Name: Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Lernen Sie die Herstellung primärer gemischter Gliazellkulturen aus adultem Mäuserückenmark für neurologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Gliazellen bei neuropathischen Schmerzen und Multipler Sklerose.

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Adulte Rückenmarks-Mischkulturen wurden zuerst mit Ratten mit Zuschüssen aus einem NIH/NIDA R01-Preis (PI De Leo) und einem NIH T32-Ausbildungsstipendium (PI Green) entwickelt. Diese Methoden wurden mit Unterstützung der folgenden Zuschüsse weiter für das Rückenmark von Mäusen angepasst: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) und NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Die Autoren danken auch Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, für seine technische Hilfe bei der Gewinnung von mikrogliareichen gemischten Gliazellen.

Das folgende Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität von New England zugelassen. Das folgende Protokoll ist für Glia-Kulturen von 4 erwachsenen Maus Rückenmark vor. 1. Herstellung von Lösungen in einer Kultur Hood unter aseptischen Bedingungen <ol><li> Bereiten Kulturmedien: alle Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (cDMEM), enthaltend DMEM (mit 4,5 g / L Glucose), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 IU / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin , 250 ng / ml Amphotericin B und 50 &amp; mgr; M 2-Mercaptoethanol (2-ME, siehe 1.1.1). Mischen Sie und filtern alle anderen Komponenten zu sterilisieren und dann FBS hinzufügen. Bewahren Sie die Kulturmedien bei 4 o C <ol><li> Bereiten Sie 50 mM 2-ME / Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) Stammlösung: 100 l konzentriert 2-ME (14,3 M) in 28,6 ml 1x PBS und Filter zu sterilisieren (die Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden mehrere Monate). Use 1 ml 2-ME-Stammlösung für jede 1.000 ml Kulturmedien. </li></ol></li><li> Herstellung des Dichtegradientenmedien <ol><li> Bereiten Sie einen Vorrat isotonische Dichtegradientenmedien Lösung (zB 100% Percoll) von 1 Teil 10x regelmäßigen sterilem PBS und 9 Teile sterile Lager Dichtegradientenmedien (zB Percoll). </li><li> Verdünnen Sie die 100% Dichtegradientenmedien (hergestellt in Abschnitt 1.2.1) mit regelmäßigen 1x steriler PBS mit 20% Dichtegradientenmedien zu machen (zB 10 ml 100% Dichtegradientenmedien mit 40 ml 1x PBS) und speichern sie in 4 o C. Bringen Sie die 20% Dichtegradientenmedien auf Raumtemperatur (RT), bevor die Zellkultur vorbereitet. </li></ol></li><li> Herstellung von Lösungen aus dem Papain Dissoziation System ANMERKUNG: Das System Papain Dissoziation in der Werkstoff - Tabelle identifiziert werden. Andere ähnliche Dissoziation kits (einschließlich zusammengebaut in-house) können ebenfalls verwendet werden. Alle components müssen steril sein. <ol><li> In 32 ml Balanced Salt Solution Earle (EBSS) zum Ovomucoid Hemmittelgemisches (Pulver). </li><li> In 5 ml EBSS einem Papain Fläschchen (Pulver). Platzieren Sie die Papain Phiole in einem 37 ° C Wasserbad für 10 min oder bis das Papain aufgelöst wird. </li><li> In 500 ul EBSS einem DNase Fläschchen (Pulver). Vorsichtig mischen. </li><li> In 250 ul der DNase-Lösung (siehe oben) auf die Papain Fläschchen. </li><li> Berechne die Gesamtmenge der oben Papain / DNase-Gemisch benötigt wird (etwa 800 &amp; mgr; l Papain / DNase Mischung pro Rückenmark der Maus) und übertragen die benötigte Mischung in ein 50 ml-Röhrchen für die Gewebeverdauungs (Schritt 3.2). Bewahren Sie die Überbleibsel in der Originalflasche bei 4 ° C für mindestens zwei Wochen. </li><li> Halten Sie alle Komponenten aus den Kits auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Rückenmark Sammelröhrchen: ein steriles 15 ml-Röhrchen mit 5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; von der Papain Dissoziation System,0; für Rückenmark) und einem sterilen 15 ml-Röhrchen mit 1x PBS (zum Auffüllen der 5-ml-Spritze zu sammeln, siehe Schritt 2.4). Darüber hinaus bereiten eine sterile Petrischale (35 mm oder 60 mm) mit 5 ml HBSS und halten es in der Kultur Kapuze. </li></ol> 2. Spinal Cord-Sammlung HINWEIS: Alle Geräte müssen steril sein. Führen Sie die Sammlung in einem bestimmten Bereich durch die IACUC genehmigt. <ol><li> Beziehen Sie die folgenden Werkzeuge für die Ernte Maus Rückenmark: gerade scharf / stumpf 18 cm chirurgische Schere, ein 12-cm-Standard Skalpell (# 3 fest), Kohlenstoffstahl sterile Skalpellklingen # 10, ein kleines Tier Decapitator, 12-cm-Standard gebogen Zange und eine sterile Nadel 20G auf eine 5-ml-Spritze angebracht ist. </li><li> Euthanize das Tier mit CO 2 und desinfizieren Sie die Mauskopf und den hinteren Bereich mit 70% Ethanol (EtOH). </li><li> Enthaupten Tier mit dem Decapitator. Machen Sie einen mittleren Längsschnitt auf der unteren Rückseite der Muskelschicht zu belichten. Macheneine saubere Durchtrennung durch die wirbel Säule an der Hüfte Ebene (auch durch die Muskelschicht schneiden, die die wirbel Säule umfasst) mit den sterilen gerade chirurgische Scheren (18 cm). </li><li> Legen Sie das Tier auf einem Blatt frischen Einweg-Feger. Schieben Sie die 20 G-Nadel (an einer 5-ml-Spritze gefüllt mit sterilem 1x PBS (Schritt 1.4)) in die Wirbelsäule in Richtung der rostralen Seite. Halten Sie das Tier nach unten fest, und drücken Sie schnell die Spritze. Die gesamte Rückenmark sollten aus dem zervikalen Ende kommen. Sammeln Sie das Rückenmark in das 15 ml-Röhrchen mit HBSS. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 für den Rest der Mäuse. Zwischen jedem Tier, Desinfektion aller verwendeten Instrumente mit 70% EtOH. HINWEIS: In der Regel eine einzige 12-Well-Platte für alle 4 Maus Rückenmark festgelegt werden (siehe 4.3). </li></ol> 3. Herstellung der Einzelzellsuspension Hinweis: Führen Sie die Schritte 3 und 4 in einer Kultur Haube alles steril zu halten. <ol><li> Übertragen Sie alle Rückenmark in die HBSS enthaltende Petrischale (Schritt 1.4). Schneiden Sie jede der Rückenmark in viele feine, kleine Stücke mit einer sterilen Schere und Pinzette. Übertragen das Rückenmarksgewebe zu dem 50 ml konischen Röhrchen die vorbereitete Papain / DNase Enzymmischung (Schritt 1.3.5) unter Verwendung einer sterilen Pinzette oder einem 10 ml-Pipette enthält (HBSS vermeiden zu der Enzymmischung hinzufügen, wie dies weiter verdünnt das hergestellte Enzymlösung und zu einer verringerten Leistung des Enzyms führen kann). </li><li> Mischen Sie den Schlauch vorsichtig zu mischen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 1 h in einem Inkubator / Schüttler mit Orbital bei 150 Umdrehungen pro Minute schütteln. </li><li> Vortex das Rohr wieder und kräftig verreiben der Enzymlösung mit dem Gewebe einer 5 ml Pipette weitere Dissoziation zu fördern. </li><li> Übertragen die Zellsuspension in eine 15-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Während der Zentrifugation mischen 2,7 ml EBSS mit 300 &amp; mgr; l der rekonstituierten Albumin-Ovomucoid Einwibitor Lösung (1.3.1) in ein steriles Röhrchen. In 150 ul der DNase-Lösung (Schritt 1.3.3). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand und Zellpellet mit der Lösung oben hergestellt (Schritt 3.5). Vortex gut das Zellpellet zu brechen. </li><li> 3 ml rekonstituiert Albumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung (Schritt 1.4.1) zu der Zellsuspension. Zentrifugen Zellen bei 70 x g für 6 Minuten bei RT. Entfernen Sie den Überstand (die Membranfragmente enthält). </li></ol> 4. Weitere Entfernen von Myelin aus der Einzelzellsuspension <ol><li> 8 ml 20% Dichtegradientenmedien (hergestellt in Schritt 1.2.2) in das Rohr das Zellpellet enthält, vortex sanft das Pellet zu stören, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 · g für 30 min bei RT ohne Bremse. Entfernen Sie vorsichtig die oberste Schicht von Schutt (meist Myelin) und der Überstand, aber das Pellet halten. </li><li> So entfernen Sie Reste des Dichtegradienten, waschen Sie die Zellen durch resuspending des Zellpellets mit 8 ml einer verdünnten cDMEM (1 Teil cDMEM und 2 Teile HBSS). Zentrifugieren der Zellen bei 400 xg für 10 min bei 4 o C. Entfernen Sie den Überstand und wasche die Zellen erneut mit dem verdünnten cDMEM (oben) in der gleichen Weise. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis sie Aussaat. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in Kulturmedien (cDMEM geliefert mit 2-ME (hergestellt in Schritt 1.1)). Für eine 12-Well-Platte, verwenden Sie 3 ml x 4 (Anzahl der verwendeten Mäuse) + 2 ml = 14 ml Medien. Dadurch wird sichergestellt, dass eine ausreichende Zellsuspension für die gesamte Platte (12 Vertiefungen) und wird für zusätzliche Vertiefungen schaffen, die verwendet werden können, die durchschnittliche Zellzahl pro Vertiefung und die Mikroglia-Gehalt der Kultur zu bestimmen. Wenn andere Arten von Kulturgefäßen verwendet werden, die Berechnung der Gesamtmenge der benötigten Kulturmedien proportional. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. </li><li> Inkubieren der Zellen bei 35,9 o C mit 5% CO 2. </li><lÄndern i&gt; die Medien (entfernen alte Medien über Aspiration) auf D 1 und dann alle 3 - 4 d danach (in der Regel die Medien ändern auf D: 1, 4, 8 und 11, und verwenden Sie dann die Zellen am Tag 12). HINWEIS: Am Tag 1 kann das Kultur erhebliche Mengen an Ablagerungen enthalten aufgrund der Rückstand Myelin aus dem Rückenmarksgewebe; also, die Änderung der Medien am Tag 1 wird empfohlen (bitte die Diskussion für weitere Informationen). Kulturen sind bereit für die Behandlung zwischen D 12 - 14. Die Zellen sind in der Regel 80% konfluenten 12 D und kann durch D 14. Typischerweise in der Nähe von 100% konfluent sein, auf D 12, gibt es etwa 100.000 Zellen pro Well in einer 12-Well-Platte . </li></ol><img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Fig . 2: Repräsentative Bilder von gemischten Gliazellen zu verschiedenen Zeiten nach der Errichtung des gemischten Gliazellen Kultur Primärrückenmark wurden gemischt Glia hergestellt aus adulten C57BL / 6 - Mäusen. Repräsentative Bilderzeigen den Fortschritt der Glia-Kultur nach der Plattierung. Am Tag 1 werden einige Zellen auf der Kulturplatte angebracht, aber sie sind immer noch meist rund. Es gibt auch viele Floating-Zellen und erhebliche Rückstände. Am Tag 4 werden die meisten der Zellen auf der Kulturplatte befestigt. Zellen scheinen mit sichtbaren Prozesse verästelte. Die Zellen werden sporadisch verteilt und Kulturen sind etwa 20-30% konfluent zu diesem Zeitpunkt. Am Tag 8 Kulturen sind zwischen 50-60% konfluent. Einige Bereiche der Kulturen haben große Flecken von Zellen. Andere Bereiche der Kulturen sparse Wachstum von Zellen. Einige Zellen innerhalb der Patches nehmen auf einem &quot;Quadrat-like&quot; Aussehen. Am Tag 12 Kulturen werden bei oder über 80% konfluent (ca. 90% konfluent in dem Bild dargestellt). Die Zellen werden in der Log - Phase des Wachstums in dieser Zeit und zwischen den Tagen 12 bis 14 ist die optimale Zeit für die Gliazellen für Experimente verwenden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier anzuschauen</a>Größere Version der Figur. <ol start="7"><li> Untersuche die Mikroglia - Zellen Inhalt aus den zusätzlichen Vertiefungen (4.3 Schritt) über Standard - Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) Färbeprotokoll 11 unter Verwendung der Kombination von Anti-Maus-CD45 und anti-Maus - CD11b unter Verwendung monoklonaler Antikörper. CD45 + CD11b + Zellen werden als Mikrogliazellen identifiziert. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Es ist wichtig, alle Schritte-einschließlich der Medien zur Durchführung plan in einer konsistenten Art und Weise zu ändern, um zu reproduzierbaren Ergebnissen zwischen den Experimenten erhalten. Die folgenden Schritte sind besonders kritisch in ausgezeichneter Qualität erwachsenen gemischten Glia zu erhalten. Die enzymatische Verdauung ist ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls. Entscheidend ist, dass die Gewebestücke sind gut verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Allerdings wi...

Chronische Schmerzen sind ein ernstes gesundheitliches Problem , dass etwa 100 Millionen Erwachsene in den Vereinigten Staaten, mit einem geschätzten jährlichen Kosten von bis zu 635.000.000.000 $ 1 betrifft. Montage Beweise hat einen wesentlichen Beitrag des Rückenmarks Gliazellen bei der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen angegeben, einer der verheerendsten Arten von chronischen Schmerzen 2. Eine geeignete in vitro - Kultursystem würde dazu beitragen , deutlich weiter die Rolle von Gliazellen auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen. Derzeit umfassen die in - vitro - Glia - Kultursystemen von Forschern verwendet hauptsächlich Gliazellen aus Rindengewebe von neugeborenen Maus oder Ratte Gehirn abgeleiteten Zellen und verewigte Linien Gliazellen aus neonatalen Maus abgeleitet oder primäre Gliazellen Ratte. Neonatal Zellen enthalten eine signifikante Anzahl von undifferenzierten Zellen, die in Gliazellen unterschieden werden weiter können (vor allem Astrozyten und Mikroglia), so dass eine Bereitstellung vonbundant Zellen für die experimentelle Verwendung 3. Allerdings hat unsere früheren Studie gezeigt, dass die neonatale Gehirn Gliazellen Rückenmark Gliazellen auf Lipopolysaccharid (LPS) Stimulation signifikant unterschiedlich von Erwachsenen reagiert. Beispielsweise Interleukin (IL) -4 angezeigt verbesserte hemmende Wirkung auf LPS-induzierten Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in adulten Ratten Glia Rückenmark im Vergleich zu neugeborenen Gehirn Glia 4. Des Weiteren sind die Profile der Chemokin - Produktion nach Stimulierung durch ein Neuropeptid, Calcitonin - Gen-verwandtes Peptid (CGRP), unarguably unterschiedlich zwischen neonatalen Mausgehirn Glia (Methods in Ref. 5 beschrieben) und adulten Rückenmark der Maus Glia (Abbildung 1). Etablierte Zelllinien sind leicht zu bedienen und zu warten, und eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeitperiode liefern kann. Im allgemeinen sind immortalisierte Zelllinien erzeugt entweder einen Virus-vermittelte Immortalisierung System (wie beispielsweise die weit verbreiteten Mikroglia - Zelllinie , BV2) 6 unter Verwendung von , 7 oder folgenden the Identifizierung von spontanen Transformation (wie beispielsweise die Astrozyten Zelllinie C8-D1A und Mikroglia - Zelllinie C8-B4) 8, 9 Zellinien sind ausgezeichnet in den molekularen Eigenschaften von Astrozyten und Mikroglia individuell studieren. aber die erhaltenen Ergebnisse aus Zelllinien erfordern immer eine weitere Validierung in primären Zellen oder in in vivo - Bedingungen. Es sollte auch angemerkt werden, dass es keinen Bericht einer glialen Zelllinie wurde, die aus einem Nagetier Rückenmark Gliazellen abgeleitet ist. Um die Rolle des Rückenmarks Gliazellen in der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen untersucht, einem Kultursystem , das aus adulten Rückenmark der Maus abgeleitet ist , wurde durch Anpassung einer zuvor berichteten Verfahren entwickelt worden verwendet erwachsenen Ratte gemischten Gliakulturen 4 erzeugen, 5 . Das Rückenmark glial Kultur Maus wurde weitere kürzlich 10 verfeinert und wird ausführlicher in diesem Artikel beschrieben. Erwachsener Rückenmark gemischt Gliakulturen ceine mit einer Maus aus ausgewählten Stämmen hergestellt werden, die den Bedürfnissen der speziellen Studie passen, und die Zellen können für bis zu 21 d nach Beginn der Kultur in Kultur gehalten werden. Dieses Verfahren kann bei neuropathischen Schmerzstudien verwendet werden, sowie in Untersuchungen von verschiedenen neurologischen Erkrankungen, die pathologischen Veränderungen innerhalb des Rückenmarks, wie amyotropher Lateralsklerose (ALS), human immunodeficiency virus (HIV) -assoziierten sensorische Neuropathie beinhalten, und multiple Sklerose (MS).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modifikation von Eagle" s Medien (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>Bei den cDMEM-Medien handelt es sich um einen weit verbreiteten Standard-Nährmedium. Der einzelne Forscher kann selbst entscheiden, wo er das DMEM und alle anderen Komponenten, die zur Herstellung von cDMEM-Medien verwendet werden, erwerben möchte.</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>Das L-Glutamin ist eine weit verbreitete Standardkomponente für verschiedene Nährmedien. Einzelne Forscher können entscheiden, wo sie L-Glutamin kaufen.</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotische Lösung (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>Dies ist eine Kombination aus Penicillin, Streptomycin und Amphotericin, die so formuliert ist, dass sie 10.000 Einheiten/ml Penicillin G, 10 mg/ml Streptomycinsulfat und 25 & Mikro enthält. g/mL Amphotericin B. Einzelne Forscher können entscheiden, wo sie einzelne Komponenten kaufen.</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>A BioReagenz, geeignet für Zellkultur, Molekularbiologie und Elektrophorese.</td></tr><tr><td>Papain-Dissoziationssystem</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Einzelne Komponenten dieses Kits können separat erworben werden.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll wird als sterile Lösung verkauft. Unverdünntes Percoll kann bei Bedarf erneut autoklaviert werden.</td></tr><tr><td>Inkubator / Schüttler für Laborlinien</td><td>Barstead/Laborlinie</td><td>MaxQ4000&nbsp;</td><td>Dies ist der Inkubator/Shaker, den wir derzeit haben. Stattdessen können auch andere Arten von Shakern verwendet werden.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide, Salmonella Minnesota Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Andere LPS-Stämme können ebenfalls Gliareaktionen hervorrufen. Das Ausmaß der Antworten kann jedoch variieren.</td></tr><tr><td>Maus IL-6 DuoSet ELISA</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>DY406</td><td>Jeder einzelne Forscher kann das ELISA-Kit auswählen, das er bevorzugt.</td></tr><tr><td>Maus TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY410</td><td>Jeder einzelne Forscher kann das ELISA-Kit auswählen, das er bevorzugt.</td></tr><tr><td>Maus IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY466</td><td>Jeder einzelne Forscher kann das ELISA-Kit auswählen, das er bevorzugt.</td></tr><tr><td>Maus MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia Set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Jeder einzelne Forscher kann das ELISA-Kit auswählen, das er bevorzugt.</td></tr><tr><td>Maus-Chemokin Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>Dieses Produkt war zu diesem Zeitpunkt nicht für den internen Assay verfügbar. Stattdessen schickten wir Proben zur Analyse an den Hersteller.</td></tr><tr><td>APC-anti-mouse-CD45 (Klon 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Antikörper des gleichen Klons, aber von anderen Herstellern, kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse-CD11b (Klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Antikörper des gleichen Klons, aber von anderen Herstellern, kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Accuri C6 Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&nbsp;</td><td>Jeder einzelne Forscher kann jedes Durchflusszytometer verwenden, das er oder sie bevorzugt.</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Jeder einzelne Forscher kann jede Analysesoftware verwenden, die er oder sie bevorzugt.</td></tr></tbody></table>

herstellung von primären gemischten gliazellen kulturen von erwachsenen maus rückenmarksgewebe

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Es wurde gut angenommen, dass das Rückenmark glial Reaktionen wesentlich zur Entwicklung von neuropathischen Schmerzen bei. Enorme Informationen über Gliazellen Aktivitäten auf zellulärer und molekularer Ebene wurde durch in - vitro - Zellkultursystemen erhalten. Die in - vitro - Systemen verwendet werden , umfassen vor allem primäre Gliazellen abgeleitet von Neugeborenen Gehirn Rindengewebe und immortalisierten Zelllinien. Jedoch beziehen sich diese Systeme können nicht die Merkmale des Rückenmarks Gliazellen in vivo. Um die Rollen der Rückenmark Gliazellen in der Entwicklung peripherer Nervenverletzung induzierter neuropathischer Schmerz unter Verwendung eines Kultursystems weiter zu untersuchen , die besser auf die in - vivo - Zustand wiedergibt , hat unserem Labor , ein Verfahren zu etablieren primären Rückenmark gemischten Gliakulturen entwickelt von erwachsene Mäuse. Kurz gesagt, werden Rückenmark von erwachsenen Mäusen und verarbeitet durch Papainverdau durch Myelinentfernung mit einem dens gesammelt, gefolgtkeit-Gradientenmedium. Einzelzellsuspensionen werden kultiviert in vollständigen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (cDMEM) , ergänzt mit 2-Mercaptoethanol (2-ME) bei 35,9 o C. Diese Kulturbedingungen wurden speziell für das Wachstum von gemischten Gliazellen optimiert. Unter diesen Bedingungen bereit sind Zellen zwischen 12 für Experimente verwendet werden - 14 d (Zellen sind in der Regel in der log-Phase während dieser Zeit) nach der Einrichtung der Kultur (D 0) und 21 in Kulturbedingungen bis zu D gehalten werden. Dieses Kultursystem kann verwendet werden, um die Reaktionen des Rückenmarks Gliazellen bei Stimulierung mit verschiedenen Substanzen und Wirkstoffe zu untersuchen. Neben neuropathischen Schmerzen, kann dieses System verwendet werden, glial Reaktionen in andere Krankheiten zu studieren, die pathologischen Veränderungen des Rückenmarks Gliazellen beinhalten.

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um gemischte Gliazellen von beiden Mäusen und Ratten herzustellen. Die durchschnittliche Gesamtzellzahl pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte auf D 12 nach Beginn der Kultur sollte relativ stabil sein, mit etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung, wenn die Zellen aus Maus-Rückenmark abgeleitet sind. Gliazellen aus diesem Verfahren erhalten wird, kann in Versuchen verwendet werden, die für Erwachsene glial Rückenmark zu prüfen sollen Antworten auf die Ve...

Die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen handelt pathologischen Veränderungen der Wirbelsäule Gliazellen. Eine zuverlässige Gliazellen Kultursystem aus adulten Rückenmarksgewebe abgeleitet und für diese Zellen in vitro zu studieren fehlt. Deshalb zeigen wir hier, wie primären gemischten Glia-Kulturen von adulten Mausrückenmarksgewebe herzustellen.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, primäre gemischte Gliazellkulturen aus erwachsenen Maus-Rückenmark für In-vitro-Studien zu etablieren. Diese Methode bietet uns ein In-vitro-System, um die Rolle von Gliazellen bei neurologischen Erkrankungen zu untersuchen, die pathologische Veränderungen im Rückenmark beinhalten, wie beispielsweise neuropathischer Schmerz und Multiple Sklerose. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Gliazellkulturen aus dem Rückenmark erwachsener Mäuse gewonnen werden, wodurch ein System entsteht, das die in-vivo-Bedingungen genauer widerspiegelt.Den Vorgang wird Jennifer Malon, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Überführen Sie unter dem Zellkulturhauben vier Maus-Rückenmarke in eine Petrischale mit HBSS. Zerschneiden Sie jedes der Rückenmarke mit sterilen Scheren und Pinzetten in kleine Stücke.Überführen Sie die Gewebestücke anschließend in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das eine Mischung aus Papain und DNAse-Enzym enthält. Vermeiden Sie es, HBSS in die Enzymmischung zu überführen, da dies zu einer verminderten Enzymaktivität führen kann. Es ist entscheidend, dass die Gewebestücke vollständig verdaut werden, u

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Dieses Protokoll beschreibt die Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus fötalem Rückenmark und gehalten in vitro entweder für die Transplantation oder für die Untersuchung von oligodendrocytic Linie.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen...

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Das Video demonstrierte die Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus einem neugeborenen Mäusegehirn. Es beinhaltete die enzymatische und mechanische Dissoziation des Gehirns, gefolgt von der Kultivierung in Wachstumsmedien ohne neuronalen Wachstumsfaktor, um eine gemischte Gliapopulation zu erhalten.

Gewinnung einer gemischten Gliazellkultur aus einem neonatalen Mausgehirn

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von primären gemischten Gliazellen aus adultem Rückenmarksgewebe von Mäusen. Das Protokoll beinhaltet die enzymatische Verdauung des Gewebes, gefolgt von der Entfernung von gebrochenen Zellmembranen und Myelintrümmern, um eine Einzelzellpopulation zu erhalten. Die Zellen werden dann in Medien kultiviert, die für das Wachstum gemischter Gliazellen optimiert sind.

Etablierung primärer gemischter Gliazellkulturen aus dem Rückenmark einer Maus

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen (AdMSCs) haben starke immunmodulatorische Eigenschaften, die bei der Behandlung von Krankheiten, die mit Entzündungen verbunden sind, nützlich sind. Wir zeigen, wie murine AdMSCs und primäre gemischte Gliazellen isoliert und kultiviert, AdMSCs zur Hochregulierung entzündungshemmender Gene und Wachstumsfaktoren stimuliert, die Migration von AdMSCs bewertet und AdMSCs mit primär gemischten Prionen-infizierten Gliazellen co-kultiviert werden.

Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Lernen Sie die Herstellung primärer gemischter Gliazellkulturen aus adultem Mäuserückenmark für neurologische Forschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Gliazellen bei neuropathischen Schmerzen und Multipler Sklerose.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

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