Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Assemblierung eines Multiproteinkomplexes wie des Proteasoms unter Verwendung rekombinanter Untereinheiten und der nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) zu analysieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Proteasombereich zu beantworten, z. B. welche Zwischenspezies entlang des Assemblierungswegs dieses Proteinkomplexes anzutreffen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein schnelles Screening der Assemblierung durch zwei parallele Ansätze ermöglicht, die den Nachweis von Zwischenprodukten auf und außerhalb des Signalwegs ermöglichen. Dieses Verfahren beginnt mit der bakteriellen Expression, wie im Textprotokoll beschrieben. Um eine bakterielle Lyse durchzuführen, tauen Sie die induzierte Zellpalette, die die gewünschte Kombination von Proteasom-Untereinheiten mitexprimiert, fünf Minuten lang auf Eis auf. Nach dem Auftauen die Palette wieder in 600 Mikroliter Lysepuffer einbetten.Inkubieren Sie die Suspension bei 30 Mikrolitern.