Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

Das übergeordnete Ziel dieser Assay-Plattform ist es, einen aussagekräftigen Screening-Workflow bereitzustellen, der drei relevante Endpunkte, Viabilität, Biomasse und Biofilmmatrix, für die Identifizierung und Charakterisierung neuer Anti-Biofilm-Verbindungen kombiniert. Diese Plattform kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entdeckung von Antibiofilmwirkstoffen zu beantworten, indem sie eine frühzeitige Unterscheidung zwischen kurz- und langfristigen chemotherapeutischen Wirkungen in einer schnellen und verträglichen Weise ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser entwickelten Plattform besteht darin, dass sie verschiedene Assays kombiniert, um ein vollständigeres Bild der Anti-Biofilm-Wirkung chemischer Bibliotheken, insbesondere von Naturstoffen, zu erhalten.

Zu Beginn des Experiments bereiten Sie unbehandelte Kontrollproben mit 200 Mikrolitern von 10 bis sechs KBE pro Milliliter Bakterienkultur pro Vertiefung einer sterilen 96-Mikrotiterplatte vor. Integrieren Sie Mediensteuerungen ohne Bakterienkultur. Bereiten Sie anschließend auf denselben 96-Well-Platten Proben mit vier Mikrolitern 50-facher antibiotischer Stammlösung und 196 Mikrolitern der Bakterienkultur pro Vertiefung vor und inkubieren Sie die Kulturen.

Fahren Sie mit der Resazurin-Färbung fort, indem Sie die gesamte Planktonlösung mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig auf eine separate, saubere 96-Well-Platte übertragen, ohne die Biofilme zu berühren oder Luftblasen zu bilden. Waschen Sie die Biofilme erneut mit einer Mehrkanalpipette mit sterilem PBS, indem Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung hinzufügen, und entfernen Sie die Lösung vorsichtig. Geben Sie 200 Mikroliter 20 mikromolare Resazurinlösung pro Vertiefung der Biofilmplatte hinzu und inkubieren Sie den Biofilm im Dunkeln bei 200 U/min für 20 Minuten, bis die unbehandelten Biofilmkontrollen gleichmäßig rosa sind.

Messen Sie dann die Fluoreszenz mit einem Plattenleser. Entfernen Sie den Resazurin-Fleck vorsichtig aus den Vertiefungen. Fixieren Sie die Biofilme mit 200 Mikrolitern Methanol für 15 Minuten.

Entfernen Sie nach der Fixierung das Methanol und lassen Sie die Platte 10 Minuten an der Luft trocknen. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um vorsichtig 190 Mikroliter 0,02%ige Kristallviolettlösung in den Biofilm zu geben. Vermeiden Sie es, beim Pipettieren die Seiten der Vertiefungen mit dem Fleck zu berühren, verhindern Sie die Bildung von Luftblasen und drücken Sie die Pipette nicht, bis sie vollständig ausblasen.

Inkubieren Sie die Platte dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Fleck vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette. Waschen Sie den Biofilm mit 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser.

Lassen Sie die Vertiefungen fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen und lösen Sie den restlichen Fleck in 33%iger Essigsäure auf. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation wird die Extinktion bei 595 Nanometern abgelesen.

Messen Sie die Trübung bei 595 Nanometern der vorbereiteten, planktonischen Lösungsplatte. Dies kann während der Inkubation der kristallviolett gefärbten Platte erfolgen. Als nächstes färben Sie die planktonischen Bakterien mit Resazurin, indem Sie 10 Mikroliter der Resazurin-Brühe pro Vertiefung hinzufügen.

Pipettieren Sie die Lösung, um sie gut zu vermischen. Die Platte wird im Dunkeln bei Raumtemperatur (200 U/min) etwa fünf Minuten lang inkubiert, bis die unbehandelten Regler gleichmäßig rosa sind. Messen Sie dann die Fluoreszenz.

Besorgen Sie sich eine der parallelen Probenplatten für diese Färbung und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die planktonische Lösung aus den Vertiefungen zu entfernen. Waschen Sie die Vertiefungen einmal vorsichtig mit sterilem PBS, ohne die Biofilme zu berühren. Fügen Sie 200 Mikroliter Weizenkeimagglutinin oder WGA-Lösung pro Vertiefung hinzu, um sie zu färben.

Inkubieren Sie dann die Platte. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit PBS, um den ungebundenen Fleck zu entfernen. Lassen Sie die Platte 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.

Visualisieren Sie die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop und einem FITC-Filter. Lösen Sie den gebundenen Fleck in 200 Mikrolitern 33%iger Essigsäure pro Vertiefung auf. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Streifenkappen und beschallen Sie sie mit einem Wasserbad-Ultraschallgerät.

Nach der Beschallung inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie nach einer Stunde die Beschallung, während Sie die Vertiefungen zwischen den Beschallungsschritten dicht halten. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Plattenleser.

Nehmen Sie auch hier eine der parallelen Probenplatten für diese Färbung und entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette die planktonische Lösung aus den Vertiefungen. Waschen Sie dann die Vertiefungen einmal mit sterilem PBS. Fügen Sie sechs Mikroliter der Färbelösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang im Dunkeln.

Entfernen Sie vor der Mikroskopie die überschüssige Flüssigkeit manuell mit einer Mehrkanalpipette. Nehmen Sie die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Filter für grüne Fluoreszenz zur Visualisierung lebensfähiger Zellen und einem TRITC-Filter für rote Fluoreszenz zur Visualisierung toter Zellen auf. Verwenden Sie für diese Färbung eine der parallelen Probenplatten, entfernen Sie die planktonische Lösung aus den Vertiefungen und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit sterilem PBS mit einer Mehrkanalpipette.

Fügen Sie dann 200 Mikroliter der Färbelösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln. Messen Sie abschließend die Fluoreszenz mit einem Plattenreader. Es wurden zwei Screenings durchgeführt, um die Leistung der Plattform als Prozentsatz der unbehandelten Biofilmkontrolle zu demonstrieren.

Das Screening einer Bibliothek von Chinarindenalkaloidderivaten identifizierte einen Wirkstoff. Das Screening einer Bibliothek von Diterpenoiden und Derivaten vom Abietan-Typ identifizierte fünf Wirkstoffe. Penicillin G und Ciprofloxacin verringern beide signifikant die Lebensfähigkeit, die Biomasse und den PNAG-Gehalt der Biofilmmatrix vor der Biofilmbildung.

Dies war jedoch nicht der Fall, wenn die Postexposition verwendet wurde. Das prominenteste Ergebnis war die Zunahme der Biofilmmatrix auf über 200%, wenn vorgeformte Biofilme mit hohen Konzentrationen von Penicillin G behandelt wurden. Dieses Fluoreszenzbild bestätigt, dass Penicillin G etwa 50% der vorgeformten Staphylokokken-Biofilme und Bakterienpopulationen abtötet. Der Durchschnitt der grünen zu roten Fluoreszenzverhältnisse für die unbehandelten Biofilm-Wells deutet auf ein Überwiegen lebender Zellen hin.

Während mit Penicillin behandelte Vertiefungen etwa 56% lebende Zellen enthalten. Die nach der Penicillin-Behandlung am Leben bleibenden Zellen produzierten im Vergleich zu unbehandelten Biofilmen eine signifikant höhere Menge an extrazellulärer polymerer Substanz (EPS). Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, auf die manuelle Handhabung der Pipette zu achten, um eine Kontamination mit Bakterien und Flecken zwischen den Vertiefungen zu vermeiden.

Auf dieser Plattform können Antibiofilm-Verbindungen, die gegen Staphylococcus aureus wirksam sind, schnell identifiziert und charakterisiert werden. Wenn andere Bakterienarten verwendet werden, sind weitere Optimierungen der Färbeprotokolle erforderlich, aber die Logik der Plattform bleibt dieselbe.