Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser
14. Dezember 2016
Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung der Biofilmentwicklung nach Exposition gegenüber Wirtsfaktoren unter Verwendung eines Objektträgerkammermodells. Dieses Modell ermöglicht die direkte Visualisierung der Biofilmentwicklung sowie die Analyse von Biofilmparametern mit Hilfe von Computersoftwareprogrammen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen von Biofilmen als Reaktion auf Sputum und Antibiotika sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Diese Methode kann von Forschern verwendet werden, um Schlüsselfragen zu verstehen, z. B. wie die Wirksamkeit verschiedener Antibiotika gegen bakterielle Biofilme durch das Vorhandensein von Auswurf beeinflusst werden kann. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie es dem Einzelnen ermöglicht, Veränderungen zu sehen, die in Biofilmen als Reaktion auf verschiedene Faktoren auftreten.
Zu Beginn des Experiments ist das Volumen der zuvor erhaltenen Sputumprobe zu erfassen. Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und fügen Sie das doppelte Volumen der Probe hinzu. Verwenden Sie anschließend eine Transferpipette, um die Probe gründlich zu mischen.
Wirbeln Sie die Probe eine Minute lang auf höchster Stufe, um sie vollständig zu vermischen. Aliquotieren Sie einen Milliliter der Mischung in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann drehen Sie die Röhren herunter.
Bewahren Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand auf und entsorgen Sie das Pellet. Filter: Sterilisieren Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikron-Filter und sammeln Sie ihn in einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie den Sputumüberstand für die zukünftige Verwendung bei 80 Grad Celsius.
Geben Sie 40 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Kultur in vier Milliliter frische Luria-Brühe oder LB-Medien und züchten Sie die Bakterien, um eine Kultur mit einer optischen Dichte von 0,55 bei 600 Nanometern zu erhalten. Als nächstes verdünnen Sie 100 Mikroliter der 0,5 OD-Kultur in 400 Mikroliter vorbereitete 10%ige Sputumfiltrate in LB. Verwenden Sie 200 Mikroliter der Verdünnung, um die Vertiefungen der Objektträgerkammern zu säen. Lassen Sie die Bakterien vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln anheften.
Entfernen Sie nach vier Stunden das Medium und waschen Sie den Biofilm vorsichtig mit 1X frischem LB. Ersetzen Sie das restliche Medium durch 200 Mikroliter frisches LB. Lassen Sie die Biofilme bei 37 Grad Celsius wachsen, ohne zu schütteln. Wechseln Sie das Medium alle 12 Stunden ohne Waschen, bis der Biofilm für die Mikroskopie bereit ist. Es ist sehr wichtig, die Objektträger vorsichtig zu waschen, um anhaftende Bakterien nicht zu stören.
Entfernen Sie nach dem Wachstum das Medium aus den Vertiefungen der Kammer und waschen Sie jede Kammer zweimal vorsichtig mit 300 Mikrolitern sterilem PBS. Als nächstes fügen Sie zur Herstellung der Biofilm-Färbemischung einen Mikroliter jedes im Viabilitätskit enthaltenen Farbstoffs zu jedem benötigten Milliliter Lösung hinzu und mischen Sie die Lösung. Die optimale Färbe- und Färbezeit wird für jeden Organismus empirisch ermittelt.
Geben Sie 200 Mikroliter der Färbemischung in jede Vertiefung des Kammer-Deckglases. Inkubieren Sie das Deckglas. Entfernen Sie nach der Inkubation die Färbemischung aus den Kammern und waschen Sie jede Vertiefung mit 300 Mikrolitern sterilem PBS.
Ersetzen Sie das PBS durch neue Medien. Fahren Sie abschließend mit der Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie fort. Repräsentative Bilder von klinischen Isolaten des Burkholderia cepacia-Komplexes oder BCC nach 48-stündigem Wachstum in gekammertem Deckglas mit Medien allein oder in Gegenwart von 10%igen Sputumfiltraten zeigen, dass ihre Anwesenheit die Architektur des Biofilms verändern kann.
Die Bilder wurden mit der Comstat-Software analysiert, um wichtige Biofilmparameter zu erhalten, einschließlich der durchschnittlichen Dicke des Biofilms, die bei Behandlung mit 10 % Sputum erhöht wurde. Um die Auswirkungen der verschiedenen Faktoren auf das Biofilmwachstum zu verstehen, wurden klinische Isolate nur in Medien oder mit Sputum gezüchtet und entweder mit oder ohne Antibiotikum behandelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Biofilme auf Kammer-Deckglas bildet und behandelt und sie für die Färbung und konfokale Analyse vorbereitet.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung und Quantifizierung der Biofilmbildung als Reaktion auf Sputum und Antibiotika unter Verwendung eines Objektträgerkammer-Modells. Dieses Modell ermöglicht die direkte Beobachtung von Biofilmveränderungen und erlaubt eine detaillierte Analyse mithilfe von Computer-Software.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Biofilmforschung
- Antibiotikawirksamkeit
Hintergrund
- Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen.
- Das Verständnis der Reaktion von Biofilmen auf Antibiotika ist entscheidend für Behandlungsstrategien.
- Sputum kann die Wirksamkeit von Antibiotika gegenüber Biofilmen beeinflussen.
- Das Ziel dieser Studie ist es, diese Wechselwirkungen effektiv zu visualisieren.
Zweck der Studie
- Um Veränderungen in Biofilmen infolge von Sputum- und Antibiotika-Exposition sichtbar zu machen.
- Um die Auswirkung von Wirtsfaktoren auf die Biofilmbildung zu quantifizieren.
- Um das Verständnis der Wirksamkeit von Antibiotika gegen Biofilme zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Sputumproben.
- Verdünnung des Sputums mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Vermischung der Proben zur Erzielung von Homogenität.
- Visualisierung der Biofilmbildung mithilfe eines Objektträgerkammer-Modells.
Hauptergebnisse
- Direkte Visualisierung von Biofilmveränderungen als Reaktion auf Antibiotika.
- Quantitative Analyse von Biofilmparametern.
- Einblicke in die Wechselwirkung zwischen Sputum und Biofilmreaktion.
- Nachweis der Wirksamkeit verschiedener Antibiotika.
Schlussfolgerungen
- Das Objektträgerkammer-Modell eignet sich gut zur Untersuchung der Biofilmdynamik.
- Wirtsfaktoren wie Sputum beeinflussen das Biofilmbewegungsverhalten erheblich.
- Diese Methodik kann zukünftige Antibiotikabehandlungsstrategien unterstützen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Visualisierung der Biofilmbildung in Gegenwart von vom Wirt stammendem Sputum und Antibiotika begegnet einer zentralen Herausforderung bei der Entwicklung von Antiinfektiva und der Treue translationaler Modelle. Dieser Ansatz ermöglicht eine mechanistische Risikominderung, indem er aufzeigt, wie Wirtsfaktoren die Wirksamkeit von Antibiotika und die Architektur von Biofilmen beeinflussen, und liefert damit Hinweise für die frühe Validierung von Zielstrukturen sowie für Screening-Strategien. Die Methode stärkt die Vorhersagekraft für Portfolioentscheidungen in der Forschung und Entwicklung im Bereich Infektionskrankheiten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen hinsichtlich des Einflusses von Wirtsfasaktoren auf die Widerstandsfähigkeit von Biofilmen.
- Unterstützt die biologische Risikominderung, indem die Reaktion von Biofilmen auf Antibiotika in krankheitsrelevanten Matrizes quantifiziert wird.
- Erleichtert die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch Messung der Biofilmviabilität und -architektur unter definierten Bedingungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Biofilmsysteme für die anschließende Wirkstoffprüfung unter Berücksichtigung klinisch relevanter Faktoren vor.
- Standardisiert Testbedingungen, um Reproduzierbarkeit und quantitative Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Versuchsreihen zu gewährleisten.
- Erzeugt robuste, quantitative Ergebnisse wie Biofilmdicke und Vitalität zur zuverlässigen Bewertung von Wirkstoffen.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt in-vitro-Biofilmmodelle auf krankheitsrelevante Wirtsumgebungen aus, wodurch die translationale Kohärenz verbessert wird.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem die Antibiotikawirksamkeit in komplexen biologischen Matrizes aufgezeigt wird.
- Liefert mechanistische Einblicke in Wirt-Pfadogen-Wirkstoff-Wechselwirkungen zur prädiktiven Risikominimierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses modulare Deckglasmodell integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem es eine hypothesengetriebene Untersuchung der Wirksamkeit von Antibiotika in biofilmbasierten Systemen ermöglicht, die dem Wirt nachempfunden sind.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich des Einflusses von Wirtsfasaktoren und die Aufklärung von Wegen bei der Biofilmbildung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte zur Priorisierung von Verbindungen in biofilmbasierten Kontexten.
- Analytik: Bietet bildbasierte Messungen und statistische Auswertungen für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen, indem krankheitsrelevante Matrizes integriert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, anpassungsfähige Plattform für die wiederholte Bewertung von anti-biofilmbildenden Strategien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten in der antiinfektiven Forschung und Entwicklung.
- Operativer Wert: Verbessert Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Biofilmdetektionen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten sowie die Kapitalnutzungseffizienz, indem kontextabhängige Wirkstoffwirksamkeit aufgezeigt wird.
- Portfolio-Beitrag: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf ihrer Leistung in systemen, die dem Wirt nachempfunden sind.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Biofilmkultur, konfokaler Mikroskopie und quantitativer Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu Kammerobjektträgern, Vitalitätsfärbekits und analytischer Software wie Comstat.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise bei der Probenpräparation und Bildgebung über Teamgrenzen hinweg voraus.
- Kann Anpassungen für verschiedene Bakterienspezies oder vom Wirt stammende Matrizes erfordern.
- Ist abhängig von der empirischen Optimierung der Färbungs- und Bildgebungspараметer für jeden Organismus.
