Diagrammtyp aus, um die GO-Analyse zu visualisieren. Die Ergebnisse der GO-Analyse werden in Form von Tortendiagrammen visualisiert, die Informationen über die Kandidatenproteine in den Bereichen biologischer Prozess, zelluläre Komponente und molekulare Funktion liefern. Der nächste Schritt besteht darin, statistisch überrepräsentierte GO-Begriffe über die DAVID-Analyse zu identifizieren.

Klicken Sie auf das funktionale Annotationswerkzeug, geben Sie die Kandidatenliste ein und wählen Sie die Kennung des Gens aus, z. B. die UniProt-ID.Genliste auswählen und suchen. Wenn die Suche abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Ergebnisseite der Anmerkungszusammenfassung unter der Kategorie Genontologie, um die angereicherten GO-Begriffe, p-Werte und andere Parameter anzuzeigen. Untersuchen Sie schließlich potenzielle Protein-Protein-Wechselwirkungen und mögliche biochemische Signalwege mithilfe der frei zugänglichen STRING-Datenbank.

Geben Sie die Protein-ID oder -Sequenz in das dafür vorgesehene Suchfeld ein und wählen Sie die richtige Spezies für die Analyse aus. Klicken Sie auf Suchen. Die Ergebnisse geben Aufschluss über direkte und indirekte Assoziationen.

Die Top 10 der bekannten Übereinstimmungen für den exosomalen Kandidaten, die in den Ergebnissen angezeigt werden, sollten für eine signifikante Kandidatenauswahl in Betracht gezogen werden. Gezeigt werden repräsentative Ergebnisse einer DAVID-Analyse eines Satzes von 14 Proteinen. Die biologische Prozessanreicherung deutete darauf hin, dass Zelltodprozesse signifikant angereichert werden.

Die Anreicherung der zellulären Komponenten zeigt viele Proteine intrazellulären Ursprungs, und die Anreicherung der molekularen Funktion identifizierte für die meisten Kandidaten eine Rolle bei der Proteinbindung. Die L-Laktat-Dehydrogenase-B-Kette oder LDHB wurde als signifikantester Kandidat ausgewählt, und die STRING-Analyse identifizierte die Top 10 der interagierenden Partner von LDHB. Die Mehrheit der LDHB-Partner war auch funktionell und örtlich mit Exosomen bei HIV-1 verwandt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Schritt bei der richtigen Temperatur und unter den richtigen Bedingungen durchzuführen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie z.B. die Affinitätsisolierung durchgeführt werden, um die Vorhersagen der bioinformatischen Analyse zu bestätigen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forschungen auf dem Gebiet der Exosomen, um die Veränderungen des exosomalen Proteoms im Zusammenhang mit HIV-1-Infektionen in der Biologie zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Exosomen aus Zellkulturen isoliert, ihre Proteome analysiert und ihre Assoziation mit HIV untersucht. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV oder anderen Infektionserregern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.