Name: Die Messung der differentiell methylierter INS DNA-Spezies in Humanserumproben als Biomarker von Islet β Cell Death (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie differentiell methylierte INS-DNA in Humanserum mittels digitaler PCR als Biomarker für β-Zelltod messen. Diese Methode ermöglicht frühe Diagnose und Therapieansätze bei Diabetes Typ 1.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Institutes of Health Grant UC4 DK104166 (an RGM). Wir möchten uns für die Unterstützung des Indiana Diabetes Research Center Translation Core bedanken, der durch den Zuschuss P30 DK097512 der National Institutes of Health unterstützt wird.

Ethikerklärung: Die Protokolle wurden vom Indiana University Institutional Review Board genehmigt. Die Eltern der Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, und Kinder über 7 Jahren gaben ihre Zustimmung zur Teilnahme.
1. Serum-Verarbeitung
HINWEIS: Der beschriebene Assay wurde streng mit Humanserum getestet, das wie folgt isoliert wurde.
<ol>
	<li>Sammeln Sie Blut in einem roten oberen Blutentnahmeröhrchen (ohne Zusatzstoffe; unbeschichtet).</li>
	<li>30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen, damit sich das Gerinnsel bilden kann.</li>
	<li>Zentrifugenröhrchen bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand (Serum) in ein neues Röhrchen, das für die Serumlagerung vorgesehen ist (Schraubröhrchen aus Polypropylen, Größe abhängig von den Proben).</li>
	<li>Lagern Sie die Proben bei -80 ºC, bis sie für die DNA-Isolierung bereit sind.</li>
</ol>
2. Serum-DNA-Extraktion
HINWEIS: Die DNA wird mit einem DNA-Extraktionskit mit 50 μl Serum (empfohlen) extrahiert, wobei das Protokoll des Herstellers mit einigen Änderungen eingehalten wird.
<ol>
	<li>Bereiten Sie 200 μl Lysepuffer + 1 μl Poly(A) (5 μg) pro Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor. 15 Sek. lang vortexen. Bis Schritt 2.3 beiseite stellen.</li>
	<li>Nehmen Sie Serumproben aus dem -80 ºC Gefrierschrank und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Erhöhen Sie das Serumprobenvolumen auf insgesamt 200 μl mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid).</li>
	<li>Die Probe wird lysiert, indem der Probe 20 μl Protease (1,4 Anson-Einheiten/ml) zugesetzt werden, gefolgt von 200 μl Lysepuffer/PolyA-Mischung (aus Schritt 2.2) und 8 Sekunden lang vortexen. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 56 °C inkubiert, dann 7 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (>10.000 x g) kurz zentrifugiert.</li>
	<li>Ausfällung der DNA durch Zugabe von 230 μl 100 % Ethanol zur Probe und 8 Sekunden lang vortexen. 7 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) kurz zentrifugieren.</li>
	<li>Tragen Sie die DNA auf die Spin-Säule auf, indem Sie 600 μl Probenmischung in die Mini-Spin-Säule geben. Bei 6.000 x g 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss und stellen Sie die Säule in ein sauberes Rohr.</li>
	<li>Waschen Sie die DNA, indem Sie 500 μl Waschpuffer 1 in die Säule geben. Bei 6.000 x g 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss und stellen Sie die Säule in ein sauberes Rohr. 500 μl Waschpuffer 2 in die Säule geben und bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) 3 min zentrifugieren. Setzen Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein und zentrifugieren Sie erneut 1 Minute lang mit Höchstgeschwindigkeit.</li>
	<li>Eluieren Sie die DNA, indem Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen legen und 60 μl Elutionspuffer direkt auf den Filter geben. Es ist wichtig, die Spitzen zwischen den Proben zu wechseln, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann 1 min bei 6.000 x g zentrifugieren. Fügen Sie weitere 60 μl Elutionspuffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für 1 min. </li>
	<li>Lagern Sie die DNA für die spätere Verwendung bei -20 ºC oder fahren Sie sofort mit der Bisulfitumwandlung fort.</li>
</ol>
3. Bisulfit-Umwandlung
HINWEIS: Die Bisulfit-Umwandlung wird mit einem Bisulfit-Umrüstsatz durchgeführt, der dem Protokoll des Herstellers mit einigen Änderungen folgt.
<ol>
	<li>Um unmethylierte Cytosine in Uracile umzuwandeln, geben Sie 130 μl Bisulfit-Umwandlungsreagenz zu 20 μl DNA aus Schritt 2.7 in ein PCR-Röhrchen (einzelnes 0,2-ml-PCR-Röhrchen oder 8-Streifen-PCR-Röhrchen). Bewahren Sie die restlichen 40 μl DNA für die zukünftige Verwendung oder die Verwendung in Replikatreaktionen auf. 20 Mal mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und kurz zentrifugieren, um sicherzustellen, dass keine Tropfen an den Seiten oder am Deckel sind. In einem Wasserbad oder Thermocycler wie folgt inkubieren: 98 °C für 8 min, 54 °C für 60 min, 4 °C für 5 min.
	<ol>
		<li>Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort oder lagern Sie es bis zu 20 Stunden bei 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Geben Sie 600 μl Bindungspuffer in die Spin-Säule und legen Sie die Säule in das mitgelieferte Auffangröhrchen. Tragen Sie die bisulfitierte DNA auf die Säule auf und mischen Sie, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) 30 Sekunden lang zentrifugieren. Durchfluss verwerfen.</li>
	<li>Waschen Sie die DNA, indem Sie 100 μl Waschpuffer in die Säule geben und 30 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) zentrifugieren.</li>
	<li>Führen Sie eine Desulfonierung durch, um die Sulfonatgruppe zu entfernen, um die Umwandlung von unmethylierten Cytosinen in Uracil abzuschließen, indem Sie der Säule 200 μl Desulphonationspuffer hinzufügen. 20 min bei Raumtemperatur ziehen lassen, dann 30 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) zentrifugieren.</li>
	<li>Waschen Sie die DNA, indem Sie 200 μl Waschpuffer in die Säule geben und 30 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie diesen Waschschritt.</li>
	<li>Setzen Sie die Säule in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein. Eluieren Sie DNA, indem Sie 10 μl Elutionspuffer direkt in den Säulenfilter geben. 1 Min. inkubieren. Zentrifugieren Sie 30 s lang bei voller Geschwindigkeit, um die DNA zu eluieren. Quantifizierung der wiedergewonnenen DNA durch Spektrophotometrie bei A260. 
	HINWEIS: Die durch Spektrophotometrie detektierte DNA stellt in erster Linie die Träger-PolyA-DNA dar, die in Schritt 2.3 oben hinzugefügt wurde. Typischerweise beträgt die Wiederfindung von PolyA ≥85 % des Eingangs (>4,25 μg).</li>
	<li>Lagern Sie die DNA bei -20 °C, bis Sie mit der digitalen PCR fortfahren können.</li>
</ol>
4. Digitale Multiplex-PCR
<ol>
	<li>Erstellen Sie einen Mastermix mit genügend Lösung für jedes Sample und jede Kontrolle. Mindestens eine Probe, die Wasser enthält (Negativkontrolle), eine Probe eines Plasmids, das unmethyliertes INS enthält (1 pg, Positivkontrolle), eine Probe eines Plasmids, das methyliertes INS enthält (1 pg, Positivkontrolle), und eine Probe, die eine 1:1-Mischung von Plasmiden enthält.
	<ol>
		<li>Zur Herstellung des PCR-Mastermixes fügen Sie 12,5 μl pro Reaktion PCR-Puffer (z. B. 125 μl pro 10 Proben), 1,25 μl pro Reaktionsprimer/Sonden-Mix (z. B. 12,5 μl pro 10 Proben), 8,25 μl pro Reaktionswasser (z. B. 82,5 μl pro 10 Proben), 0,5 μl pro Reaktion EcoR1-Enzym (z. B. 5 μl pro 10 Proben). 
		HINWEIS: Die hier verwendeten Primer und Sonden sind wie folgt: Forward Primer: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTTTTTAGTTATTTGT-3'; Rückseitige Grundierung: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; FAM-Sonde: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; VIC-Sonde: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Richten Sie die Multiplex-PCR-Reaktion in einer 96-Well-Platte ein. Geben Sie 19,5 μl Mastermix in jede Vertiefung. Geben Sie 2,5 μl Bisulfit-umgewandelte DNA-Probe in jede geeignete Vertiefung (bewahren Sie die restlichen 7,5 μl Bisulfit-umgewandelte DNA auf oder verwenden Sie sie in Replikatreaktionen). Mischen Sie, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. 
	HINWEIS: Alle 8 Vertiefungen in einer Reihe müssen eine Proben- oder Pufferkontrolle enthalten.</li>
	<li>Versiegeln Sie mit einer Folienversiegelung mit einem Plattenversiegeler und zentrifugieren Sie in einem Plattenschleuder, bis sich keine Flüssigkeit mehr an den Seiten der Vertiefungen befindet.</li>
	<li>Richten Sie den automatischen Tröpfchengenerator auf dem Touchscreen ein. 
	HINWEIS: Alle 8 Vertiefungen in der Kartusche müssen eine Proben- oder Pufferkontrolle enthalten.
	<ol>
		<li>Legen Sie die Anzahl der zu verwendenden Zeilen fest, indem Sie die Zeile(n) berühren, in die die Proben auf der 96-Well-Platte aus Schritt 4.2 geladen werden, und markieren Sie die Zeile blau, um eine aktive Reihe anzuzeigen.</li>
		<li>Laden Sie Verbrauchsmaterialien von hinten nach vorne, um Kontaminationen zu vermeiden. Fügen Sie zunächst Kartuschen in der hinteren Reihe des Instruments hinzu. Legen Sie die Spitzen in die mittlere Reihe des Instruments. 
		HINWEIS: Die Patronen können nur in der richtigen Ausrichtung in die Halterungen passen.</li>
		<li>Setzen Sie die 96-Well-Platte in das Gerät ein. Nehmen Sie einen kalten Block aus dem -20 °C-Gefrierschrank und setzen Sie eine neue 96-Well-Platte mit Rand hinein. Platzieren Sie es im Gerät neben der mit der Probe bestückten 96-Well-Platte.</li>
		<li>Geben Sie Öl in den Spender an der Vorderseite des Geräts. Wählen Sie die Ölsorte auf dem Touchscreen aus.</li>
		<li>Berühren Sie die blaue Starttaste, um den Lauf zu starten. Bestätigen Sie die Einrichtung der Platte und berühren Sie die Start-Run-Taste, um zu beginnen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die 96-Well-Platte, die die neu gebildeten Tröpfchen enthält, und versiegeln Sie sie mit einer Folienversiegelung mit einem Plattenversiegeler.</li>
	<li>Führen Sie die PCR10 auf einem Thermocycler mit folgendem Programm durch: 95 °C für 10:00 min; 40 Zyklen bei: 94 °C für 00:30 min, 57,5 °C für 01:00 min; 98 °C für 10:00 min; 12 °C für 10 min oder bis zu 24 Stunden.</li>
	<li>Legen Sie die Platte auf den Tröpfchenleser und richten Sie den Leser ein.
	<ol>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Setup. Öffnen Sie eine neue Vorlage, indem Sie auf Vorlage > neu klicken. Geben Sie einen Dateinamen ein.</li>
		<li>Verwenden Sie den Well-Editor, um die Parameter für jede Probe festzulegen. Geben Sie jedem Sample einen eindeutigen Namen, stellen Sie das Experiment auf Rare Event Detection (R-RED) und den Master-Mix auf den in Schritt 4.1 verwendeten Mix ein.</li>
		<li>Geben Sie Ziel 1 einen Namen (d. h. unmethyliert) und setzen Sie Ziel 1 auf unbekannt (U). Geben Sie Ziel 2 einen Namen (d. h. methyliert) und setzen Sie Ziel 2 als Referenz (R).</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen, um die Ausführung zu starten. Wählen Sie im Fenster mit den Ausführungsoptionen die Nachweischemie (FAM/VIC) aus.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Datenanalyse
<ol>
	<li>Öffnen Sie die Ergebnisse auf der Registerkarte "Analysieren" und analysieren Sie mit einem 2D-Diagramm auf der Grundlage positiver Kontrollen (siehe Abbildung 1).</li>
	<li>Exportieren Sie die vom Droplet-Reader generierte CSV-Datei zur Datenanalyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
	<li>Um "Kopien pro μl" Serum zu erzeugen, verwenden Sie die Formel: (Konzentration*250)/(Volumen des für die DNA-Isolierung verwendeten Serums in μl). 6 
	HINWEIS: Die Daten werden in der Regel in log10 konvertiert, wenn sie aus Humanserum gewonnen werden, um eine Normalverteilung zu gewährleisten. Alternativ können die Daten auf einer logarithmischen10-Skala dargestellt und durch nicht-parametrische Statistiken analysiert werden.</li>
</ol>
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</style>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Methylierung von Cytosin durch DNA-Methyltransferasen ermöglicht die epigenetische Kontrolle der Transkription bei vielen Genen. Das INS - Gen beim Menschen wird fast ausschließlich in islet β - Zellen exprimiert, und es scheint Silencing seiner Transkriptions 11 eine Korrelation zwischen der Häufigkeit der Methylierung von Cytosin in dem INS - Gen zu sein. Als solches zeigen die meisten Zelltypen wesentlich höhere Frequenzen der Methylierung des INS - Gen an verschiedenen Cytos...

Typ - 1 - Diabetes (T1D) ist eine Autoimmunerkrankung , die durch die Zerstörung der Insulin produzierenden Inselzellen β - Zellen durch autoreaktive T - Zellen 1 gekennzeichnet ist. Die Diagnose von T1D ist in der Regel bei der Messung von Hyperglykämie (Blutzucker&gt; 200 mg / dl) in einem schlanken, jungen Person gemacht, die mit einer Ketoazidose als Beweis für Insulinmangel darstellen könnten. Zum Zeitpunkt der Diagnose von T1D gibt es Hinweise für einen wesentlichen Verlust von β - Zellfunktion und Masse (50-90%) 2. In klinischen Studien wurden mehrere immunmodulatorischen Medikamente, die zum Zeitpunkt der Diagnose eingeleitet wurden führte zur Stabilisierung der β-Zellfunktion (und vermutlich Masse), aber keine haben in klinischer Remission der Erkrankung führte, eine Feststellung, dass die Forderung nach der Entwicklung erhöht hat von Biomarkern für frühere Erkennung der Krankheit und für die Längs Verfolgung der Wirksamkeit von Kombinationstherapien 3,4. Die Bemühungen der internationalen Konsortien, eine solchedas Human Islet Research Network Consortium s an den National Institutes of Heath 5, haben die Notwendigkeit zur Entwicklung von Biomarkern betont , dass in T1D auf β Zellstress und Tod konzentrieren. Im Einklang mit diesen Bemühungen haben unsere Gruppe und andere kürzlich Biomarker - Assays entwickelt, die epigenetisch modifizierte DNA - Fragmente messen zirkulierenden , die von sterbenden β - Zellen 6 in erster Linie entstehen - 9. In allen veröffentlichten Assays bisher hat sich der Schwerpunkt auf die Quantifizierung des humanen kodierenden Gens Präproinsulin (INS) gewesen, der größer Grade unmethylierte CpG - Stellen in den Codierungs- und Promotorregionen im Vergleich zu anderen Zelltypen veranschaulicht. Die Befreiung von nicht - methylierten INS DNA - Fragmente wurde die Hypothese aufgestellt , als in erster Linie vom Sterben (nekrotischen, apoptotischen) β - Zellen entstehen. Unsere jüngsten Studien haben gezeigt , dass in der Jugend, Erhöhungen in sowohl unmethylierte und methylierte DNA INS an Position -69 bp (bezogen auf ter Transkriptionsstartstelle) wurden in neu einsetzende T1D beobachtet und diente zusammen als spezifische Biomarker für diese Population 6. Diese Biomarker Assays beinhalten die Isolierung von zellfreien DNA aus Serum oder Plasma unter Verwendung handelsüblicher Kits Spin, gefolgt von einer Bisulfit-Umwandlung von der isolierten DNA (an nicht-methylierte Cytosine bis uracile konvertieren, so dass methylierte Cytosine intakt). In diesem Bericht beschreiben wir die technischen Aspekte der Serumprobe Sammlung, Isolierung von zellfreien DNA aus Serum, Bisulfitumwandlung und Leistung von Tröpfchen digitalen PCR (von nun an, digitale PCR) für differentiell methyliert INS DNA.

<table><tbody><tr><td>Roter Top Vacutainer&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>ohne Zusatzstoffe, unbeschichtete Innenseite, 10 ml</td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>Polypropylen, Röhrchen mit Schraubverschluss, jede Größe</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>ungeliebt in TE-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) bis 5 &; Mikro; g/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (mit CaCl2 und MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml PCR 8-Streifen Röhrchen</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8-Streifen Kappen, Dome</td><td></td><td>MidSci AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylierung-Lightning Kit</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix für Sonden (ohne dUTP)</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>Pufferkontrolle für Sonden</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe Mix</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, Eppendorf</td><td></td><td>951020346</td><td></td> mit halbem Rand</tr><tr><td>Durchstechbare Folien-Heißsiegelung</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR-Plattenversiegelung</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Tröpfchen-Digital-PCR-System</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>automatisiertes Tröpfchenerzeugungsöl für Sonden</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 Kartusche für automatisierten Tröpfchengenerator</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen für den automatischen Tröpfchengenerator</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzenbehälter für den automatischen Tröpfchengenerator</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchenleser</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Tröpfchenleser Öl</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

die messung der differentiell methylierter<em&gt; ins</em&gt; dna-spezies in humanserumproben als biomarker von islet β cell death

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

Es wird angenommen, dass das Absterben von Inselzellen β der Pathogenese praktisch aller Formen von Diabetes zugrunde liegt und der Entwicklung von offener Hyperglykämie, insbesondere bei Typ-1-Diabetes, vorausgeht. Die Entwicklung sensitiver und zuverlässiger Biomarker für den β Zelltod kann ein frühzeitiges therapeutisches Eingreifen ermöglichen, um die Entwicklung von Diabetes zu verhindern oder zu verzögern. Kürzlich haben mehrere Gruppen, darunter auch unsere eigene, berichtet, dass zellfreie, differentiell methylierte DNA, die für Preproinsulin (INS) im Blutkreislauf kodiert, mit dem β Zelltod bei Prä-Typ-1-Diabetes und neu aufgetretenem Typ-1-Diabetes korreliert. In dieser Arbeit stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit digitaler PCR zur Messung von zellfreier INS-DNA vor, die am Cytosin an der Position -69 bp (relativ zur transkriptionellen Startstelle) differentiell methyliert ist. Wir zeigen, dass der Assay zwischen methyliertem und unmethyliertem Cytosin an Position -69 bp unterscheiden kann, über mehrere Größenordnungen linear ist, eine absolute Quantifizierung der DNA-Kopienzahlen ermöglicht und auf Proben von humanem Serum von Personen mit neu aufgetretenem Typ-1-Diabetes und krankheitsfreien Kontrollen angewendet werden kann. Das hier beschriebene Protokoll kann an jede DNA-Spezies angepasst werden, für die der Nachweis von differentiell methylierten Cytosinen gewünscht wird, sei es aus dem Blutkreislauf oder aus isolierten Zellen und Geweben, und kann eine absolute Quantifizierung von DNA-Fragmenten ermöglichen.

Um Daten in geeigneter Weise zu interpretieren, verwenden wir Plasmid - Kontrollen sowohl für die unmethylierte und methylierte Ziel INS DNA in jeder digitalen PCR - Lauf. Diese Kontrollen stellen sicher, dass Signale an methylierter und nicht methylierter DNA entsprechen, sind klar zu unterscheiden. Abbildung 1 zeigt die 2-D Streudiagramme zu Tröpfchen für Plasmid Kontrollen enthält Bisulfit umgewandelt unmethylierte INS DNA (1A) entsp...

Inselzelltod β der Entwicklung von Typ-1-Diabetes vorausgeht, und die Erkennung dieses Prozesses könnte eine frühzeitige therapeutische Intervention ermöglichen. Hier geben wir eine detaillierte Beschreibung, wie differentiell methylierte INS-DNA-Spezies in humanem Serum als Biomarker für β Zelltod gemessen werden können.

Die Messung der differentiell methylierter<em&gt; INS</em&gt; DNA-Spezies in Humanserumproben als Biomarker von Islet β Cell Death

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, unterschiedlich methylierte Präproinsulin-DNA-Arten im menschlichen Serum als Biomarker für den Betazelluntergang zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Diabetesforschungsbereich zu beantworten, beispielsweise, ob ein Betazelluntergang zu einem bestimmten Zeitpunkt während der Entstehung des Typ-1-Diabetes auftritt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir mithilfe der digitalen PCR die Menge an Betazelluntergang in sehr geringen Serumvolumina bestimmen können.Nachdem Serum gemäß dem Textprotokoll aus menschlichen Blutproben gewonnen wurde, bereiten Sie 200 Mikroliter Lysepuffer und ein Mikroliter Poly(A) pro Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor. Vortexen Sie das Röhrchen 15 Sekunden lang. Entnehmen Sie die Serumproben aus dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen.Anschließend mit PBS das Volumen der Serumprobe auf 200 Mikroliter auffüllen. Die Proben durch Zugabe von 20 Mikrolitern Protease und 200 Mikrolitern des Lysepuffers poly(A)mix lysieren. Die Röhrchen acht Sekunden lang verwirbeln und die Proben anschließend 10 Minuten bei 56 Grad Celsius inkubieren.Anschließend die Röhrchen sieben Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Das DNA-Präzipitat durch Zugabe von 230 µL 100 %igem Ethanol zu den Proben fällen und die Röhrchen acht Sekunden lang verwirbeln. Danach die Röhrchen erneut sieben Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.Als Nächstes 600 Mikroliter der Probenmischungen auf Spin-Säulen auftragen und die Säulen bei 6000 × g eine Minute lang zentrifugieren. Den Durchlauf entsorgen und die Säulen in saubere Röhrchen stellen. 500 Mikroliter Waschpuffer eins zu den Säulen hinzufügen und die Proben bei 6000 × g eine Minute lang zentrifugieren.Entfernen Sie dann den Durchlauf und stellen Sie die Säulen in saubere Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter Waschpuffer zwei zu den Säulen hinzu und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit. Stellen Sie anschließend die Säulen in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie erneut eine Minute lang.Um die DNA zu eluieren, setzen Sie die Säulen in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 60 Mikroliter Elutionspuffer direkt auf die Filter. Nach einer fünfminütigen Inkubation der Säulen bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang mit 6000 × g. Entsorgen Sie die Säule und lagern Sie die Proben, bis sie für die Bisulfitumwandlung bereit sind.Um unmethylierte Cytosine in Uracile umzuwandeln, geben Sie 130 µL Bisulfit-Umsetzungsreagenz zu 20 µL DNA in PCR-Röhrchen. Mischen Sie die Proben durch 20-maliges Auf- und Abpipettieren und zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz, um sicherzustellen, dass keine Tropfen an den Seiten oder am Deckel haften. Inkubieren Sie die Proben wie hier gezeigt in einem Wasserbad oder Thermocycler.Stellen Sie die Säulen in die bereitgestellten Sammelröhrchen und geben Sie 600 Mikroliter Bindungspuffer zu den Säulchen hinzu. Geben Sie die bisulfitbehandelte DNA auf die Säulen und mischen Sie sie durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben bei maximaler Drehzahl für 30 Sekunden und entsorgen Sie den Durchlauf.Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter Waschpuffer auf die Säule hinzu und zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang. Danach geben Sie 200 Mikroliter Desulfonierungspuffer auf die Säulen, um die Sulfinatgruppen zu entfernen und die Umwandlung unmethylierter Cytosine in Uracil abzuschließen. Lassen Sie die Proben 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen und zentrifugieren Sie die Säulen anschließend 30 Sekunden lang.Waschen Sie die DNA, indem Sie 200 Mikroliter Waschpuffer zu den Säulen hinzufügen und diese 30 Sekunden lang zentrifugieren. Entsorgen Sie dann den Durchlauf und wiederholen Sie den Waschschritt. Setzen Sie die Säulen in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und eluieren Sie die DNA, indem Sie 10 Mikroliter Elutionspuffer direkt auf die Säulenfilter geben.Die Proben eine Minute lang inkubieren, dann 30 Sekunden zentrifugieren, um die DNA eluieren zu lassen. Die Säulen entsorgen und die Proben lagern. Die gewonnene DNA durch Spektrophotometrie bei einer Absorption von 260 Nanometern quantifizieren.Stellen Sie eine Master-Mix-Lösung in ausreichender Menge für jede Probe und Kontrolle her. Fügen Sie mindestens eine Probe mit Wasser, eine Probe mit einem Plasmid, das unmethyliertes Insulin enthält, und eine Probe mit einer 1:1-Mischung der Plasmide hinzu. Richten Sie Multiplex-PCR-Reaktionen in einer 96-Well-Platte ein, indem Sie zunächst 19,5 µL Mastermix in jedes Well geben.Fügen Sie 2,5 µL der bisulfitkonvertierten DNA-Probe in die entsprechenden Vertiefungen hinzu. Mischen Sie anschließend die Ansätze durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Versiegeln Sie die Platte mit einer Aluminiumfolie und einem Plattenverschluss und zentrifugieren Sie sie in einem Plattenzentrifugen, bis keine Flüssigkeit mehr an den Seiten der Vertiefungen haftet.Um den automatisierten Tropfengenerator auf dem Touchscreen einzurichten, legen Sie die Anzahl der verwendeten Reihen fest, indem Sie die Reihen antippen, in denen die Proben in die Vertiefungen der Platte geladen werden. Um Kontaminationen zu vermeiden, laden Sie die Verbrauchsmaterialien von hinten nach vorne, beginnend mit den Kartuschen entlang der hinteren Reihe des Geräts. Anschließend laden Sie die Spitzen in die mittlere Reihe.Als Nächstes die 96-Well-Platte in das Gerät geben. Danach, nachdem ein Kühlblock aus dem Minus-20-Grad-Celsius-Gefrierschrank entnommen wurde, eine neue randlose 96-Well-Platte in den Block setzen. Den Block mit der Platte neben die Probeplatte in das Gerät einsetzen.Öl in die vor dem Gerät befindliche Dosiereinheit geben und die Art des Öls auf dem Touchscreen auswählen. Zum Starten den blauen Start-Button berühren. Anschließend die Plattenkonfiguration bestätigen und den Start-Lauf-Button berühren, um zu beginnen.Nach Beendigung des Laufs die 96-Well-Platte mit den neu gebildeten Tröpfchen entnehmen und mit einer Plattenversiegelung aus Folie verschließen. Führen Sie nun eine PCR in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm durch. Legen Sie die Platte auf den Tröpfchenleser und richten Sie den Leser ein, indem Sie auf den Reiter „Setup“ klicken.Öffnen Sie anschließend eine neue Vorlage, indem Sie auf „Vorlage Neu“ klicken. Verwenden Sie den Well-Editor, um die Parameter für jede Probe festzulegen. Geben Sie jeder Probe einen eindeutigen Namen.Stellen Sie das Experiment auf die Seltenen-Ereignis-Erkennung ein und wählen Sie die Master-Mix-Zusammensetzung, die zur Vorbereitung der Reaktion verwendet wurde. Geben Sie Ziel 1 einen Namen, beispielsweise Unmethylated, und definieren Sie Ziel 1 als unbekannt (U). Geben Sie Ziel 2 einen Namen, beispielsweise Methylated, und definieren Sie Ziel 2 als Referenz (R). Klicken Sie auf den Reiter „Run“, um den Durchlauf zu starten, und geben Sie einen Dateinamen ein. Wählen Sie dann im Fenster „Run Options“ die Nachweischemie aus.Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Ergebnisse im Reiter „Analyze“ und verwenden Sie das 2D-Diagramm basierend auf den positiven Kontrollen, um die Daten auszuwerten. Diese Abbildung zeigt die 2D-Streudiagramme, die den Tröpfchen für die Plasmidkontrollen entsprechen, einschließlich bisulfitkonvertierter, unmethylierter Insulin-DNA, methylierter Insulin-DNA sowie einer 1:1-Mischung der beiden Plasmide. Beachten Sie, dass in diesem Panel eine leichte Verschiebung der FAM-positiven Tröpfchen in den VIC-Kanal zu erkennen ist, was auf die Sonde für die methylierte Insulin-DNA hinweist.Ebenso ist eine sehr geringe Verschiebung der VIC-positiven Tröpfchen im FAM-Kanal zu beobachten, was auf eine Kreuzreaktivität der Sonde für unmethylierte DNA mit methylierter DNA hinweist. Um die Linearität der Primer zu demonstrieren, wurden Mischungen der beiden Plasmide über mehrere Größenordnungen hinweg in den PCR-Reaktionen verwendet. Wie hier gezeigt, kann eine variable Konzentration eines Plasmids linear detektiert werden, während eine konstante Menge des zweiten Plasmids vorhanden ist.In dieser Abbildung wurden Proben von vier Personen mit neu diagnostiziertem Typ-1-Diabetes und vier Kontrollproben ohne Typ-1-Diabetes analysiert. Die Daten zeigen, dass Personen mit Typ-1-Diabetes im Vergleich zu Kontrollen erhöhte Konzentrationen sowohl unmethylierter als auch methylierter Insulin-DNA aufweisen, wie bereits früher gezeigt wurde. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von acht Stunden für 30 Proben durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, in allen Schritten eine Kontamination zu vermeiden. Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Diabetesforschung den Weg, die Anwendung dieser Methode als Biomarker für die Entstehung von Typ-1-Diabetes zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Menge an Betazellsterben durch die Messung un- und methylierter Präproinsulin-DNA in zellfreier DNA aus menserlichem Serum bestimmt werden kann.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DNA-Extraktionspuffern äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel sowie das Vermeiden von Desinfektionsmitteln, die Bleichmittel enthalten, stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video zeigt das Protokoll für die methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP). MeDIP ist eine zweitägige Verfahren, die selektiv extrahiert methylierte DNA-Fragmente aus einer genomischen DNA-Probe unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für 5-Methylcytosin (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Dieses Video zeigt den Elektrochemilumineszenz-Nachweis von Insel-Autoantikörpern in menschlichem Serum. Die Antikörper im Serum überbrücken das Ruthenium-konjugierte Antigen mit dem biotinylierten Capture-Antigen und bilden Komplexe, die durch Elektrochemilumineszenzmessungen nachgewiesen werden.

Nachweis von humanen Insel-Autoantikörpern mittels eines Elektrochemilumineszenz-Assays

Lasermikrodissektion ist eine Technik, die die Gewinnung von ausgewählten Zellen aus winzigen Mengen von Parenchym ermöglicht. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Erfassen menschlicher Pankreasinseln aus chirurgischen Proben für transkriptomischen Studien verwendet werden. Unser Protokoll verbessert die intrinsische Autofluoreszenz der menschlichen Beta-Zellen und erleichtert so ihre Sammlung.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Hier stellen wir eine Methodik zur Erzeugung und Verabreichung von Verbindungen aus zinsgeladenen Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Mikrosphären an intakte Mausinseln in Kultur mit anschließender Immunfluoreszenzanalyse der β-Zellproliferation vor. Diese Methode eignet sich zur Bestimmung der Wirksamkeit von Kandidaten-β-Zell-Mitogenen.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

Hier präsentierten wir die Methoden, um menschliche Insel-Autoantikörper mit Electrochemiluminescence (ECL) Assays erkennen. Das Protokoll verwendet, um vorherzusagen, Typ 1 Diabetes, kann erweitert werden, um Autoantikörper für andere Autoimmunerkrankungen zu erkennen.

Electrochemiluminescence-Assays für menschliche Insel-Autoantikörper

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung hochwertiger, großflächiger Transkriptomdaten einzelner Zellen aus isolierten menschlichen Pankreasinseln unter Verwendung einer tropfenbasierten mikrofluidischen einzelligen RNA-Sequenzierungstechnologie vor.

Einzellige RNA-Sequenzierung und Analyse menschlicher Pankreas-Inseln

In dieser Studie werden mehrfach gefärbte fluoreszenzbasierte Marker für Zelltod und Apoptose in Kombination mit konfokaler Mikroskopie verwendet, um die Zytokin-induzierte Apoptose und den β-zellspezifischen Tod in Pankreasinseln zu bewerten. Sie zeigt räumliche und zeitliche Veränderungen des Zelltods und der Apoptose als Reaktion auf extrazelluläre Reize.

Isolierte Behandlung von Pankreasinseln und Apoptosemessung

Hier beschreiben wir Einstellungen, um die zirkadiane Biolumineszenz und die sekretorische Aktivität von menschlichen Inselzellen und primären Myotuben parallel zu überwachen. Zu diesem Zweck verwendeten wir die lentivirale Genverabreichung eines Luciferase-Kernuhrreporters, gefolgt von einer in vitro Synchronisation und Sammlung des Ausflussmediums durch kontinuierliche Zellperifusion.

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Erfahren Sie, wie Sie differentiell methylierte INS-DNA in Humanserum mittels digitaler PCR als Biomarker für β-Zelltod messen. Diese Methode ermöglicht frühe Diagnose und Therapieansätze bei Diabetes Typ 1.

Die Messung der differentiell methylierter

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