Visualisierung der Interrenal- Steroidogenic Gewebe und seine Vascular Mikromilieu in Zebrabärbling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist der Nachweis differenzierter internierender steroidogener Zellen im sich entwickelnden Zebrafisch durch einen einfachen enzymatischen Aktivitätsassay für den gesamten Mount. Dieses Färbeverfahren kann helfen, zentrale Fragen zu den molekularen und zellulären Mechanismen der Internierenbildung und -fehlbildung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Färbeassays besteht darin, dass er schnell, einfach und zuverlässig ist, was ihn zu einem leistungsstarken Werkzeug für genetische oder chemische Screenings bei Zebrafischen macht.

Dieses Verfahren kann an trangenen fluoreszierenden Reporterlinien durchgeführt werden, wobei die Niere und die Blutgefäße markiert werden, so dass mehrere Gewebe im selben Embryo analysiert werden können. In Kombination mit Vibratomschnitten, Immunhistochemie und konfokaler Mikroskopie kann auch die vaskuläre Mikroumgebung des Internierengewebes sichtbar gemacht werden. Nach der Herstellung von Stammlösungen für die Färbung mit drei Beta-Hsd-Aktivitäten gemäß dem Textprotokoll werden sich entwickelnde Zebrafischembryonen in 0,03 %PTU in Eiwasser gelegt, um die Pigmentbildung zu hemmen.

Fixieren Sie dechorionierte Embryonen oder Larven in 2 % oder 4 % PFA in PBS mit 0,1 % Tween 20 oder PFAT. Waschen Sie die Embryonen bei PBST viermal für jeweils 10 Minuten und stellen Sie sicher, dass die Proben zwischen den Waschgängen nicht austrocknen. Vor den Färbereaktionen werden die Teile A und B in getrennten Röhrchen frisch präpariert, dann vortexen und zentrifugieren Sie die Lösungen.

Es ist wichtig, die Teile A und B in getrennten Röhrchen zuzubereiten. Wenn Sie alle Komponenten direkt in ein einziges Rohr geben, führt dies sofort zu starken Niederschlägen. Geben Sie das gesamte Röhrchen von Teil A in das gesamte Röhrchen von Teil B. Mischen Sie es gut und verteilen Sie sofort einen Milliliter in jedes Mikrofuge-Röhrchen, das fixierte und gewaschene Embryonen enthält.

Wickeln Sie die Schläuche mit Aluminiumfolie ein und legen Sie sie bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln auf einen Rotator oder eine Schaukelplattform. Bestimmen Sie empirisch die Reaktionszeit, indem Sie ein Mikroskop verwenden, um chromogene Signale zu überwachen. Im Laufe der Zeit entwickeln sich leichte Ausfällungen, die den Reaktionsprozess nicht beeinträchtigen.

Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Embryonen mit PBST viermal für jeweils 10 Minuten waschen und dann die gefärbten Embryonen 60 Minuten lang mit 4%PFAT bei Raumtemperatur fixieren. Verwenden Sie für die Ganzmontagemikroskopie 50% Glycerin in PBS, um die Embryonen zu reinigen. Nachdem Sie sie mit der Rückenseite nach oben ausgerichtet haben, beobachten Sie die Proben mit einem aufrechten Mikroskop unter Hellfeldbeleuchtung.

Entferne das Eigelb und verwende es, um eine flache Halterung vorzubereiten. Nehmen Sie dann ein hochauflösendes Bild der Morphologie des interrenalen Gewebes auf. Um die vaskuläre Mikroumgebung des steroidogenen Gewebes zu analysieren, fixieren Sie die gefärbten Embryonen nachträglich mit 2%PFA.

Ergänzen Sie es eine Stunde lang mit 1% Triton X-100 bei vier Grad Celsius und verwenden Sie PBST-X, um die Embryonen viermal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur zu waschen. Um die Embryonen einzubetten, bereiten Sie 4%ige niedrigschmelzende Agarose vor, indem Sie Agarose in PBS bei 95 Grad Celsius auflösen. Dann aliquotieren Sie es in Mikrozentrifugenröhrchen und lagern bei vier bis acht Grad Celsius.

Schmelzen Sie ein Aliquot aus 4%iger niedrigschmelzender Agarose bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten, dann halten Sie das Aliquot bei 47 Grad Celsius. Verwenden Sie eine abgelöste Kappe von einem 1,5%-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen als Form, betten Sie einen Embryo in geschmolzene Agarose ein und lassen Sie ihn abkühlen, bis er fest ist. Um das Vibrationsschneiden durchzuführen, kleben Sie ein Stück Papierband auf die trockene Plattform des Vibratoms.

Entferne dann mit einer Rasierklinge den ausgehärteten Agaroseblock aus der Form. Tragen Sie Sekundenkleber auf das Papierband auf der Plattform auf und befestigen Sie den Agaroseblock mit der vorderen Seite der Probe nach oben auf dem Papierband. Schneiden Sie als Nächstes den Agaroseblock auf eine trapezförmige Prismenform mit etwa vier bis acht Millimetern auf jeder Seite der oberen und unteren Facette ab.

Verwenden Sie eine Pipette, die mit kaltem PBS mit 0,5 % Trident X-100 gefüllt ist, um den Agaroseblock zu spülen. Verwenden Sie dann ein Vibratom gemäß den Anweisungen des Herstellers, um 100-Mikrometer-Abschnitte vorzubereiten. Entfernen Sie mit einer 26-Gauge-Nadel geschnittene Abschnitte aus dem Vibratom und übertragen Sie sie auf eine Spotplatte, die 500 Mikroliter kaltes 0,5 %PBST-X pro Vertiefung enthält.

Sammeln Sie die drei Gewebeschnitte mit positiver Beta-Hsd-Aktivität, indem Sie sie unter einem Dissektionsmikroskop untersuchen, und übertragen Sie die Schnitte mit einer Pipettenspitze in eine 96-Well-Platte mit kaltem 0,5 %PBST-X. Färben und belichten Sie die Schnitte weiter gemäß dem Textprotokoll. Um zu bestimmen, wie sich steroidogenes Internierengewebe mit dem pronephrischen Nierenglomerulus und seinem entstehenden Gefäßsystem entwickelt, wurde der enzymatische Aktivitätsassay mit drei beta-Hsd an einem doppelt transgenen Zebrafischembryo durchgeführt, der sowohl nierenspezifische als auch endothelspezifische Fluoreszenz exprimierte.

Wie hier gezeigt, befinden sich drei beta-Hsd-positive steroidogene Gewebe rechts der Mittellinie und verhätscheln unmittelbar mit dem pronephrischen Nierenglomerulus. Einige steroidogene Zellen beginnen auch, über die Mittellinie zu wandern. Diese Vibratomschnitte von transgenen Embryonen, die endotheliale GFP exprimieren und dem drei beta-Hsd-Assay unterzogen wurden, wurden immunhistochemisch analysiert, um Fibronektin und seinen nachgeschalteten Effektor, die phosphorylierte fokale Adhäsionskinase, nachzuweisen.

Die peridorsale Aortenablagerung von Fibronektin ist essentiell für die Unterstützung des Wachstums der interrenalen Gefäße. Für den Fischembryo oder die Fischlarve kann die histochemische Färbung innerhalb eines Tages durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Obwohl diese Färbemethode einfach und schnell ist, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass nur ein einzelnes Enzym des steroidogenen Signalwegs nachgewiesen wird.

Wenn eine Entwicklungsanalyse des Internierengewebes angestrebt wird, muss zusätzlich zu diesem Assay eine in situ Besiedlung durchgeführt werden, um die Expression anderer kritischer Gene nachzuweisen, die an der Steroidogenese beteiligt sind.