Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser
December 14th, 2016
Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung der Biofilmentwicklung nach Exposition gegenüber Wirtsfaktoren unter Verwendung eines Objektträgerkammermodells. Dieses Modell ermöglicht die direkte Visualisierung der Biofilmentwicklung sowie die Analyse von Biofilmparametern mit Hilfe von Computersoftwareprogrammen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen von Biofilmen als Reaktion auf Sputum und Antibiotika sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Diese Methode kann von Forschern verwendet werden, um Schlüsselfragen zu verstehen, z. B. wie die Wirksamkeit verschiedener Antibiotika gegen bakterielle Biofilme durch das Vorhandensein von Auswurf beeinflusst werden kann. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie es dem Einzelnen ermöglicht, Veränderungen zu sehen, die in Biofilmen als Reaktion auf verschiedene Faktoren auftreten.
Zu Beginn des Experiments ist das Volumen der zuvor erhaltenen Sputumprobe zu erfassen. Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu und fügen Sie das doppelte Volumen der Probe hinzu. Verwenden Sie anschließend eine Transferpipette, um die Probe gründlich zu mischen.
Wirbeln Sie die Probe eine Minute lang auf höchster Stufe, um sie vollständig zu vermischen. Aliquotieren Sie einen Milliliter der Mischung in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann drehen Sie die Röhren herunter.
Bewahren Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand auf und entsorgen Sie das Pellet. Filter: Sterilisieren Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikron-Filter und sammeln Sie ihn in einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie den Sputumüberstand für die zukünftige Verwendung bei 80 Grad Celsius.
Geben Sie 40 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Kultur in vier Milliliter frische Luria-Brühe oder LB-Medien und züchten Sie die Bakterien, um eine Kultur mit einer optischen Dichte von 0,55 bei 600 Nanometern zu erhalten. Als nächstes verdünnen Sie 100 Mikroliter der 0,5 OD-Kultur in 400 Mikroliter vorbereitete 10%ige Sputumfiltrate in LB. Verwenden Sie 200 Mikroliter der Verdünnung, um die Vertiefungen der Objektträgerkammern zu säen. Lassen Sie die Bakterien vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln anheften.
Entfernen Sie nach vier Stunden das Medium und waschen Sie den Biofilm vorsichtig mit 1X frischem LB. Ersetzen Sie das restliche Medium durch 200 Mikroliter frisches LB. Lassen Sie die Biofilme bei 37 Grad Celsius wachsen, ohne zu schütteln. Wechseln Sie das Medium alle 12 Stunden ohne Waschen, bis der Biofilm für die Mikroskopie bereit ist. Es ist sehr wichtig, die Objektträger vorsichtig zu waschen, um anhaftende Bakterien nicht zu stören.
Entfernen Sie nach dem Wachstum das Medium aus den Vertiefungen der Kammer und waschen Sie jede Kammer zweimal vorsichtig mit 300 Mikrolitern sterilem PBS. Als nächstes fügen Sie zur Herstellung der Biofilm-Färbemischung einen Mikroliter jedes im Viabilitätskit enthaltenen Farbstoffs zu jedem benötigten Milliliter Lösung hinzu und mischen Sie die Lösung. Die optimale Färbe- und Färbezeit wird für jeden Organismus empirisch ermittelt.
Geben Sie 200 Mikroliter der Färbemischung in jede Vertiefung des Kammer-Deckglases. Inkubieren Sie das Deckglas. Entfernen Sie nach der Inkubation die Färbemischung aus den Kammern und waschen Sie jede Vertiefung mit 300 Mikrolitern sterilem PBS.
Ersetzen Sie das PBS durch neue Medien. Fahren Sie abschließend mit der Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie fort. Repräsentative Bilder von klinischen Isolaten des Burkholderia cepacia-Komplexes oder BCC nach 48-stündigem Wachstum in gekammertem Deckglas mit Medien allein oder in Gegenwart von 10%igen Sputumfiltraten zeigen, dass ihre Anwesenheit die Architektur des Biofilms verändern kann.
Die Bilder wurden mit der Comstat-Software analysiert, um wichtige Biofilmparameter zu erhalten, einschließlich der durchschnittlichen Dicke des Biofilms, die bei Behandlung mit 10 % Sputum erhöht wurde. Um die Auswirkungen der verschiedenen Faktoren auf das Biofilmwachstum zu verstehen, wurden klinische Isolate nur in Medien oder mit Sputum gezüchtet und entweder mit oder ohne Antibiotikum behandelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Biofilme auf Kammer-Deckglas bildet und behandelt und sie für die Färbung und konfokale Analyse vorbereitet.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung und Quantifizierung der Biofilmentwicklung als Reaktion auf Sputum und Antibiotika unter Verwendung eines Schiebekammermodells. Dieses Modell ermöglicht die direkte Beobachtung von Biofilmveränderungen und erlaubt eine detaillierte Analyse mithilfe von Computersoftware.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Biofilmforschung
- Antibiotikawirksamkeit
Hintergrund
- Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen.
- Das Verständnis der Biofilmreaktion auf Antibiotika ist entscheidend für Behandlungsstrategien.
- Sputum kann die Wirksamkeit von Antibiotika gegen Biofilme beeinflussen.
- Diese Studie zielt darauf ab, diese Wechselwirkungen effektiv zu visualisieren.
Zweck der Studie
- Visualisierung von Veränderungen in Biofilmen aufgrund von Sputum und Antibiotikaexposition.
- Quantifizierung des Einflusses von Wirtsfaktoren auf die Biofilmentwicklung.
- Verbesserung des Verständnisses der Antibiotikawirksamkeit gegen Biofilme.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Sputumproben.
- Verdünnung von Sputum mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Mischen der Proben zur Homogenisierung.
- Visualisierung der Biofilmentwicklung mittels eines Schiebekammermodells.
Hauptergebnisse
- Direkte Visualisierung von Biofilmveränderungen als Reaktion auf Antibiotika.
- Quantitative Analyse von Biofilmparametern.
- Einblicke in die Wechselwirkung zwischen Sputum und Biofilmreaktion.
- Demonstration der Wirksamkeit verschiedener Antibiotika.
Schlussfolgerungen
- Das Schiebekammermodell ist effektiv für die Untersuchung der Biofilmdynamik.
- Wirtsfaktoren wie Sputum beeinflussen das Biofilmverhalten erheblich.
- Diese Methodik kann zukünftige Antibiotikabehandlungsstrategien beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of biofilm development in the presence of host-derived sputum and antibiotics addresses a critical challenge in anti-infective discovery and translational model fidelity. This approach enables mechanistic de-risking by revealing how host factors modulate antibiotic efficacy and biofilm architecture, informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for portfolio decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding host factor influence on biofilm resilience.
- Supports biological de-risking by quantifying biofilm response to antibiotics in disease-relevant matrices.
- Facilitates functional target validation by measuring biofilm viability and architecture under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biofilm systems for downstream compound screening in the presence of clinically relevant factors.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and quantitative comparison across experimental arms.
- Generates robust, quantitative outputs such as biofilm thickness and viability for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant host environments, enhancing translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing antibiotic performance in complex biological matrices.
- Provides mechanistic insight into host-pathogen-drug interactions for predictive de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This chambered coverglass model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of antibiotic efficacy in host-mimetic biofilm systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on host factor impact and pathway clarification in biofilm development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound prioritization in biofilm contexts.
- Analytics: Provides image-based measurements and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by incorporating disease-relevant matrices.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated evaluation of anti-biofilm strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective R&D.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biofilm assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by revealing context-dependent drug efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on performance in host-mimetic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biofilm culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to chambered coverglass systems, viability staining kits, and analytical software such as Comstat.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different bacterial species or host-derived matrices.
- Dependent on empirical optimization of staining and imaging parameters for each organism.
