Name: Ein Verfahren zum Extrahieren Pigmente aus Squid Doryteuthis pealeii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Lernen Sie die Extraktion von Pigmenten aus Chromatophoren von Doryteuthis pealeii für die Erforschung schneller Farbwechselmechanismen bei Tintenfischen. Diese Methode ermöglicht nanoskalige Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken für die Nutzung der Einrichtungen an der Universität von New Hampshire, einschließlich des University Instrumentation Center. Diese Arbeit wurde von der University of New Hampshire, Department of Chemistry, unterstützt.

Invertebrate Tierstudien durchgeführt, hier sind in den Vereinigten Staaten nicht geregelt; daher die Institutional Animal Care und Use Committee hat keine Befugnis zur Überprüfung solcher Protokolle. Anstelle dieser nicht unter die Zuständigkeit der Regulierung in den Vereinigten Staaten fallen, so die Autoren hiermit, dass diese Studien wurden mit aufrichtigen Bemühungen im Hinblick auf die ethische Nutzung, Pflege und Behandlung dieser Tiere durchgeführt wird, wurde die Anzahl der Individuen minimiert und diese Bemühungen mit der Basler Deklaration und des Internationalen Rates für Versuchstierkunde (ICLAS) Ethik-Richtlinien stehen im Einklang. 1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection <ol><li> Kauf enthauptet Tintenfisch D. pealeii von der Marine Ressourcen Abteilung am Marine Biological Laboratory in Woods Hole, MA oder einer Frischfischmarkt. Verwenden Sie keine Proben, die um verrundet oder zuvor geändert wurden, um dieses Verfahren anzuwenden. Insbesondere ist die Chromatophore Schicht muss noch auf die Probe intakt sein. <ol><li> Wenn die Tiere nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. Um die Proben aufzutauen, legen Sie sie in Wasser bei Raumtemperatur für 1 Stunde vor der Präparation. </li></ol></li><li> Mit Edelstahl gerade fein-Punkt-Dissektion Schere entlang der hinteren Seite des Tieres geschnitten. Beginnen an der Basis des ventralen Mantel und an dem Rippenbereich endet. </li><li> Entfernen Sie alle inneren Organe (Magen, Kiemen, Tinte Drüse, Fortpflanzungsorgane, systemische Herz und brachial Herz) von ihnen heben mit einer Pinzette zu sezieren und Abtrennen ihre Bindegewebe Dissektion Schere. Entsorgen Organe in einem Probenbeutel. </li><li> Verwenden Sie sezieren T-Pins den Mantel an Pin (fin Seite nach oben) in einem Standard-11-1 / 2 &quot;x 7-1 / 2&quot; x 1-1 / 2 &quot;pan Aluminium Dissektion eine flexible Präparation Pad enthält. Versenken des Gewebes in 250 ml Meerwasser, das durch eine Einweg-Polystyrol-Vakuum-Filtrationssystem gefiltert wurdeenthaltend 0,2 &amp; mgr; m Porengrößen. </li><li> den epidermalen Hautschicht (Deckfarbe) mit Pinzette, die Chromatophoren haltige Hautschicht intakt bleibt vorsichtig entfernen. Sobald die epidermale Schicht entfernt wird, entsorgen Sie sie in einem Probenbeutel. </li><li> Präparieren klein (1 cm x 1 cm) Abschnitte der Chromatophoren-Schicht mit einer Pinzette und Schere Dissektion. Die Proben werden in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (füllen die Hälfte jedes Leerrohr mit dem sezierten Gewebe). </li><li> Hinzufügen 500 ul gefiltertes Seewasser mit dem Gewebe enthaltenden Röhrchen. Die Proben können über Nacht bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Isolierkanne Chromatophor Pigmentgranula <ol><li> Tissue Verdauung <ol><li> Herstellung von Papain / Kollagenase <ol><li> Man wiegt 30 mg Kollagenase und 5 mg Papain mit einem 4 &quot;x 4&quot; niedrigen Stickstoff wiegen Papier. Bringen Sie diese in einem 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss. </li><li> Messen Sie 10 ml deionized Wasser mit einer Messpipette. Fügen Sie direkt Papain / Kollagenase Fläschchen enthält. Vortex auf die höchste Einstellung, bis die Lösung klar ist. </li></ol></li><li> Entfernen extrazelluläre Anhäufung <ol><li> Zentrifugieren des gesammelten chromatophore Gewebe aus Schritt 1.7 für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie die obere Schicht aus Meerwasser in einen Kunststoffabfallbehälter. </li><li> In 500 ul der Papain / Kollagenase-Lösung auf das Gewebe ein P1000 variablen Volumen Einkanal-Mikropipette. Vortex jede Probe für 1-2 Minuten auf die höchste Einstellung. </li><li> Beschallen die Proben 5 min bei einer Frequenz von 40 kHz Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu trennen. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter. </li><li> Zentrifugieren des gesammelten chromatophore Gewebe für 5 min bei 14.000 x g. Entsorgen Sie die obere Schicht aus Meerwasser in einen Kunststoffabfallbehälter. Wiederholen Sie noch einmal. </li><li> Entfernen Sie manuell alle verbleibenden großen Gewebe secgen, die in diesem Prozess mit einer Pinzette verdauen nicht vor dem nächsten Schritt fortfahren. </li></ol></li></ol></li><li> Isolieren der Pigmentkörnchen <ol><li> Herstellung von Homogenisierungspuffer <ol><li> Wiegen 2,38 g (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure) (HEPES, 100 mM), 0.095 g Magnesiumchlorid (10 mM), 0,856 g Kalium-aspartat (50 mM) und 0,015 g Dithiothreitol (1 mM). In einen 150 ml Polystyrolbehälter mit Schraubverschluss. In einer kommerziellen Mini-Tablet-Protease-Inhibitor. </li><li> Messung der 100 ml entionisiertes Wasser mit einem Meßzylinder verwendet wird. Fügen Sie direkt in den Behälter, der die Homogenisierung Salze enthält. Vortex, bis die Lösung klar ist. </li></ol></li><li> Homogenisieren von Pigmentgranulaten <ol><li> Zentrifugieren jede Probe aus Schritt 2.1 bei 14000 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter. Diese Probe sollte frei von extrazellulären Gewebe sein. </li><li> In 500 &amp;# 181; l Homogenisierungspuffer in jedes Röhrchen und Vortex für 1-2 min je gründlich die Proben mischen. Beschallen die Proben für 30 Minuten (~ 40 kHz) und folgen mit 5 min Zentrifugation bei 14.000 x g. </li><li> Entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter, und wiederholen Sie 2-3 mal den vorherigen Schritt die vollständige Verdauung der chromatophore sacculus und Protein Anbindehaltung zu gewährleisten. Die verbleibende Lösung sollte eine hellgelbe Überstand enthalten und eine rot gefärbte Pellet die isolierten Pigmentkörnchen enthalten. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Pigmentextraktion <ol><li> Herstellung von saurem Methanol (HCl-MeOH) <ol><li> Vorsichtig 25 ul konzentriert (36,5 bis 38% (w / w)), Salzsäure (HCl) zu 5 ml Methanol (MeOH). Lagern Sie das HCl-MeOH-Lösung in einem Schraubdeckel Glasprobenfläschchen. Vorsichtig schwenken, um die Lösung gleichmäßig mischen. HINWEIS: Je saurer die Lösung ist, desto mehr Pigment wird während der fi extrahiert werdenerste Extraktion. </li></ol></li><li> Extraktion von Pigment <ol><li> Zentrifugieren Sie die Pigmentgranulatsuspension (von 2.2.2) für 5 min bei 14.000 xg und entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter. </li><li> In 500 ul der HCl-MeOH-Lösung und Vortex jede Probe für ~ 3-4 min. Beschallen die Proben für 10 min (~ 40 kHz), dann zentrifugieren für 5 min bei 14.000 x g. </li><li> Mit Hilfe einer Transferpipette, sammeln Sie den Überstand in einer 1-Dram-Schraubdeckel-Glasfläschchen. Der Überstand sollte in der Farbe dunkelrot sein. </li><li> Wiederholen Sie den Extraktionsschritt 3.2.2 bis keine weitere Farbe extrahiert (~ 4-5 Wäschen). HINWEIS: Jede Extraktion wird ~ 1,5 ml Pigment ergeben. Das verbleibende farblose Pellet wird das Pigment extrahierte Granulat. Hinweis: beide farblos Granulat und extrahiert Pigmente können in Wasser bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li></ol></li></ol> 4. Charakterisierung gesamten Extraktionsverfahren <ol><li> Scannen Electron Mikroskopie <ol><li> Bild das Granulat (nicht umgesetztes aus Schritt 2.2.1 und pigment extrahiert aus Schritt 3.2.3) unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), um die Reinheit des Extraktionsprozesses zu überprüfen. </li><li> Um Granulatproben für die Bildgebung, erste Zentrifuge beide nicht umgesetzten Granulat und Pigment extrahiert Granulat für 5 min bei 14.000 · g, und entsorgen Sie den Überstand in ein Kunststoff-Abfallbehälter herzustellen. Re-suspendieren diese in 1 ml Ethanol und Ablagerung 2-3 Tropfen der Granulatsuspension auf Aluminium SEM Stubs eine Transferpipette. </li><li> über Nacht, nachdem die Proben trocknen, Sputter-Mantel mit Gold-Platin-Beschichtung für 3 min eine 15 nm Beschichtung zu erreichen. </li><li> Bild unter Verwendung eines SEM mit einer Schottky-Emitter und einem Sekundärelektronendetektor. Verwenden Sie einen 5-7 kV Strahlspannung und einen Arbeitsabstand zwischen 8 und 9 mm Bild diese Materialien. </li></ol></li><li> UV-VIS (UV-vis) spektrophotometrische Messungen <ol><li> Überwachen Sie die Absorption proDateien für alle drei Bedingungen (nicht umgesetztes Granulat aus 2.2.2, extrahiert Pigment aus 3.2.3 und Pigment extrahiert Granulat aus 3.2.4) mit einem Doppelstrahl-Spektrophotometer 200-800 nm verwendet wird. </li><li> Sammeln Sie eine Leermessung VE-Wasser in einer 1-ml-Küvette für den nicht umgesetzten Granulat und das Pigment extrahiert Granulat verwendet wird. Sammeln Sie UV-Vis-Absorptionsspektren für beide Proben. </li><li> Sammeln Sie eine leere Messung der sauren Methanollösung in einer 1-ml-Küvette für das extrahierte Pigment verwendet wird. Sammeln Sie UV-Vis-Absorptionsspektrum für die Probe. </li><li> Bestimmen maximale Wellenlänge jeder Probe durch die Wellenlänge identifiziert, an dem die Absorptionsspitze ihre maximale relative Höhe erreicht. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li>
<li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectins%3A+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li>
<li>Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malleable+skin+coloration+in+cephalopods%3A+selective+reflectance%2C+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li>
<li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+Organs%2C+Reflector+Cells%2C+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li>
<li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+%28Sepia+officinalis+L%29-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li>
<li>Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li>
<li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid%2C+Loligo+opalescens%2C+to+nerve+stimulation+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li>
<li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li>
<li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Biol.+Jb.+Dodonaea%22%5BJournal%5D)">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li>
<li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).</li>
</ol>

Wir haben nichts offenzulegen.

Wir haben ein Verfahren zum Extrahieren von Pigmenten squid chromatophore Granulat demonstriert. Durch speziell auf die Granulat-Targeting, unser Ziel ist es, ihre Rolle bei der Vermittlung der adaptive Färbung zu bestimmen. Diese Methode unterscheidet sich von früheren Berichten entworfen Kopffüßer Pigmente mit Bulk - Gewebeproben 14 oder gefriergetrocknet Haut 15 zu charakterisieren. Während dieses Protokolls auf Extrahieren chromatophore Pigmente wirksam ist, wird si...

Kopffüßer wie Tintenfische, Tintenfische und Kraken haben die Fähigkeit, dynamisch ihr Aussehen verändern , für Tarnen und Signalisierung. 1-6 Diese Fähigkeit durch die selektive Flächenausdehnung von pigmentierten Organe teilweise als Chromatophoren bekannt unterstützt wird. 4,7-9 Chromatophoren Weich Aktoren , die ein Netzwerk von nanostrukturiertem Pigmentgranulaten in einem cytoelastic sacculus beschränkt enthalten , die radial von Muskelfasern verankert ist. 1,3 Da sie betätigt werden, Chromatophoren um 500% in präsentierten Oberfläche erweitern , um die Granulate im gesamten Organ verteilen. 3,7 10,11, Wenn diese Aktion über eine Anzahl von aufeinander abgestimmten Chromatophoren wird, wird die Gesamtfärbung des Tieres verändert. Während es bekannt ist, daß die Pigmentgranulate dieser Farbänderung beitragen, bleibt deren Zusammensetzung unbekannt. Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von chromatophore Pigmente, die für zukünftige Studien Zusammensetzungs angepasst werden kann. 3,12 Chromatophor haltiges Gewebe durch sorgfältige Exstirpation von der Kopffüßer geerntet wird. Eine Verdauung und Homogenisierungsverfahren wird dann verwendet, um das umgebende Gewebe zu dissoziieren und die chromatophore Zellen trennen. Die nanostrukturierten Granula werden dann isoliert und gereinigt aus den verbleibenden Chromatophoren wiederholt unter Verwendung von Beschallung und Zentrifugation. Nach der Reinigung werden Pigmente aus dem Granulat in einem Verfahren extrahiert , das aus der Gewinnung von sichtbaren Farbe aus Schmetterlingsflügeln mit saurem Methanol - Lösungen. 13 Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Spektrometrie werden verwendet , um zu bestätigen , dass die Chromatophoren - Pigmente erfolgreich extrahiert angepasst ist , dieser Prozess. Diese Methode beschreibt die Isolierung von chromatophore Granulat, das verwendet wird, um die molekularen Beiträge zu c zu erkundenoloration in Kopffüßer. 12 kleine Molekül - Extraktionen von ganzen Tieren kann oft ein langer und mühsamer Prozess sein. Das Ziel hier ist es, zukünftige Forscher einer effektiven und einfachen Protokoll für den Erwerb von Pigmenten aus den nanostrukturierten Granulat in Kopffüßer zu informieren.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>Keine Gefahr</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Reizend, akute Toxizität</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Leicht reizend</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>EMD Chemikalien</td><td>7647-01-0</td><td>Ätzend</td></tr><tr><td>k-Aspartat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reagiert heftig mit Oxidationsmitteln</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Leicht augenreizend</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Leicht entzündlicher</td></tr><tr><td>Mini-Tablettenhemmer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Ätzend für Metall und Haut</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Reizend</td></tr></tbody></table>

ein verfahren zum extrahieren pigmente aus squid<em&gt; doryteuthis pealeii</em

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Kopffüßer können schnelle und adaptive Veränderungen in der Hautfärbung für Wahrnehmungs-, Kommunikations-, Verteidigungs- und Fortpflanzungszwecke durchlaufen. Diese Fähigkeiten werden zum Teil durch die flächenhafte Ausdehnung und Zurückziehung von pigmentierten Organen, den sogenannten Chromatophoren, unterstützt. Es ist zwar bekannt, dass die Chromatophore ein angebundenes Netzwerk aus pigmentierten Granulaten enthalten, ihre Struktur-Funktions-Eigenschaften sind jedoch noch nicht vollständig detailliert beschrieben. Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung der nanostrukturierten Granulate in Tintenfisch-Doryteuthis pealeii Chromatophoren und zeigen, wie die zugehörigen Pigmente in sauren Lösungsmitteln extrahiert werden können. Um dies zu erreichen, wird die chromatophorhaltige Hautschicht zunächst manuell durch eine oberflächliche Dissektion isoliert und das Pigmentgranulat durch Ultraschall-, Zentrifugations- und Waschzyklen entfernt. Die in den gereinigten Granulaten eingeschlossenen Pigmente werden dann über saure Methanollösungen extrahiert, so dass Nanostrukturen mit kleineren Durchmessern entstehen, die keine sichtbare Farbe aufweisen. Dieses Extraktionsverfahren erzeugt eine Ausbeute von 58 % an löslichen Pigmenten, die aus Granulat isoliert werden. Mit dieser Methode kann die Zusammensetzung der Chromatophorpigmente bestimmt und verwendet werden, um einen Einblick in den Mechanismus der adaptiven Färbung bei Kopffüßern zu erhalten.

Chromatophoren werden aus dem D. seziert pealeii dorsal Mantel (1A, 1B). Sobald sie entfernt werden, werden Chromatophoren lysiert und gereinigt Zyklen Zentrifugation und Waschen der pigmentierten Granulate (2A, 2B) zu isolieren geführt. Sauren Methanollösungen (HCl-MeOH) werden verwendet , um das Pigment aus dem Granulat (2C) zu extrahieren, um ein lösliches Pigment Extrakt und unlösli...

Ein Protokoll für die Extraktion von Pigmenten aus den nanostrukturierten Granulat in Tintenfisch Doryteuthis pealeii Chromatophoren vorgestellt.

Ein Verfahren zum Extrahieren Pigmente aus Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Extraktion von Pigmenten zu beschreiben, die sich in den nanostrukturierten Granula frisch präparierter Chromatophoren der Tintenfische Doryteuthis pealeii befinden. Cephalopoden sind komplexe Meerestiere, die schnelle und adaptive Veränderungen ihrer Hautfarbe durchlaufen.Doch es ist immer noch vieles unbekannt darüber, wie diese Systeme funktionieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie gezielt die nanostrukturierten Granula im Chromatophorenorgan anspricht. Dies wird es Forschern ermöglichen, den Mechanismus für die Farbänderung, der auf der Nanoskala beginnt, aufzuklären.Neben Erkenntnissen zur Cephalopodenbiologie kann dies die Entwicklung synthetischer Systeme beeinflussen, die darauf ausgelegt sind, den dynamischen Bereich adaptiver Farbwechsel nachzuahmen, wie er bei Cephalopoden durch präformierte pigmentierte Nanopartikel vermittelt wird. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Gewinnung von reinem Chromatophorengewebe aufgrund der engen räumlichen Nähe zum umgebenden Gewebe schwierig ist. Unsere Methode ist optimiert, um diese Verunreinigungen zu minimieren.Um die Dissektion zu beginnen, geben Sie zunächst etwa 250 Milliliter gefiltertes Meerwasser in eine Dissektionswanne. Legen Sie ein Präparat in die Wanne und schneiden Sie mit feinen Edelstahl-Spitzzangen vom Ansatz des ventralen Mantels entlang der hinteren Seite des Tieres bis in den Flossenbereich. Entfernen Sie alle inneren Organe, indem Sie sie vorsichtig mit der anatomischen Pinzette anheben und das Bindegewebe mit den Zangen durchtrennen.Entsorgen Sie die Organe in einer Probentüte. Befestigen Sie den Mantelflügel mit anatomischen T-Pins mit der Oberseite nach oben auf dem Präparationsbrett. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die undurchsichtige obere Hautschicht, wobei Sie die chromatophorenhaltige Hautschicht intakt lassen.Entsorgen Sie die epidermale Schicht in einer Probenbeutel. Entfernen Sie anschließend die Chromatophorschicht. Schneiden Sie das Chromatophorgewebe in kleine Stücke von je einem Zentimeter mal einem Zentimeter. Geben Sie die Schnitte in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie jedes Röhrchen zur Hälfte mit dem dissezierten Gewebe. Geben Sie abschließend 500 Mikroliter gefiltertes Meerwasser zu den Röhrchen hinzu. Um die Pigmentkörnchen zu isolieren, zentrifugieren Sie die Chromatophoren-Gewebeschnitte zunächst fünf Minuten bei 14.000 × g.Entfernen Sie die oberste Schicht des Meerwassers. Geben Sie 500 Mikroliter Papain-Kollagenase-Lösung zu den Proben hinzu und wirbeln Sie sie ein bis zwei Minuten lang auf der höchsten Stufe. Anschließend werden die Proben fünf Minuten lang bei 40 kHz beschallt, um die Zellen vom umgebenden Gewebe zu lösen.Zentrifugieren Sie weitere fünf Minuten bei 14.000 × g und entfernen Sie danach den Überstand. Wiederholen Sie die Zentrifugation zwei weitere Male, wobei jedes Mal der Überstand verworfen wird. Geben Sie dann die Resuspension in Kollagenase hinzu.Entfernen Sie mit einer Pinzette manuell alle verbleibenden großen Gewebestücke, die vor dem Fortfahren nicht verdaut wurden. Die Reinheit der Ausgangsgranulalösung beeinflusst die Pigmentextraktion. Daher ist es wichtig sicherzustellen, dass die Ausgangsmaterialien der Chromatophoren vollständig verdaut sind.Wir stellen fest, dass Gewebeschnitte von etwa einem Zentimeter optimal sind, um die reinstmögliche Population von Granula zu gewinnen. Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer vor, indem Sie ein 150-Milliliter-Schraubglas nehmen und die entsprechende Menge HEPES, Magnesiumchlorid, Kaliumaspartat und Dithiothreitol hinzufügen. Geben Sie eine kommerzielle Mini-Tablette Proteaseinhibitor hinzu.Unter Verwendung eines Messzylinders 100 ml deionisiertes Wasser abmessen und zu dem Gefäß mit den Homogenisierungssalzen hinzufügen. Das Gefäß vortexen, um die Lösung zu mischen, bis sie klar wird. Die Gewebeproben zentrifugieren und anschließend den Überstand verwerfen.Fügen Sie 500 Mikroliter Puffer für die Homogenisierung zu jedem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie 2 Minuten lang, um gründlich zu mischen. Sonizieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 40 kHz. Anschließend zentrifugieren Sie sie erneut.Nach dem Verwerfen des Überstandes die Homogenisierungszugabe, die Beschallung und die Zentrifugation zwei bis drei Mal wiederholen, um eine vollständige Verdauung des extrazellulären Gewebes sicherzustellen. Schließlich sollte das Röhrchen einen hellgelben Überstand und ein rot gefärbtes Pellet, bestehend aus den isolierten Pigmentgranula, enthalten. Verwerfen Sie den Überstand.Bereiten Sie zunächst saures Methanol zur Extraktion in einem Glasprobenröhrchen mit Schraubverschluss vor, indem Sie 5 ml Methanol und 25 µL konzentrierte Salzsäure hinzufügen. Verrühren Sie die Lösung vorsichtig durch Schwenken. Stellen Sie ein Probenröhrchen beiseite; dies wird die Behandlung mit endreaktiven Granula darstellen.Entfernen Sie den Homogenisierungspuffer von einem zweiten Röhrchen, das Granula enthält. Geben Sie 500 µL der sauren Methanol-Lösung zu den verbleibenden Röhrchen hinzu und wirbeln Sie drei bis vier Minuten lang im Vortex. Sonizieren Sie die Proben 10 Minuten bei 40 kHz und zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten bei 14000 × g.Unter Verwendung einer Mikropipette das Überstand in einem eindrammigen Schraubglasfläschchen sammeln. Dies ist das Pigment und sollte dunkelrot gefärbt sein. Die Zugabe von saurem Methanol, die Beschallung und die Zentrifugation vier bis fünfmal wiederholen, wobei jeweils der Überstand gesammelt wird, bis keine weitere Farbe extrahiert wird.Das verbleibende farblose Pellet sind die pigmentextrahierten Granula. Um die Granulaprobe für die Bildgebung vorzubereiten, zentrifugieren Sie zunächst sowohl die nicht umgesetzte Granula-Aliquot als auch die pigmentextrahierten Granula fünf Minuten bei 14000 × g, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 1 ml 95 % Ethanol. Geben Sie mithilfe einer Transferpipette 2–3 Tropfen jeder Granulasuspension auf einen separaten Aluminium-SEM-Stub.Stellen Sie die Proben über Nacht im Vakuum im Exsikkator zum Trocknen. Bedampfen Sie die Stubs 3 Minuten lang mit einer Gold-Platin-Beschichtung, um eine 15 Nanometer dicke Schicht zu erhalten. Untersuchen Sie die Proben mit einem Rasterelektronenmikroskop.Als Nächstes verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Absorptionsprofile der nicht umgesetzten Granula, extrahierten Granula und des extrahierten Pigments aufzunehmen. Nehmen Sie eine Blindmessung für die Granulaprobe vor, indem Sie 1 ml deionisiertes Wasser in eine saubere Küvette geben. Entsorgen Sie die Blindprobe in einen Abfallbehälter.Fügen Sie anschließend die Suspension mit den unumgesetzten Pigmentkörnchen zur Küvette hinzu. Nehmen Sie die UV/Vis-Absorptionsspektren der Körnchenprobe auf. Führen Sie eine zweite Blindmessung für das extrahierte Pigment mit 1 mL saurem Methanol und einer sauberen Küvette durch.Schließlich wird das UV/Vis-Absorptionsspektrum des Pigments aufgenommen und die maximale Wellenlänge jeder Probe bestimmt. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigte, dass der Pigmentextraktionsprozess den durchschnittlichen Durchmesser der Granula verringert. Vor der Extraktion weisen die Granula einen durchschnittlichen Durchmesser von 527,3 nm auf.Nach dem sauren Methanol-Verfahren verringert sich diese Größe signifikant auf etwa 202,6 nm. Eine Verringerung, die auf die Extraktion des Pigments zurückgeführt wird. Bei Zugabe des sauren Methanols nimmt auch die mit den unumgesetzten Granula assoziierte Farbe sichtbar ab.Die Bestätigung dieser Hypothese erfolgte mittels Spektrophotometrie. Dieses Diagramm zeigt ein breites Absorptionsprofil für die vor der Extraktion gewonnenen Granula sowie ein ähnlich breites, jedoch intensitätsärmeres Profil für die nach der Extraktion verbliebenen Granula. Im Gegensatz dazu weist das lösliche extrahierte Pigment ein Lambda-max bei etwa 500 nm und eine deutliche Schulter bei etwa 380 nm auf.Insgesamt deuten diese Daten auf eine erfolgreiche Extraktion der sichtbaren Farbe aus den Granula hin. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie von Anfang bis Ende in etwa vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe vollständig zu entfernen, das reflektierende Proteinplättchen enthält, die die Extraktion und Analyse stören könnten.Epidermales Gewebe kann auch die Homogenisierungsschritte und die Pigmentextraktion stören. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Dünnschichtchromatographie und Massenspektrometrie verwendet werden, um die Pigmente weiter zu reinigen und ihre Zusammensetzung zu charakterisieren. Diese Schritte können dazu beitragen, die molekularen Beiträge zur Färbung bei Kopffüßern aufzuklären.Mithilfe dieser Methode können wichtige Fragen für Meeresbiologen, Chemiker und Ingenieure beantwortet werden, beispielsweise: Aus welchen Bestandteilen setzen sich die Pigmente zusammen, die während des Farbwechsels verwendet werden? Und wie tragen sie zur Funktion und Struktur der nanostrukturierten Granula innerhalb der dermalen Chromatophorenorgane bei? Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Pigmente aus frisch präparierten Chromatophoren des Tintenfischs Doryteuthis pealeii gewonnen werden können.

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video wird zeigen, wie Blutzellen (Blutkörperchen) aus dem hawaiianischen Bobtail Squid zu...

Beziehen Blutzellen aus dem hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes Und die Beobachtung ihrer Einhaltung Symbiotic und Non-symbiotischen Bakterien

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Lichtsammelkomplexen in vitro. Diese integralen Membranproteine koordinieren Chlorophylle und Carotinoide und sind für die Lichternte in höheren Pflanzen und Grünalgen verantwortlich.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

Dieser Artikel beschreibt das Protokoll für die Reinigung von Photorezeptor-Fragmenten des äußeren Segments (POS) durch Ultrazentrifugation aus Schweine-/Rindernetzhaut unter Verwendung von Homogenisierung und Saccharosegradientenzentrifugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Vorbereitung großer Bestände an POS-Aliquoten, etikettiert oder unbeschriftet, die dann bei -80 °C gelagert werden können.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

Dieser Bioassay verwendet ein Modell Raubfische, die Anwesenheit von Futter Abschreckung Metaboliten aus organischen Extrakte der Gewebe von Meeresorganismen auf natürlichen Konzentrationen mit einem ernährungsphysiologisch vergleichbaren Lebensmittelmatrix zu bewerten.

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

Diese Handschrift beschreibt eine einfache und Hochdurchsatzverfahren für wasserlösliche Proteine ​​mit hydrophoben Pigmente Zusammenbauen, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen basiert. Wir zeigen die Wirksamkeit des Verfahrens bei der Montage von nativen Chlorophylle mit vier Varianten von rekombinantem wasserlösliches Chlorophyll-Bindungsproteine ​​(WSCPs) von Brassica - Pflanzen in E. ausgedrückt coli.

Wasser in Öl-Emulsionen: Ein neues System für die Montage wasserlösliche Chlorophyll-bindenden Proteine ​​mit hydrophober Pigments

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Fucoxanthin Chlorophyll a/c-bindende Proteine (FCP) von Kieselalgen zu isolieren und integrieren sie in Liposomen mit natürlichen Lipid Kompositionen Erregung Energieübertragung auf Ionen-Zusammensetzung Änderungen zu studieren.

Isolieren und die Einbeziehung von Licht-ernten Antennen von Diatomee Cyclotella Meneghiniana in Liposomen mit Thylakoidmembran Lipide

Doliolide, einschließlich der Art Dolioletta gegenbauri, sind kleine gelatinöse Marine Zooplankton von ökologischer Bedeutung auf produktiven subkontinentalen Regalsystemen weltweit gefunden. Die Schwierigkeit, diese empfindlichen Organismen zu kultivieren, schränkt ihre Untersuchung ein. In dieser Studie beschreiben wir Anbauansätze für das Sammeln, Aufzucht und die Pflege des Doliolid Dolioletta gegenbauri.

Anbau des Marine Pelagischen Tunikas Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) für experimentelle Studien

Regulatoren der Melanozytenfunktionen bestimmen sichtbare Unterschiede im Pigmentierungsergebnis. Die Entschlüsselung der molekularen Funktion des Kandidaten-Pigmentierungsgens stellt eine Herausforderung dar. Hier demonstrieren wir die Verwendung eines Zebrafisch-Modellsystems, um Kandidaten zu identifizieren und sie in Regulatoren des Melaningehalts und der Melanozytenzahl zu klassifizieren.

Umgekehrter genetischer Ansatz zur Identifizierung von Regulatoren der Pigmentierung anhand von Zebrafischen

Wir präsentieren ein Protokoll zur elektrophysiologischen Charakterisierung bistabiler Photopigmente: (i) Ausnutzung der Ladungsverschiebungen innerhalb der Photopigmentmoleküle nach Photonenabsorption und ihrer riesigen Menge in den Photorezeptoren und (ii) Ausnutzung der Absorptionsspektrenunterschiede von Rhodopsin- und Metarhodopsin-Photopigmentzuständen. Diese Protokolle sind nützlich, um nach Mutationen zu suchen, die bistabile Photopigmentsysteme betreffen.

Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentgehalts in Drosophila-Photorezeptoren

Hier beschreiben wir verschiedene Protokolle, die auf eine integrierte Aufwertung von Gracilaria gracilis abzielen: Ernte von Wildarten, Eigenzucht und Extraktion von bioaktiven Inhaltsstoffen. Die antioxidative, antimikrobielle und zytotoxische Wirkung der Extrakte wird ebenso bewertet wie die Nährwert- und Stabilitätsbewertung von Lebensmitteln, die mit ganzer Algenbiomasse und Pigmenten angereichert sind.

Aufwertung der Rotalge Gracilaria gracilis durch einen Bioraffinerieansatz

Lernen Sie die Extraktion von Pigmenten aus Chromatophoren von Doryteuthis pealeii für die Erforschung schneller Farbwechselmechanismen bei Tintenfischen. Diese Methode ermöglicht nanoskalige Analysen.

Ein Verfahren zum Extrahieren Pigmente aus Squid

Weitere Videos entdecken