Die Messung der differentiell methylierter INS DNA-Spezies in Humanserumproben als Biomarker von Islet β Cell Death

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, differentiell methylierte Präproinsulin-DNA-Spezies im menschlichen Serum als Biomarker für den Betazelltod zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich Diabetes zu beantworten, wie z. B. ob der Betazelltod zu einem bestimmten Zeitpunkt während der Entwicklung von Typ-1-Diabetes auftritt? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir durch die Verwendung der digitalen PCR die Menge des Betazelltods in sehr kleinen Mengen Serum bestimmen können.

Nach der Entnahme von Serum aus menschlichen Blutproben gemäß dem Textprotokoll werden 200 Mikroliter Lysepuffer und ein Mikroliter Poly(A) pro Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet. Wirbeln Sie die Röhre 15 Sekunden lang durch. Nehmen Sie Serumproben aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.

Verwenden Sie dann PBS, um das Volumen der Serumprobe auf 200 Mikroliter zu erhöhen. Die Proben werden durch Zugabe von 20 Mikrolitern Protease und 200 Mikroletern des Lysepuffers Poly(A)mix lysiert. Wirbeln Sie die Röhrchen acht Sekunden lang vor und inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 56 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen sieben Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit. Fältitieren Sie die DNA, indem Sie den Proben 230 Mikroliter 100%iges Ethanol zusetzen und die Röhrchen acht Sekunden lang vortexen. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen sieben Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit.

Tragen Sie anschließend 600 Mikroliter Probenmischungen auf die Spin-Säulen auf und zentrifugieren Sie die Säulen eine Minute lang bei 6000 mal G. Entsorgen Sie den Durchfluss und legen Sie die Säulen in saubere Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroleter Waschpuffer eins in die Säulen und zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 6000 mal G.

Entsorgen Sie dann den Durchfluss und legen Sie die Säulen in saubere Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroleter Waschpuffer zwei in die Säulen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei Höchstgeschwindigkeit. Setzen Sie dann die Säulen in neue 1,5-Millileter-Mikrozentrifugenröhrchen ein und drehen Sie sie erneut eine Minute lang.

Um die DNA zu eluieren, setzen Sie die Säulen in neue 1,5-Millileter-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 60 Mikroliter Elutionspuffer direkt in die Filter. Nachdem die Säulen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubugiert wurden, zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 6000 mal G. Entsorgen Sie die Säule und lagern Sie die Proben, bis sie für die Bisulfitumwandlung bereit sind.

Um unmethylierte Cytosine in Uracile umzuwandeln, fügen Sie 130 Mikroleter Bisulfit-Umwandlungsreagenz zu 20 Mikroletern DNA in PCR-Röhrchen hinzu. Mischen Sie die Proben 20 Mal, indem Sie auf und ab pipettieren und die Röhrchen kurz drehen, um sicherzustellen, dass sich keine Tropfen an den Seiten oder am Deckel befinden. Inkubieren Sie die Proben in einem Wasserbad oder Thermocycler, wie hier gezeigt.

Legen Sie die Säulen in die dafür vorgesehenen Sammelröhrchen und geben Sie 600 Mikroliter Bindungspuffer in die Spin-Säulen. Tragen Sie die bisulfitierte DNA auf die Säulen auf und mischen Sie, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie dann die Proben 30 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit und verwerfen Sie den Durchfluss.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden lang. Um dann die Sulfinatgruppen zu entfernen, um die Umwandlung von unmethylierten Cytosinen in Uracil abzuschließen, fügen Sie den Säulen 200 Mikroleter Desulfinierungspuffer hinzu. Nachdem Sie die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen haben, zentrifugieren Sie die Säulen 30 Sekunden lang.

Waschen Sie die DNA, indem Sie 200 Mikroleter Waschpuffer in die Säulen geben und sie 30 Sekunden lang zentrifugieren. Entsorgen Sie dann den Durchfluss und wiederholen Sie den Waschschritt. Legen Sie die Säulen in 1,5-Millilitere-Mikrozentrifugenröhrchen und eluieren Sie die DNA, indem Sie 10 Mikroliter Elutionspuffer direkt in die Säulenfilter geben.

Inkubieren Sie die Proben eine Minute lang und drehen Sie sie dann 30 Sekunden lang, um die DNA zu eluieren. Entsorgen Sie die Säulen und lagern Sie die Proben. Quantifizieren Sie die zurückgewonnene DNA durch Spektrophotometrie bei einer Absorption von 260 Nanometern.

Erstellen Sie einen Mastermix mit genügend Lösung für jedes Sample und jede Kontrolle. Mindestens eine Probe, die Wasser enthält, eine Probe eines Plasmids, das unmethyliertes Insulin enthält, und eine Probe, die eine Eins-zu-Eins-Mischung von Plasmiden enthält, ist einzubeziehen. Richten Sie Multiplex-PCR-Reaktionen in einer 96-Well-Platte ein, indem Sie zunächst 19,5 Mikroleter Mastermix in jede Vertiefung geben.

Geben Sie 2,5 Mikroliter der in Bisulfit umgewandelten DNA-Probe in die entsprechenden Vertiefungen. Mischen Sie dann die Vertiefungen, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Verwenden Sie Folie und einen Plattenversiegeler, um die Platte zu versiegeln, und zentrifugieren Sie sie in einem Plattenschleuder, bis sich keine Flüssigkeit mehr an den Seiten der Vertiefungen befindet.

Um den automatischen Tröpfchengenerator auf dem Touchscreen einzurichten, stellen Sie die Anzahl der verwendeten Reihen ein, indem Sie die Reihen berühren, in denen die Proben in die Vertiefungen der Platte geladen werden. Um eine Kontamination zu vermeiden, laden Sie die Verbrauchsmaterialien von hinten nach vorne, beginnend mit Kartuschen in der hinteren Reihe des Geräts. Lege dann die Spitzen in die mittlere Reihe.

Setzen Sie als Nächstes die 96-Well-Platte in das Instrument ein. Nachdem Sie einen kalten Block aus dem minus 20 Grad Celsius Gefrierschrank genommen haben, legen Sie eine neue 96-Well-Platte mit Rand hinein. Setzen Sie den Block mit der Platte in das Gerät ein, neben der Platte mit den Proben.

Geben Sie Öl in den Spender vor dem Gerät und wählen Sie die Ölsorte auf dem Touchscreen aus. Berühren Sie die blaue Start-Schaltfläche, um den Lauf zu starten. Bestätigen Sie dann die Einrichtung der Platte und berühren Sie die Schaltfläche Start Run, um zu beginnen.

Sobald der Lauf beendet ist, entfernen Sie die 96-Well-Platte, die die neu gebildeten Tröpfchen enthält, und versiegeln Sie sie mit einem Plattenversiegelungsgerät. Führen Sie nun die PCR in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm durch. Legen Sie die Platte auf den Tröpfchenleser und richten Sie den Leser ein, indem Sie auf die Registerkarte Setup klicken.

Öffnen Sie dann eine neue Vorlage, indem Sie auf Vorlage Neu klicken. Verwenden Sie den Well-Editor, um die Parameter für jede Probe festzulegen. Geben Sie jeder Probe einen eindeutigen Namen.

Stellen Sie das Experiment auf "Erkennung seltener Ereignisse" und den Master-Mix auf den Mix, der zur Vorbereitung der Reaktion verwendet wurde. Geben Sie Ziel 1 einen Namen, z. B. Unmethyliert, und legen Sie Ziel 1 als unbekannt fest, oder U.Geben Sie Ziel 2 einen Namen, z. B. Methyliert, und legen Sie Ziel 2 als Referenz fest, oder R.Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen, um die Ausführung zu starten, und geben Sie einen Dateinamen ein. Wählen Sie dann im Fenster Ausführungsoptionen die Nachweischemie aus.

Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Ergebnisse auf der Registerkarte Analysieren und verwenden Sie das 2D-Diagramm basierend auf positiven Kontrollen, um die Daten zu analysieren. Diese Abbildung zeigt die 2D-Streudiagramme, die Tröpfchen für die Plasmidkontrolle entsprechen und umgewandelte Bisulfit-DNA, unmethylierte Insulin-DNA, methylierte Insulin-DNA und eine Eins-zu-Eins-Mischung der beiden Plasmide enthalten. Beachten Sie, dass es in diesem Panel eine leichte Verschiebung der FAM-positiven Tröpfchen in den VIC-Kanal gibt, was auf die Sonde für die methylierte Insulin-DNA hinweist.

In ähnlicher Weise gibt es eine sehr geringe Verschiebung der VIC-positiven Tröpfchen im FAM-Kanal, was auf eine Kreuzreaktivität der Sonde für unmethylierte DNA mit methylierter DNA hinweist. Um die Linearität der Primer zu demonstrieren, wurden Mischungen der beiden Plasmide über mehrere Größenordnungen in den PCR-Reaktionen verwendet. Wie hier gezeigt, können unterschiedliche Konzentrationen eines Plasmids in Gegenwart einer konstanten Menge des zweiten Plasmids linear detektiert werden.

In dieser Abbildung wurden Proben von vier Personen mit neu aufgetretenem Typ-1-Diabetes und vier Kontrollproben ohne Typ-1-Diabetes analysiert. Die Daten zeigen, dass Personen mit Typ-1-Diabetes im Vergleich zu Kontrollen erhöhte Spiegel an unmethylierter und methylierter Insulin-DNA aufweisen, wie zuvor gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden für 30 Samples durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Kontamination bei allen Schritten zu vermeiden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Diabetes, die Verwendung dieser Technik als Biomarker für die Entwicklung von Typ-1-Diabetes zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Menge des Betazelltods bestimmen können, indem Sie unmethyliertes und methyliertes Präproinsulin in zellfreier DNA aus menschlichem Serum messen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DNA-Extraktionspuffern äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel und der Verzicht auf die Verwendung von Desinfektionsmitteln, die Bleichmittel enthalten, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.