Cefoperazon behandelten Maus-Modell der klinisch relevanten Clostridium difficile Dehnungs R20291

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Implementierung des Cefoperazon-Mausmodells der Clostridium-difficile-Infektion bereitzustellen, mit besonderem Schwerpunkt auf der klinischen Krankheitsüberwachung, der Bakterienzählung, der Zytotoxizität von Toxinen und histopathologischen Veränderungen nach der Provokation. Dieses detaillierte Protokoll wird den Forschern helfen, ein Mausmodell für eine Clostridium-difficile-Infektion genau durchzuführen, was für die Untersuchung der Pathogenese dieses Bakteriums und den Zugang zu neuartigen Therapeutika unerlässlich ist. Der Hauptvorteil der Verwendung dieses Mausmodells besteht darin, dass die Exposition gegenüber einem Antibiotikum für fünf Tage die Mäuse anfällig für die Besiedlung von C.difficile und für einen verlängerten klinischen Infektionsverlauf bei gleichzeitiger Erkrankung beim Menschen macht.

Nehmen Sie zunächst den C.difficile-Stamm von Interest und Vortex. In einer Laminar-Flow-Haube wird der Fond in sterilem Wasser in einem Schraubverschlussröhrchen auf eine Konzentration von zehn bis fünf Sporen pro 25 Mikroliter verdünnt. Beschriften Sie die Mischung als Sporeninokulum und legen Sie das Röhrchen für 20 Minuten in ein 65 Grad Celsius heißes Wasserbad.

Anschließend pipettieren Sie in der Laminar-Flow-Haube 50 Mikroliter des erhitzten Sporeninokulums in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und leiten es bis zur weiteren Verwendung in die anaerobe Kammer. Laden Sie das verbleibende Sporeninokulum in eine Ein-Milliliter-Spritze, die an einer sterilen Magensondennadel mit Kolbenspitze befestigt ist. Nehmen Sie in einer Laminar-Flow-Haube eine Versuchsmaus und fixieren Sie den Kopf, indem Sie das Tier sanft an der losen Haut von Hals und Rücken festhalten.

Wenn Sie den Zeigefinger verwenden und sicherstellen, dass das Tier keine Laute äußert oder Anzeichen von Stress zeigt, wird der Kopf des Tieres weiter ruhiggestellt und die Speiseröhre verlängert. Halten Sie die Maus in einer aufrechten, vertikalen Position und führen Sie die Sondennadel vorsichtig in die Seite des Mundes ein. Richten Sie die Sondennadel entlang des Gaumens und schieben Sie sie langsam in die Speiseröhre.

Sobald sich die Nadel etwa zur Hälfte in der Speiseröhre befindet, injizieren Sie 25 Mikroliter Sporeninokulum und ziehen Sie die Nadel dann vorsichtig zurück. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und beobachten Sie es auf Anzeichen von Husten oder Atemnot, die auf eine versehentliche Trachealverabreichung hinweisen könnten. Als nächstes nehmen Sie das zuvor in der anaeroben Kammer gelagerte Sporeninokulum aliquot und das verbleibende Sondensporen-Inokulum und machen Sie ein bis zehn serielle Verdünnungen in 180 Mikrolitern 1x PBS.

Führen Sie vier bis fünf dieser Verdünnungen durch. Mit der aseptischen Technik werden 100 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung in eine einzelne TCCFA-Platte überführt. Nehmen Sie jedes Mal einen neuen sterilen L-förmigen Spreizer und verteilen Sie die Verdünnungsinokula gleichmäßig auf jeder Platte.

Inkubieren Sie die Platten unter anaeroben Bedingungen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie schließlich die C.difficile-Kolonien auf jeder Verdünnungsplatte und berechnen Sie die koloniebildenden Einheiten, um die infektiöse Dosis zu erhalten, die den Mäusen verabreicht wird. Um Kotproben von Mäusen für die Beurteilung zu sammeln, halten Sie die Versuchsmaus zunächst leicht, aber fest an der losen Haut an Hals und Rücken fest, um sicherzustellen, dass das Tier nicht in Not ist.

Hebe mit dem kleinen Finger vorsichtig den Schwanz des Tieres an und lege den Anus frei. Halten Sie ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit bekanntem Gewicht direkt unter den Anus des Tieres und stellen Sie sicher, dass das Röhrchen die Maus nicht direkt berührt. Wenn das Tier seinen Stuhlgang verrichtet, sammeln Sie das Kotpellet in der Röhre.

Lagern Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur, bis alle erforderlichen Proben entnommen sind. Wiegen Sie die Röhrchen mit dem Kot auf einer Analysenwaage und notieren Sie die Masse auf vier Dezimalstellen. Berechnen Sie das Gewicht des Kotpellets, indem Sie das Gewicht des Rohrs abziehen.

Berechnen Sie als nächstes eine Verdünnung des Inhalts von eins bis zehn und resuspendieren Sie ihn in 1x PBS. Verwenden Sie die Spitze der Pipette, um den Kot vorsichtig in Lösung zu bringen. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich der Inhalt absetzen kann.

Halten Sie die Lösungen anaerob und führen Sie für jede Probe serielle Verdünnungen in 1x PBS durch. Übertragen Sie 100 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung auf TCCFA-Platten. Verwenden Sie einen sterilen L-förmigen Spreizer und tragen Sie das Medium gleichmäßig auf die Platten auf.

Inkubieren Sie die Platten unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Zählen Sie schließlich die C.difficile-Kolonien auf und berechnen Sie die koloniebildende Einheit pro Gramm Stuhlgehalt. Diese Abbildung zeigt das Gewicht der Maus in den Tagen nach der Herausforderung mit C.difficile R20291.

Am Tag Null wird das Ausgangsgewicht auf 100 festgelegt. Das durchschnittliche Körpergewicht der Maus wurde 14 Tage lang jeden Tag gemessen. Eine signifikante Gewichtsabnahme wurde bei herausgeforderten Mäusen an den Tagen zwei bis sieben nach der Herausforderung beobachtet.

Die Mäuse schienen sich nach diesem Zeitpunkt zu erholen und wieder an Gewicht zuzunehmen. Hier wird die C.difficile-Belastung im Kot in den Tagen nach der Challenge gezeigt. 24 Stunden nach der Provokation waren alle Mäuse mit 10 bis sieben KBE pro Gramm Kot besiedelt.

Diese Belastung war ab dem siebten Tag zurückgegangen, obwohl C.difficile immer noch vorhanden ist. Die histopathologische Untersuchung von Mäusen über den zeitlichen Verlauf der Infektion zeigte die signifikantesten pathologischen Veränderungen im Blinddarm. Die histologischen Gesamtwerte des Stuhls unterschieden sich signifikant zwischen dem Tag Null und den Tagen zwei und vier nach der Challenge.

Im Allgemeinen können Individuen, die neu in diesem Mausmodell sind, Schwierigkeiten mit der Berechnung und Vorbereitung des Sporeninokulums haben, das verwendet wird, um die Mäuse herauszufordern, und mit der Berechnung der fäkalen C.difficile-Bakterienlast. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Modifikationen der Dosis oder des Stammes von C.difficile-Sporen, die Mäusen verabreicht werden, das Ergebnis dieses Modells verändern können.