Cefoperazon behandelten Maus-Modell der klinisch relevanten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung des Cefoperazon-Mausmodells der Clostridium-difficile-Infektion bereitzustellen, wobei besonderer Schwerpunkt auf der klinischen Krankheitsüberwachung, der Bakterienzählung, der Toxinzytotoxizität und den histopathologischen Veränderungen nach der Infektion liegt. Dieses detaillierte Protokoll wird Forschern helfen, ein Mausmodell der Clostridium-difficile-Infektion genau durchzuführen, was für die Untersuchung der Pathogenese dieses Bakteriums und die Bewertung neuartiger Therapeutika unerlässlich ist. Der Hauptvorteil der Verwendung dieses Mausmodells besteht darin, dass die Exposition gegenüber einem Antibiotikum über fünf Tage hinweg die Mäuse anfällig für die Besiedlung durch C. difficile macht und einen über längere Zeit andauernden klinischen Infektionsverlauf ermöglicht, der dem menschlichen Krankheitsbild entspricht.

Beginnen Sie damit, den gewünschten C. difficile-Stamm zu entnehmen und zu wirbeln. Verdünnen Sie den Stamm in einem sterilen Wasser in einem Schraubverschlussröhrchen in einer laminaren Flusswerkbank auf eine Konzentration von zehn hoch fünf Sporen pro 25 Mikroliter. Kennzeichnen Sie die Mischung als Sporeninokulum und stellen Sie das Röhrchen 20 Minuten lang in ein Wasserbad mit 65 Grad Celsius.

Als Nächstes pipettieren Sie im laminaren Flusswerk 50 Mikroliter des erhitzten Sporeninokulums in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und bringen es in die anaerobe Kammer, bis es weiterverwendet wird. Füllen Sie das verbleibende Sporeninokulum in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer sterilen, gummibeschwerten Magensonde verbunden ist. Im laminaren Flusswerk nehmen Sie eine Versuchmaus und immobilisieren den Kopf, indem Sie das Tier vorsichtig am losen Hautgewebe von Nacken und Rücken fixieren.

Unter Verwendung des Zeigefingers und sicherstellend, dass das Tier nicht laut wird oder Anzeichen von Belastung zeigt, immobilisieren Sie den Kopf des Tieres weiter und dehnen Sie die Speiseröhre. Halten Sie die Maus in aufrechter, vertikaler Position und führen Sie die Magensonde vorsichtig in die Seitenpartie des Mundes ein. Leiten Sie die Magensonde entlang des Gaumendaches und schieben Sie sie langsam in die Speiseröhre voran.

Wenn die Nadel etwa zur Hälfte in die Speiseröhre eingeführt ist, injizieren Sie 25 Mikroliter Sporeninokulum und ziehen Sie die Nadel dann vorsichtig zurück. Stellen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und beobachten Sie es auf Anzeichen von Husten oder Atembeschwerden, die auf eine versehentliche tracheale Applikation hindeuten könnten. Nehmen Sie anschließend die zuvor in der anaeroben Kammer gelagerte Aliquotprobe des Sporeninokulums sowie das verbleibende Sporeninokulum aus der Magensonde und stellen Sie serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:10 in jeweils 180 Mikroliter 1x PBS her.

Führen Sie vier bis fünf dieser Verdünnungen durch. Übertragen Sie unter aseptischen Bedingungen jeweils 100 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung auf eine einzelne TCCFA-Platte. Verteilen Sie die Verdünnungsinokula mithilfe eines neuen sterilen L-förmigen Spatels jedes Mal gleichmäßig auf jeder Platte.

Die Platten 24 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die C.difficile-Kolonien auf jeder Verdünnungsplatte zählen und die koloniebildenden Einheiten berechnen, um die den Mäusen verabreichte infektiöse Dosis zu ermitteln. Um fäkale Proben von Mäusen zur Beurteilung zu sammeln, halte die Versuchsmaus zunächst leicht, aber fest am losen Hautgewebe des Nackens und des Rückens, wobei sichergestellt werden muss, dass sich das Tier nicht in Not befindet.

Mit dem kleinen Finger vorsichtig den Schwanz des Tieres anheben, um den Anus freizulegen. Halten Sie ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit bekanntem Gewicht direkt unter den Anus des Tieres, wobei sichergestellt werden muss, dass das Röhrchen die Maus nicht direkt berührt. Wenn das Tier defäkiert, sammeln Sie den Kotballen im Röhrchen ein.

Bewahren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur auf, bis alle erforderlichen Proben gesammelt sind. Wiegen Sie die Röhrchen mit den Fäkalien auf einer Analysenwaage und notieren Sie die Masse auf vier Dezimalstellen genau. Berechnen Sie das Gewicht des Fäkalkügelchens, indem Sie das Gewicht des Röhrchens subtrahieren.

Berechnen Sie als Nächstes eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 des Inhalts und resuspendieren Sie ihn in 1x PBS. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um den Fäkalieninhalt vorsichtig in Lösung zu bringen. Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um die Sedimentation des Inhalts zu ermöglichen.

Unter anaeroben Bedingungen halten Sie die Lösungen aufrecht und stellen Sie serielle Verdünnungen jeder Probe in 1x PBS her. Überführen Sie 100 Mikroliter jeder seriellen Verdünnung auf TCCFA-Platten. Verwenden Sie einen sterilen L-förmigen Spreader und tragen Sie das Medium gleichmäßig auf die Platten auf.

Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie abschließend die C.difficile-Kolonien und berechnen Sie die koloniebildenden Einheiten pro Gramm Fäkalienmaterial. Diese Abbildung zeigt das Körpergewicht der Mäuse an den Tagen nach der Infektion mit C.difficile R20291.

Am Tag null wird das Ausgangsgewicht auf 100 festgelegt. Das durchschnittliche Körpergewicht der Mäuse wurde danach täglich über einen Zeitraum von 14 Tagen gemessen. Bei den infizierten Mäusen wurde von Tag zwei bis Tag sieben nach der Infektion ein signifikanter Gewichtsverlust beobachtet.

Die Mäuse schienen sich ab diesem Zeitpunkt zu erholen und an Gewicht zuzunehmen. Hier ist die C. difficile-Belastung im Stuhl in den Tagen nach der Infektion dargestellt. 24 Stunden nach der Infektion waren alle Mäuse mit 107 KBE pro Gramm Stuhl besiedelt.

Diese Belastung hatte sich ab Tag sieben verringert, obwohl C. difficile weiterhin vorhanden ist. Die histopathologische Untersuchung der Mäuse im Verlauf der Infektion zeigte die signifikantesten pathologischen Veränderungen im Blinddarm. Die gesamten histologischen Scorewerte des Blinddarms unterschieden sich signifikant zwischen Tag null sowie den Tagen zwei und vier nach der Infektion.

Im Allgemeinen können Personen, die neu in diesem Mausmodell sind, Schwierigkeiten haben, die Berechnung und Herstellung des Sporeninokulums, das zur Infektion der Mäuse verwendet wird, sowie die Berechnung der fäkalen C.difficile-Bakterienlast durchzuführen. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig zu beachten, dass Änderungen der Dosis oder des Stammes der C.difficile-Sporen, die den Mäusen verabreicht werden, den Ausgang dieses Modells beeinflussen können.