Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Das übergeordnete Ziel der Implementierung von Online-Größenausschluss- und Ionenaustauschchromatographie an Kleinwinkel-Röntgenstreustrahllinien besteht darin, eine bessere Qualität von Modelldaten mit geringer Auflösung zu erhalten, indem minimale Verzögerungen zwischen Probenvorbereitung und Datenerfassung sichergestellt werden. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Strukturbiologie zu beantworten. Wie bei der Radiusoperation, dem größten intrapartikularen Abstand, der Partikelform, dem Grad der Faltungsdenaturierung oder -unordnung.

SAXS erfordert molar dispergierte Proben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zeit zwischen der Reinigung und der Messung kurz ist, was dazu beiträgt, eine Denaturierung oder Adduktion der Probe zu vermeiden. Bevor Sie sich in die Beamline-Anlage begeben, bereiten Sie eine konzentrierte Probe mit zuvor veröffentlichten Methoden vor und führen Sie SEC-Testläufe durch.

Geben Sie in der Beamline-Anlage einen Milliliter Gelfiltrationspuffer in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Schließen Sie dann die Flasche mit dem Gelfiltrationspuffer an ein HPLC-System an, das der Durchflusskapillare des SAXS-Setups entspricht. Stellen Sie die Durchflussrate, den maximalen Säulendruck und die Erfassungszeit ein.

Beachten Sie den Gegendruck ohne die Säule. Bereinigen Sie die Linien, verbinden Sie die Spalte für die Größenausschlusschromotografie, und äquilibrieren Sie sie. Laden Sie die Ein-Milliliter-Pufferprobe in den Probenwechsler.

Verlassen Sie die Versuchshütte, sichern Sie sie oder verriegeln Sie sie, und melden Sie sich dann im Probenwechselmodus bei der Beamline-Steuerungssoftware an. Schicken Sie die Pufferprobe im Probenwechsler direkt durch die SAXS-Durchflusskapillare. Führen Sie einen kurzen SAXS-Testlauf durch und prüfen Sie, ob die Intensität der Röntgenstreuung keine Anzeichen von Strahlungsschäden aufweist.

Schalten Sie das Beamline-Kontrollsystem in den HPLC-Modus und führen Sie einen SAXS-Testlauf des Puffers über das vollständige HPLC-SAXS-System durch. Wenn die Daten nicht mit der ersten Messung übereinstimmen, führen Sie eine erneute Äquilibrierung durch und führen Sie einen weiteren Testlauf durch. Als nächstes zentrifugieren Sie die Proteinprobe im Labor 10 Minuten lang bei 13.000 mal G, um Aggregate zu entfernen.

Übertragen Sie den Überstand in ein HPLC-kompatibles Glasfläschchen. Legen Sie das Fläschchen in den Autosampler und notieren Sie sich die Probenposition. Verriegeln Sie den Stall und erstellen Sie einen Ordner für die Experimentdaten in der Beamline-Steuerung.

Klicken Sie dann in der HPLC-Software auf Quick Batch. Legen Sie den Dateipfad fest und aktivieren Sie die automatische ASCII-Konvertierung von UV Vis-Daten. Geben Sie das Injektionsvolumen und die Probenposition in den Autosampler ein.

Klicken Sie auf Start, um die Ausführung zur Warteschlange hinzuzufügen. Geben Sie den Dateinamen ein, aber klicken Sie nicht auf "Speichern". Stellen Sie in der Beamline-Steuerungssoftware die Anzahl der Datenframes so ein, dass die SAXS-Datenerfassungszeit etwas länger ist als die HPLC-Aufnahmezeit.

Öffnen Sie den Beamline-Shutter und starten Sie die SAXS-Datenerfassung. Wechseln Sie zur HPLC-Software und klicken Sie auf Speichern, um die Probe zu injizieren. Notieren Sie sich die Frame-Nummer zu Beginn der UV-Vis-Datenerfassung und überwachen Sie die summierte Intensität im Zeitverlauf.

Während der Probenvorbereitung ist ein IEC-Testlauf mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 25 Millimolar bis zu einem Molar durchzuführen. Bestimmen Sie für jeden interessierenden Peak die entsprechende Menge an Puffer B mit hohem Salzgehalt in der mobilen Phase. Um das IEC SAXS-Experiment zu starten, legen Sie eine Milliliterprobe der Puffer A und B beiseite und schließen Sie die Puffer dann an das HPLC-System an.

Stellen Sie die HPLC-Parameter ein, spülen Sie das System und spülen Sie die Leitungen mit salzarmem Puffer A.Verbinden Sie die Ionenaustauschersäule mit Puffer A und äquilibrieren Sie sie.Laden Sie die Ein-Milliliter-Proben der Puffer A und B in den Probenwechsler. Verriegeln Sie den Stall und führen Sie für jede Pufferprobe im Probenwechslermodus einen kurzen SAXS-Testlauf durch, um die Anfälligkeit des Puffers für Strahlenschäden zu überprüfen. Wechseln Sie dann in den HPLC-Modus und führen Sie einen weiteren SAXS-Testlauf für Puffer A durch.Vergleichen Sie die Streumuster mit denen aus dem Testlauf des Probenwechslers.

Erstellen Sie als Nächstes einen Ordner für die Experimentdaten. Entwerfen Sie dann einen schrittweisen HPLC-Gradienten, der mit null Prozent hohem Salzpuffer B beginnt und in Abständen von zwei Säulenvolumina um fünf Prozent ansteigt, um 100 Prozent Puffer B zu erreichen. Richten Sie einen einzelnen Gradientenlauf ein, bei dem keine Probe injiziert wird. Öffnen Sie den Beamline-Shutter, starten Sie die SAXS-Datenerfassung und starten Sie den HPLC-Lauf.

Notieren Sie sich die Anzahl der Frames, die verstrichen sind, wenn die UV-Vis-Datenerfassung beginnt. Überprüfen Sie nach der Datenerfassung, ob die summierte Intensität für mindestens 100 Frames konstant blieb und mit den Werten übereinstimmt, die Sie aus den Proben der Puffer A und B erhalten haben.Führen Sie dann eine weitere schrittweise Gradienten-HPLC-Methode durch, beginnend mit null Prozent Puffer B.Erstellen Sie einen Schritt für jeden prozentualen B-Wert, der im Offline-IEC-Gradiententestlauf bestimmt wurde. Fügen Sie Farbverlaufsschritte hinzu, die jeweils einen Prozentpunkt unter und 1,5 Punkte über diesen Werten liegen.

Stellen Sie jedes Schrittintervall auf 2,5 Säulenvolumen und den letzten Schritt im Gradienten auf 100 Prozent B ein.Verdünnen Sie den Überstand nach Bedarf, um die Zusammensetzung des Puffers A zu erreichen.Stoppen Sie die HPLC-Pumpen, trennen Sie die Säulenschläuche von den Detektoren und legen Sie das Ende der Leitung in einen Behälter, um den Säulenfluss aufzufangen. Übertragen Sie dann die Puffer-A-Leitung in die verdünnte Probe und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Röhrchen eingeschlossen sind. Starten Sie die Pumpen, um die Probe in die Säule zu ziehen.

Sobald der Probenbehälter fast leer ist, stoppen Sie die Pumpen und stellen Sie die Puffer-A-Flasche wieder auf die Leitung. Starten Sie die Pumpen und lassen Sie Puffer A für zwei Säulenvolumen durch die Säule laufen, stoppen Sie dann die Pumpen und schließen Sie die Säule wieder an die Detektoren an. Mit der neuen schrittweisen Methode können Sie einen einzigen HPLC-Lauf ohne automatische Probeninjektion einrichten.

Öffnen Sie den Beamline-Shutter und erfassen Sie die SAXS- und UV Vis-Daten. Überwachen Sie die summierte Intensität im Zeitverlauf. Verwenden Sie dann eine Nachbearbeitungssoftware, um die HPLC-Daten in ein ASCII-Format zu konvertieren.

Identifizieren Sie mit einem Online-Datenmanager die SAXS-Frames, die dem Probenelutionspeak entsprechen. Stellen Sie sicher, dass der Giyrationsradius während des gesamten Peaks stabil ist. Importieren Sie die Peak-Frames in ein SAXS-Datenverarbeitungsprogramm und erstellen Sie eine durchschnittliche, nicht korrigierte Streukurve.

Vergewissern Sie sich bei SCC SAXS, dass der obere Q-Bereich des durchschnittlichen Puffers und nicht nur die nicht korrigierte Streukurve gilt. Laden und skalieren Sie die automatisch subtrahierten Frames vom Peak, und stellen Sie sicher, dass es keine systematischen Unterschiede gibt. Mittelwerten Sie alle Kurven, um die endgültige SAXS-Kurve zu erhalten.

Für IEC SAXS ist der Durchschnitt von 50 Frames aus jedem Verlaufsschritt zu erreichen. Vergleichen Sie diese Durchschnittswerte mit der nicht korrigierten Kurve und wählen Sie den Verlaufsschritt mit der besten hohen Q-Übereinstimmung aus. Subtrahieren Sie den ausgewählten Durchschnitt von der nicht korrigierten Kurve, um die endgültige SAXS-Kurve zu erstellen.

Bestimmen Sie schließlich die Paarabstandsverteilung und führen Sie eine Ab-initio-Modellierung durch, um das repräsentativste Modell des Proteins zu bestimmen. Die strukturellen Datenparameter, die aus SEC und IEC SAXS des D5-Proteins gewonnen wurden, waren sehr ähnlich. Die Schätzungen der Molekülmasse stimmten beide mit der vorhergesagten Masse überein.

Die Ab-initio-Modellierung wurde ohne auferlegte Symmetrie und mit C6-Symmetrie durchgeführt. Beide Modelle sind mit den Experimentdaten kompatibel, was darauf hindeutet, dass die Proteinstruktur eine C6-Symmetrie besitzt. Die molekulare Modellierung ergibt eine hexogonale pyramidenartige Struktur mit einem teilweise verstopften zentralen Kanal.

Die gemittelten SEC- und IEC-Modelle waren sehr ähnlich. Bei der Untersuchung einzelner Modelle stellte sich heraus, dass die Kanalobstruktionen wahrscheinlich ein Artefakt des Mittelungsprozesses sind. SAXS wird immer mehr zum Standard, aber für viele Reinigungs- und andere Ionenaustausch-Chromotographie-Schritte, die zur Beseitigung von Aggregaten oder Verunreinigungen erforderlich sind.

In diesem Protokoll wurden beide Techniken vorgestellt, die Online-Größenausschluss-Chromotographie und die Online-Ionenaustausch-Chromotographie auf einer bio-SAXS-Beamline. Ein Nachteil beider Techniken ist, dass die genaue Proteinkonzentration nicht bekannt ist, so dass wir die molekulare Massenstreuung nicht bestimmen können. Für globuläre Proteine können wir jedoch immer noch das Massenvolumen abschätzen.

Anstelle des schrittweisen Gradienten, den wir hier in der Ionenaustausch-Chromotographie verwendet haben, kann ein linearer Gradient angewendet werden, obwohl dies eine Optimierung der Pufferbedingung für eine optimale Trennung der Peaks erfordert. Diese Techniken ermöglichen es uns, auch auf komplizierten Systemen SAXS-Daten in guter Qualität zu sammeln.