Ein Verfahren zum Extrahieren Pigmente aus Squid Doryteuthis pealeii

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu beschreiben, wie Pigmente extrahiert werden können, die sich in den nanostrukturierten Granulaten von frisch präparierten Tintenfischen, Doryteuthis pealeii chromatophores, befinden. Kopffüßer sind komplexe Meerestiere, die schnelle und anpassungsfähige Veränderungen ihrer Hautfarbe durchlaufen. und adaptive Veränderungen ihrer Hautfarbe.

Es gibt jedoch noch viel Unbekanntes über die Funktionsweise dieser Systeme. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie spezifisch auf die nanostrukturierten Granulate im Chromatophor-Organ abzielt. Auf diese Weise können die Forscher den Mechanismus der Farbveränderung aufklären, der auf der Nanoskala beginnt.

Neben dem Einblick in die Biologie der Kopffüßer kann es das Design von synthetischen Systemen beeinflussen, die so gebaut sind, dass sie den dynamischen Bereich der adaptiven Farbe nachahmen, die bei Kopffüßern unter Verwendung von vorverpackten pigmentierten Nanopartikeln angezeigt wird. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da die Entnahme von reinem Chromatophorgewebe aufgrund seiner Nähe zum umgebenden Gewebe schwierig ist. Unsere Methode ist optimiert, um diese Verunreinigungen zu reduzieren.

Um mit dem Sezieren zu beginnen, gießen Sie zunächst etwa 250 Milliliter gefiltertes Meerwasser in eine Sezierpfanne. Legen Sie ein Exemplar in die Pfanne und schneiden Sie es mit einer geraden Schere aus Edelstahl von der Basis des Bauchmantels entlang der hinteren Seite des Tieres ab und enden Sie im Flossenbereich. Entfernen Sie alle inneren Organe, indem Sie sie vorsichtig mit einer Präparierzange anheben und das Bindegewebe mit der Schere durchtrennen.

Entsorgen Sie die Organe in einem Probenbeutel. Stecke die Mantelflossenseite mit den Präpariernadeln nach oben in das Präparierkissen. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die undurchsichtige epidermale Hautschicht, wobei die chromatophorhaltige Hautschicht intakt bleibt.

Entsorgen Sie die Epidermisschicht in einem Probenbeutel. Entfernen Sie anschließend die Chromatophorschicht. Schneiden Sie das Chromatophorgewebe in kleine Stücke von einem Zentimeter mal einem Zentimeter.

Legen Sie die Schnitte in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie jedes Röhrchen zur Hälfte mit präpariertem Gewebe. Zum Schluss gibst du 500 Mikroliter gefiltertes Meerwasser in die Röhrchen. Um das Pigmentgranulat zu isolieren, zentrifugieren Sie zunächst die Chromatophor-Gewebeschnitte fünf Minuten lang bei 14.000 x g.

Entsorgen Sie die oberste Schicht Meerwasser. Geben Sie 500 Mikroliter Papain-Kollagenase-Lösung zu den Proben und wirbeln Sie ein bis zwei Minuten lang auf höchster Stufe. Als nächstes beschallen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 40 kHz, um die Zellen vom umgebenden Gewebe zu trennen.

Weitere fünf Minuten bei 14.000 x g zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen. Die Zentrifugation wird noch zwei Mal wiederholt, wobei der Überstand jedes Mal verworfen wird. Fügen Sie dann die Resuspension in Kollagenase hinzu.

Verwenden Sie eine Pinzette, um alle verbleibenden großen Gewebeabschnitte, die nicht verdaut wurden, manuell zu entfernen, bevor Sie fortfahren. Die Reinheit der Ausgangsgranulatlösung beeinflusst die Pigmentextraktion. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Ausgangsmaterialien für Chromatophore vollständig verdaut werden.

Wir finden, dass Gewebeschnitte von etwa einem Zentimeter optimal sind, um die reinste Population von Granulaten zu sammeln. Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer vor, indem Sie ein 150-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen nehmen und die entsprechende Menge HEPES, Magnesiumchlorid, Kaliumaspartat und Dithiothreitol hinzufügen. Fügen Sie eine handelsübliche Mini-Tablette Proteasehemmer hinzu.

Messen Sie mit einem Messzylinder 100 ml entionisiertes Wasser ab und geben Sie es in das Röhrchen mit den Homogenisierungssalzen. Drehen Sie das Röhrchen zum Mischen, bis die Lösung klar wird. Zentrifugieren Sie die Gewebeproben und entsorgen Sie dann den Überstand.

Geben Sie 500 Mikroliter Homogenisierungspuffer in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es bis zu 2 Minuten ein, um es gründlich zu mischen. Beschallen Sie die Samples 30 Minuten lang bei 40 kHz. Und dann wieder zentrifugieren.

Nach dem Verwerfen des Überstands wiederholen Sie die Homogenisierungszugabe, die Ultraschallung und die Zentrifugation zwei- bis dreimal, um eine vollständige Verdauung des extrazellulären Gewebes sicherzustellen. Schließlich sollte das Röhrchen einen hellgelben Überstand und ein rot gefärbtes Pellet enthalten, das aus den isolierten Pigmentgranulaten besteht. Entsorgen Sie den Überstand.

Bereiten Sie zunächst saures Methanol für die Extraktion in einer Schraubglasprobe vor, indem Sie 5 ml Methanol und 25 mcL konzentrierte Salzsäure hinzufügen. Schwenken Sie die Lösung vorsichtig, um sie zu mischen. Stellen Sie ein Probenröhrchen beiseite, dies ist die Behandlung des Endreaktionsgranulats.

Entfernen Sie den Homogenisierungspuffer aus einem zweiten Röhrchen mit Granulat. Geben Sie 500 mcL der sauren Methanollösung in die restlichen Röhrchen und wirbeln Sie sie drei bis vier Minuten lang. Die Proben werden 10 Minuten lang bei 40 kHz beschallt und anschließend fünf Minuten lang bei 14000 x g zentrifugiert.

Sammeln Sie den Überstand mit einer Mikropipette in einem Ein-Dram-Glasfläschchen mit Schraubverschluss. Dies ist das Pigment, und es sollte dunkelrot erscheinen. Wiederholen Sie die Zugabe von saurem Methanol, die Beschallung und die Zentrifugation vier- bis fünfmal und sammeln Sie den Überstand, bis keine weitere Farbe extrahiert wird.

Das verbleibende farblose Pellet ist das pigmentextrahierte Granulat. Um Granulatproben für die Bildgebung vorzubereiten, zentrifugieren Sie zunächst sowohl das nicht umgesetzte Granulataliquot als auch das pigmentextrahierte Granulat fünf Minuten lang bei 14000 x g, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann jedes Pellet in 1 ml 95%igem Ethanol. Geben Sie mit einer Transferpipette 2-3 Tropfen jeder Granulatsuspension auf einen separaten Aluminium-REM-Stub.

Legen Sie die Proben in einen Exsikkator, um sie über Nacht unter Vakuum zu trocknen. Beschichten Sie die Stummel 3 Minuten lang mit einer Gold-Platin-Beschichtung, um eine 15-Nanometer-Beschichtung zu erhalten. Bilden Sie die Proben mit einem Rasterelektronenmikroskop ab.

Verwenden Sie als Nächstes ein Spektralphotometer, um die Absorptionsprofile für das nicht umgesetzte Granulat, das extrahierte Granulat und das extrahierte Pigment zu sammeln. Nehmen Sie eine Blindmessung für die Granulatproben vor, indem Sie 1 ml deionisiertes Wasser in eine saubere Küvette geben. Entsorgen Sie den Rohling in einen Abfallbehälter.

Geben Sie dann die Suspension mit dem nicht umgesetzten Pigmentgranulat in die Küvette. Sammeln Sie die UV-Vis-Absorptionsspektren für die Granulatprobe. Nehmen Sie eine zweite Blindmessung für das extrahierte Pigment mit 1 ml saurem Methanol und einer sauberen Küvette vor.

Nehmen Sie abschließend das UV-vis-Absorptionsspektrum für das Pigment und bestimmen Sie dann die maximale Wellenlänge jeder Probe. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigte, dass der Prozess der Pigmentextraktion den durchschnittlichen Durchmesser des Granulats reduziert. Vor der Extraktion haben die Granulate einen durchschnittlichen Durchmesser von 527,3 nm.

Nach dem Verfahren mit saurem Methanol verringert sich diese Größe deutlich auf etwa 202,6 nm. Eine Reduktion, von der man annimmt, dass sie auf die Extraktion des Pigments zurückzuführen ist. Bei Zugabe des sauren Methanols nimmt auch die Farbe, die mit dem nicht umgesetzten Granulat verbunden ist, sichtbar ab.

Die Bestätigung dieser Hypothese wurde mit Hilfe der Spektrophotometrie erreicht. Diese Grafik zeigt ein breites Absorptionsprofil für die vorextrahierten Granulate und ein ähnlich breites, aber niedrigeres Intensitätsprofil für die nachextrahierten Granulate. Im Gegensatz dazu weist das lösliche extrahierte Pigment ein Lambda-Maximum bei etwa 500 nm und eine deutliche Schulter bei etwa 380 nm auf.

Zusammengenommen deuten diese Daten auf die erfolgreiche Extraktion der sichtbaren Farbe aus dem Granulat hin. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Stunden von Anfang bis Ende durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe vollständig zu entfernen, das reflektierende Proteinplättchen enthält, die die Extraktion und Analyse beeinträchtigen können.

Epidermales Gewebe kann auch die Homogenisierungsschritte und die Pigmentextraktion beeinträchtigen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Dünnschichtchromatographie und die Massenspektrometrie verwendet werden, um die Pigmente weiter zu reinigen und ihre Zusammensetzung zu charakterisieren. Diese Schritte können helfen, die molekularen Beiträge zur Färbung bei Kopffüßern aufzuklären.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen für Meeresbiologen, Chemiker und Ingenieure zu beantworten, darunter: Wie ist die Zusammensetzung der Pigmente, die während des Farbwechsels verwendet werden? Und wie tragen sie zur Funktion und Struktur der nanostrukturierten Granula in den dermalen Chromatophorenorganen bei? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pigmente aus frisch sezierten Tintenfischen, Doryteuthis pealeii Chromatophoren, extrahiert.