Name: Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Implementierung von Online-Größenausschluss- und Ionenaustausch-Chromatographie an SAXS-Strahlrohren zur Verbesserung der Datenqualität in der Strukturbiologie. Diese Methoden minimieren Verzögerungen zwischen Probenaufbereitung und Messung.

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Wir danken für die finanzielle Unterstützung des Projekts durch das französische Stipendium REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 und durch Forschungszuschüsse des Service de Santé des Armées und der Délégation Générale pour l'Armement. Wir danken der ESRF für die SAXS-Strahlzeit. Wir danken Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister und Guy Schoehn für die finanzielle und wissenschaftliche Unterstützung.

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<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li>
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<li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li>
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<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Für viele Makromolekülen unter Verwendung von Chromatographie eine abschließende Reinigungsschritt erforderlich ist, bevor zu SAXS Datensammlung eine gute Qualität Datensatz zu erhalten. Allerdings sind nicht alle Proben stabil bleiben; sie können zur Aggregation oder Wieder Äquilibrierung zu einer Mischung aus Oligomerisierung Zustände anfällig. Daher wird eine endgültige Online-Reinigungsschritt auf der Strahllinie erforderlich, um die Zeit zwischen Reinigung und Datenerfassung zu minimieren, um die beste Qualität SAXS Daten zu erhalten. In Abhängigkeit von den biophysikalischen Eigenschaften des Proteins von Interesse, SEC-SAXS oder IEC-SAXS könnte optimale Probenqualität zu erhalten gewählt werden. Hier auf einem Proteinkonstrukt abgeleitet von der Helikase / Primase D5 werden beide Techniken erläutert und diskutiert. Erwerb von SEC-SAXS-Daten werden immer mehr standardisiert werden und ist auf vielen BioSAXS Strahlrohre. Die Datenanalyse, insbesondere Untergrundsubtraktion, ist relativ einfach und leicht. Jedoch ist ein stabiles Puffersignalund die ausreichende Trennung der makromolekularen Spezies bleibt unerlässlich. Daher ist es wichtig, genug Zeit zu reservieren, die Säule gründlich zu äquilibrieren. Versagen dieser Methode kann wegen persistent Verunreinigungen von ähnlicher Größe zu dem Protein von Interesse, niedrigen Konzentrationen und strahlungsempfindlichen Puffer sein. In der Praxis wird zunächst ist SEC-SAXS wahrscheinlich als die Methode der Wahl für die meisten hochmolekularen Proben verwendet werden. viele Reinigungsprotokolle erfordern eine vorherige IEC Schritt aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigungen oder Aggregation noch. Da jede Konzentration und Chromatographie-Schritt mit Verlusten von Probe (schätzungsweise 30-50%) zugeordnet ist, und die Zeit ist auch eine direkte IEC-SAXS vorteilhaft. Bei Proben, die nicht durch SEC gereinigt werden, sei es aufgrund der Anwesenheit von ähnlicher Größe &quot;Verunreinigungen&quot; oder weil sie bei den erforderlichen Konzentrationen stark Aggregat, IEC-SAXS würde die besser geeigneten Ansatz immer sein. Auch die höheren Strömungsraten unterstütztdurch viele können IEC Spalten helfen, die Laufzeit zwischen Reinigung und Messung zu reduzieren. In dem hier vorgestellten Beispiel wurde IEC mit einer Stufe Elution verwendet, die durch sorgfältige Auswahl der Salzkonzentration Schritte zur Trennung der Nähe Peaks von D5 323-785 von Verunreinigungen ermöglicht. Im Prinzip ist die Anzahl der Schritte unbegrenzt, praktisch aber mindestens 1 pro Schritt peak erforderlich ist, und nicht zu viele gewählt werden sollte. Für den Hintergrund Subtraktionsverfahren oben beschrieben, ist es wichtig, eine relativ hohe Anzahl von verschiedenen Pufferzusammensetzungen zu messen, um die Anpassung zu finden. Ein gemeinsamer Nachteil beider Techniken ist der Mangel an präzisen Proteinkonzentration Informationen. Aus diesem Grund, und zwar auf Vorwärtsstreuung basierend Massenbestimmung ist nicht möglich. Für globuläre Proteine wie D5 323-785, bietet das Porod Volumen eine Alternative, wenn auch weniger präzise, Massenschätzung, sondern auch für hochflexible oder ungeordnete ProteineDieser Ansatz wäre, nicht gültig sein. Eine Variante der stufenweisen Gradienten IEC-SAXS hier vorgestellten Verfahren ist die Verwendung eines linearen Gradienten statt. Während es möglich ist, mit so vielen Schritten zu arbeiten, wie gewünscht Teilspitzen unter Verwendung eines stufenweisen Elution, in dem linearen Gradienten Ansatz zu isolieren, ist es erforderlich, die Steigung Bedingungen sorgfältig zu optimieren, um die Spitzen vollständig zu trennen, bevor die SAXS Start Experiment. Hintergrund Subtraktion in diesem Ansatz könnte rahmenweise getan werden, und konnte durch den Vergleich der einzelnen Frames überprüft werden, aber es erfordert erweiterte Datenverarbeitung und eine spezielle Software noch nicht existiert. Die Wahl einer geeigneten Säule ist für beide Techniken kritisch, da sie die Trennung der makromolekularen Spezies bestimmt. Größenausschluss-Säulen unterscheiden sich in der Belastbarkeit, dem Größenbereich von trennbaren Makromoleküle und Auflösung, während Ionenaustauschsäulen in der Art variieren und die Dichteihrer immobilisiert Ladungen. Während die hier vorgestellten Protokoll zur ESRF beamline BM29, Anpassung an andere SAXS-Strahllinie spezifisch ist im Prinzip einfach. Die wichtigsten Anforderungen sind eine ausreichend hohe Röntgenfluss und einem geeigneten Detektor (idealerweise Einzelphotonenzählung), vernünftigen Signal-zu-Rausch-Daten im Bereich von Sekunden zu erwerben oder weniger und eine Online-Flüssigkeits-Chromatographie System in der Lage zu schaffen Steigungen. Die genaue Umsetzung wäre natürlich, abhängig von der lokalen Umgebung-Strahlrohr. Die erhaltenen Ergebnisse auf D5 323-785 die beiden Methoden unterscheiden sich geringfügig. Der Gyrationsradius ist etwas kleiner für die IEC-Daten als für die SEC-Daten und der lokalen Minima der Streukurve sind etwas größere Streuvektoren verschoben. Das bedeutet , dass die D5 323-785 gemessen mit IEC-SAXS ist etwas kompakter als die D5 323-785 gemessen mit SEC-SAXS. Dies könnte be aufgrund der Unterschiede in der Probenvorbereitung, in der Zeit zwischen Reinigung und Messung (IEC ist schneller) oder, weniger wahrscheinlich auf eine Verunreinigung in dem SEC-gereinigte Probe. Die Perle Modelle völlig unabhängig mit beiden Verfahren erhalten werden , sind vergleichbar (Abbildung 1H). D5 323-785 zeigt die erwartete hohle, hexameren Struktur 18. Abschließend sind online Ionenaustausch- und Online - Grßenausschlußchromatographie wichtige biochemische Reinigungsverfahren , die direkt mit SAXS 6,7,9-12,25,26 koppelbar ist. Der Hintergrund Subtraktion von IEC-SAXS-Daten ist etwas schwieriger und zweideutig als für SEC-SAXS, aber es ist trotzdem möglich. In Abhängigkeit von den biophysikalischen Eigenschaften des Proteins von Interesse, sowohl SEC und IEC-SAXS ermöglichen die Optimierung der Spezies Trennung mit inhärenten Vorteile. Vorausgesetzt, dass die Validierungsschritte (wie beschrieben) sind wit korrekt beobachtet, können die resultierenden Daten analysiert werden,h Vertrauen und Modelle können mit den Standard-Tools zur Verfügung innerhalb der Gemeinschaft festgelegt werden. Zusammen ermöglichen die beiden Techniken Online-Trennung für eine breite Palette von biologischen Makromolekülen, wodurch man die Daten nicht zugänglich über Standard-statische Messungen.

BioSAXS ist ein leistungsfähiges Werkzeug , um die Form von Nanogröße Objekte 1-4 zu bestimmen. Die Streuung von Röntgenstrahlen durch eine Lösung von Makromolekülen, Größe im nm-Bereich enthält, wird bei sehr niedrigen Winkeln aufgezeichnet. Dieser Winkelbereich enthält Informationen über die globalen Parameter: der Gyrationsradius; die größte Intrapartikelporositäten Abstand; die Partikelform; und der Grad der Faltung, Denaturierung oder einer Störung. Die Technik keine Kristalle erforderlich ist , und das Makromolekül in Lösung bleibt und damit unter Bedingungen nachahmt bestimmte wichtige Parameter der Zelle, wie Ionenstärke, pH, usw. Die Kenntnis dieser Faktoren gehalten werden kann , könnte helfen , zu bestimmen, zum Beispiel, die physiologisch relevanten oligomere Zustand eines Proteins von Interesse oder ein vorgeschlagenes Modell eines Komplexes zu validieren. Die Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in verschiedenen Pufferbedingungen, die Schaffung von Modellen von fehlenden Domänen, die Verfeinerung der Homologie-Modelle und die deBeendigung von diskreten gefalteten und entfalteten Zustände können schnell und einfach 5 durchgeführt werden. Wie bei jeder Technik, hat BioSAXS intrinsische Schwächen: aggregiert oder denaturierte Proben, Mischungen von Partikeln, heterogenen Proben, Strahlenschäden und Puffer Mismatches kann in un-interpretierbaren Daten zur Folge haben. Für viele Analyseverfahren wird implizit angenommen, daß die Probe monodispers ist, eine Anforderung, die oft schwierig in der Praxis zu erhalten. In vielen Fällen ist der Abbau der Probe fein und nicht in den Daten auf ihren eigenen erfasst werden kann, und jeder Versuch, die Daten liefert ungenaue oder sogar irreführende Ergebnisse zu interpretieren. Um diese Hindernisse zu überwinden, die Kombination von Grßenausschlußchromatographie (SEC) und SAXS wurde auf vielen Strahlrohren umgesetzt Datenqualität gewährleisten und diese Technik zugänglicher zu machen für immer schwieriger Proben 6-11. Vor kurzem haben wir eine neue Methode, um das Repertoire durch die Entwicklung von Online-IonenaustauschChromatographie (IEC) -gekoppelten SAXS 12. Beide Techniken eröffnen SAXS auf ein breites Spektrum von biologischen Partikeln früher unmöglich zu analysieren. Die Wahl, welche Methode zu verwenden, hängt von den biophysikalischen Eigenschaften der Partikel von Interesse. SEC trennt Makromoleküle durch ihre Größe, wodurch mindestens ein 10% iger Unterschied in der scheinbaren molekularen Masse wird für die Trennung benötigt wird. Physikalischen Grenzen der Säule und physiologischen Eigenschaften der Proben, wie hydrophobe Oberflächen, Flexibilität und fehlender Stabilität, komplizieren auch die Datenerfassung, Analyse und Interpretation. Ionenaustauschchromatographie, die Moleküle basierend auf ihrer Ladung und somit ihre Bindungsaffinität an die IEC-Säule kann trennt, verwendet werden, anstelle von oder zusätzlich zu SEC. Die Gesamtladung kann leicht durch Änderung des pH manipuliert werden, oder durch Variieren der Salzkonzentration des Puffers, ein relativ einfaches Verfahren zur kontrollierten Bereitstellung elution der Moleküle aus der IEC-Säule. Durch die Ladung unter Verwendung der Trennung von ähnlichen Arten und Größen von Molekülen, die sonst schwer zu trennen, kann routinemäßig mit IEC durchgeführt werden. Darüber hinaus hat IEC den Vorteil, mit verdünnten Proben umgehen zu können, so dass man die Konzentration Schritte zu vermeiden, die das potenzielle Risiko der Denaturierung des Proteins führen. Leider, wie die Ladungsverteilung äußerst Probe abhängig ist, erfordert IEC Optimierung hinsichtlich der pH - Wert und die Salzkonzentrationen 13,14. Für viele Proteine, die schwierig zu exprimieren sind, zu reinigen, oder beide, nur geringe Probenmengen zur Verfügung zu studieren. Es ist wichtig, effizient zu sein und die Anzahl der Reinigungsschritte und somit die Verluste zu minimieren. Aus diesem Grund ist der letzte Reinigungsschritt direkt online vor SAXS Datenerfassung, um die Wahrscheinlichkeit der Erfassung einer guten Datensatzes zu erhöhen. Hier, Die wir online SEC-SAXS und IEC-SAXS präsentieren und zu vergleichen. Beide Techniken wurden auf der BioSAXS - Strahlrohr BM29 an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, Frankreich 15 umgesetzt. Als Testfall verwendeten wir das D5N und Helicase-Domäne des Proteins Vacciniavirus D5, die ziemlich schwierig war strukturell mit anderen Verfahren zu analysieren. Das Vaccinia-Virus ist ein Mitglied der Poxviridae Familie und ist zu 98% identisch mit der Variola-Virus, die Ursache der Pocken. Mit dem Vaccinia-System untersuchen wir die Replikationsmaschinerie, die sich hier auf das Wesentliche Helikase-Primase D5. D5 ist ein 95-kDa - Protein mit einem N-terminalen archeo-eukaryotische Primase (AEP) Bereich 16 durch einen Cystein - Cluster - Region gefolgt (res. 240-345) 16. Weiter in Richtung des C-Terminus kommt eine D5N Domain (Res. 340-460), die immer mit D5-Typ - Helikasen zugeordnet ist, und schließlich ein -Superfamilie 3 (SF3) Helicase - Domäne (Res. 460-785) 17 (Figure 1A). Die Helikasedomäne D5 baut einen hexameren Ringstruktur, die für die enge Bindung an DNA benötigt wird. Dank der jüngsten SAXS und EM - Studien, die niedrig auflösenden Strukturen des Primase und die Helikase - Domänen sind jetzt 18 bekannt. Hier zeigen wir, wie die implementierten Online-Chromatographie-Techniken auf dem BioSAXS-Strahlrohr zu verwenden BM29 bei ESRF Erkenntnisse zu gewinnen in die Struktur des C-terminalen Fragment (Rest 323-785) von D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>essigsäure glazial</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Zentrifugalfilter Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol blau &nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Kompletter Proteasehemmer-Cocktail&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Entsalzungssäule</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinität Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb Vektor&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&nbsp; Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraktionskit</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Aufreinigung kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel-Färbung</td><td>Invitrogen Lebenstechnologie</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>hausgemacht</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen Lebenstechnologie</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris Basis</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R Säule &nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamline Steuerungssoftware BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>lokale Entwicklung</td></tr><tr><td>Camserver Software</td><td>Dectris</td><td>n.a.Detektorsteuerungssoftware</td><td></td></tr> <tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>Programm zum Ausrichten von ab initio Modellen&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio Modellrekonstruktionsprogramm</td></tr><tr><td>HPLC-Programm Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Programm LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Lokale Entwicklung</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>Programm, das die Manipulation mit experimentellen SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td> <td>Software zur Visualisierung</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td></td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html Programm zur Überlagerung von 3D-Strukturen</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac-Fraktionssammler</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC-System</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim Biotech-BBI8535108</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

online größenausschluss und ionenaustausch-chromatographie auf einem saxs strahlrohr

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biologische Kleinwinkel-Röntgenstreuung (BioSAXS) ist eine leistungsfähige Technik, die in der Molekular- und Strukturbiologie verwendet, um Lösungsstruktur, Teilchengröße und Form und Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis von Makromolekülen zu bestimmen. Die Technik ist auf eine sehr breite Vielfalt von Bedingungen Lösung einen breiten Bereich von Konzentrationen, pH - Werte, Ionenstärken Spanning, Temperaturen, Zusätze, etc., aber die Probe erforderlich ist , monodisperse sein. Diese Einschränkung führte zur Durchführung der Flüssigkeitschromatographie-Systeme auf SAXS Strahlrohre. Hier beschreiben wir die stromaufwärtige Integration der Größenausschluss (SEC) und Ionenaustauschchromatographie (IEC) an einem Beamline, verschiedene Methoden zur optimalen Hintergrundsubtraktion und Datenreduktion. Als Beispiel beschreiben wir, wie wir sec- und IEC-SAXS auf einem Fragment des Vaccinia-Virus essentiellen Protein D5 verwenden, bestehend aus einem D5N Helicase-Domäne. Wir bestimmen seine Gesamtform und Molekulargewicht, die hexameren Struktur th zeigte Protein.

Die Ergebnisse des modellfreien invariant Analyse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Analyse der D5 323-785 SEC-SAXS - Daten mit einer Molekularmasse Schätzung zeigte (aus einer Analyse Porod) von 345 kDa im Vergleich zu 338 kDa beobachtet IEC-SAXS verwenden. Beide sind in Übereinstimmung mit dem erwarteten Masse von 6 mal 53,5 kDa (321 kDa) für ein Hexamer. (: Χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: SEC-SAXS χ 2 = 3,1) Die ab initio Modellierung beider Datensätze wurde ohne auferlegten Symmetrie unternommen und unter Verwendung von C6 Symmetrie (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Da die Gesamt Anpassungen an die Streudaten für beide Rekonstruktionen in beiden Fällen vergleichbar sind (1D und E) können C6 Symmetrie angenommen werden. Somit entspricht das Modell zu einer hexagonalen kegelförmige Struktur mit einem zentralen Kanal, der teilweise versperrten (SEC scheint: 1F; IEC: Abbildung 1H). Eine Prüfung der einzelnen Modelle vor der Mittelung zeigt, dass dieses Hindernis wahrscheinlich ein Artefakt des Mittelungsprozesses. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> Abbildung 1: SAXS Datenanalyse und der Vergleich von D5 323 -785 (Figur aus References angepaßt 12 und 18). A) Schematische Domänenstruktur von D5 Protein und D5 323-785. B) Offline Ionenaustausch - Chromatogramm mit der Angabe der drei Spitzen. Orange Kurve: Die Absorption bei 280 nm (au), blaue Kurve: Anzahl von Puffer B Prozentuale Anteile der Puffer B an den Spitzen sind angegeben. C) Online - Ionenaustausch - Chromatogramm. Farbschlüssel wie in B. Zusätzlich wird die gemessene Intensität wird in grün angezeigt. Die experimentelle Streukurve einnd berechnete Kurve des Modells erhalten durch SEC-SAXS D) und IEC E) Datenanalyse von D5 323-785. F) Bead Modell D5 323-785 basierend auf dem SEC - Daten und G) IEC - Daten. H) Overlay der SEC und dem IEC - Modelle. Die Platten in F) bis H) wurden unter Verwendung eines molekularen Visualisierungssoftware 24 angelegt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Datenerfassungsparameter </td><td></td></tr><tr><td> Instrument: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Wellenlänge (Å) </td><td> 0,99 </td></tr><tr><td> q-Bereich (Å -1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Probe-Detektor-Abstand </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Die Belichtungszeit (sec) </td><td> 1 pro Rahmen </td></tr><tr><td> Konzentrationsbereich </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Temperatur (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Detektor </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (Photonen / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Strahlgröße (&amp; mgr; m 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Strukturparameter für D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [von Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [von Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q g max R für Guinier verwendet </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> D max (Å) [von p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-Bereich verwendet , für p (r) (Å -1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod Volumen V p (A 3) [von Scatter] </td><td> (570 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekularmasse M r (kDa) [von V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Berechnete monomeren Herr von Sequenz (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Strukturparameter für D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [von Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [von Guinier] </td><td> 46,5 ± 0,1 </td></tr><tr><td> q min R g - q g max R für Guinier verwendet </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (Å) [von p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-Bereich verwendet , für p (r) (Å -1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod Volumen V p (&amp; #197; 3) [von Scatter] </td><td> (577 ± 5) × 10 3 </td></tr><tr><td> Molekularmasse M r (kDa) [von V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Berechnete hexameren Herr von Sequenz (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: SAXS Datenparameter. Die Tabelle fasst die Parameter der SAXS Datenerfassung und Analyse.

Die Bestimmung der Lösungsstruktur eines Proteins durch Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) erfordert monodisperse Proben. Hier stellen wir zwei Möglichkeiten minimalen Verzögerungen zwischen der Probenvorbereitung und Datenerfassung zu gewährleisten: Online-Größenausschluss-Chromatographie (SEC) und Online-Ionenaustauschchromatographie (IEC).

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Das übergeordnete Ziel der Implementierung von Online-Größenausschluss- und Ionenaustauschchromatographie an Kleinwinkel-Röntgenstreustrahllinien besteht darin, eine bessere Qualität von Modelldaten mit geringer Auflösung zu erhalten, indem minimale Verzögerungen zwischen Probenvorbereitung und Datenerfassung sichergestellt werden. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Strukturbiologie zu beantworten. Wie bei der Radiusoperation, dem größten intrapartikularen Abstand, der Partikelform, dem Grad der Faltungsdenaturierung oder -unordnung.SAXS erfordert molar dispergierte Proben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zeit zwischen der Reinigung und der Messung kurz ist, was dazu beiträgt, eine Denaturierung oder Adduktion der Probe zu vermeiden. Bevor Sie sich in die Beamline-Anlage begeben, bereiten Sie eine konzentrierte Probe mit zuvor veröffentlichten Methoden vor und führen Sie SEC-Testläufe durch.Geben Sie in der Beamline-Anlage einen Milliliter Gelfiltrationspuffer in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Schließen Sie dann die Flasche mit dem Gelfiltrationspuffer an ein HPLC-System an, das der Durchflusskapillare des SAXS-Setups entspricht. Stellen Sie die Durchflussrate, den maximalen Säulendruck und die Erfassungszeit ein.Beachten Sie den Gegendruck ohne die Säule. Bereinigen Sie die Linien, verbinden Sie die Spalte für die Größenausschlusschromotografie, und äquilibrieren Sie sie. Laden Sie die Ein-Milliliter-Pufferprobe in den Probenwechsler.Verlassen Sie die Versuchshütte, sichern Sie sie oder verriegeln Sie sie, und melden Sie sich dann im Probenwechselmodus bei der Beamline-Steuerungssoftware an. Schicken Sie die Pufferprobe im Probenwechsler direkt durch die SAXS-Durchflusskapillare. Führen Sie einen kurzen SAXS-Testlauf durch und prüfen Sie, ob die Intensität der Röntgenstreuung keine Anzeichen von Strahlungsschäden aufweist.Schalten Sie das Beamline-Kontrollsystem in den HPLC-Modus und führen Sie einen SAXS-Testlauf des Puffers über das vollständige HPLC-SAXS-System durch. Wenn die Daten nicht mit der ersten Messung übereinstimmen, führen Sie eine erneute Äquilibrierung durch und führen Sie einen weiteren Testlauf durch. Als nächstes zentrifugieren Sie die Proteinprobe im Labor 10 Minuten lang bei 13.000 mal G, um Aggregate zu entfernen.Übertragen Sie den Überstand in ein HPLC-kompatibles Glasfläschchen. Legen Sie das Fläschchen in den Autosampler und notieren Sie sich die Probenposition. Verriegeln Sie den Stall und erstellen Sie einen Ordner für die Experimentdaten in der Beamline-Steuerung.Klicken Sie dann in der HPLC-Software auf Quick Batch. Legen Sie den Dateipfad fest und aktivieren Sie die automatische ASCII-Konvertierung von UV Vis-Daten. Geben Sie das Injektionsvolumen und die Probenposition in den Autosampler ein.Klicken Sie auf Start, um die Ausführung zur Warteschlange hinzuzufügen. Geben Sie den Dateinamen ein, aber klicken Sie nicht auf "Speichern". Stellen Sie in der Beamline-Steuerungssoftware die Anzahl der Datenframes so ein, dass die SAXS-Datenerfassungszeit etwas länger ist als die HPLC-Aufnahmezeit.Öffnen Sie den Beamline-Shutter und starten Sie die SAXS-Datenerfassung. Wechseln Sie zur HPLC-Software und klicken Sie auf Speichern, um die Probe zu injizieren. Notieren Sie sich die Frame-Nummer zu Beginn der UV-Vis-Datenerfassung und überwachen Sie die summierte Intensität im Zeitverlauf.Während der Probenvorbereitung ist ein IEC-Testlauf mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 25 Millimolar bis zu einem Molar durchzuführen. Bestimmen Sie für jeden interessierenden Peak die entsprechende Menge an Puffer B mit hohem Salzgehalt in der mobilen Phase. Um das IEC SAXS-Experiment zu starten, legen Sie eine Milliliterprobe der Puffer A und B beiseite und schließen Sie die Puffer dann an das HPLC-System an.Stellen Sie die HPLC-Parameter ein, spülen Sie das System und spülen Sie die Leitungen mit salzarmem Puffer A.Verbinden Sie die Ionenaustauschersäule mit Puffer A und äquilibrieren Sie sie.Laden Sie die Ein-Milliliter-Proben der Puffer A und B in den Probenwechsler. Verriegeln Sie den Stall und führen Sie für jede Pufferprobe im Probenwechslermodus einen kurzen SAXS-Testlauf durch, um die Anfälligkeit des Puffers für Strahlenschäden zu überprüfen. Wechseln Sie dann in den HPLC-Modus und führen Sie einen weiteren SAXS-Testlauf für Puffer A durch.Vergleichen Sie die Streumuster mit denen aus dem Testlauf des Probenwechslers.Erstellen Sie als Nächstes einen Ordner für die Experimentdaten. Entwerfen Sie dann einen schrittweisen HPLC-Gradienten, der mit null Prozent hohem Salzpuffer B beginnt und in Abständen von zwei Säulenvolumina um fünf Prozent ansteigt, um 100 Prozent Puffer B zu erreichen. Richten Sie einen einzelnen Gradientenlauf ein, bei dem keine Probe injiziert wird. Öffnen Sie den Beamline-Shutter, starten Sie die SAXS-Datenerfassung und starten Sie den HPLC-Lauf.Notieren Sie sich die Anzahl der Frames, die verstrichen sind, wenn die UV-Vis-Datenerfassung beginnt. Überprüfen Sie nach der Datenerfassung, ob die summierte Intensität für mindestens 100 Frames konstant blieb und mit den Werten übereinstimmt, die Sie aus den Proben der Puffer A und B erhalten haben.Führen Sie dann eine weitere schrittweise Gradienten-HPLC-Methode durch, beginnend mit null Prozent Puffer B.Erstellen Sie einen Schritt für jeden prozentualen B-Wert, der im Offline-IEC-Gradiententestlauf bestimmt wurde. Fügen Sie Farbverlaufsschritte hinzu, die jeweils einen Prozentpunkt unter und 1,5 Punkte über diesen Werten liegen.Stellen Sie jedes Schrittintervall auf 2,5 Säulenvolumen und den letzten Schritt im Gradienten auf 100 Prozent B ein.Verdünnen Sie den Überstand nach Bedarf, um die Zusammensetzung des Puffers A zu erreichen.Stoppen Sie die HPLC-Pumpen, trennen Sie die Säulenschläuche von den Detektoren und legen Sie das Ende der Leitung in einen Behälter, um den Säulenfluss aufzufangen. Übertragen Sie dann die Puffer-A-Leitung in die verdünnte Probe und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Röhrchen eingeschlossen sind. Starten Sie die Pumpen, um die Probe in die Säule zu ziehen.Sobald der Probenbehälter fast leer ist, stoppen Sie die Pumpen und stellen Sie die Puffer-A-Flasche wieder auf die Leitung. Starten Sie die Pumpen und lassen Sie Puffer A für zwei Säulenvolumen durch die Säule laufen, stoppen Sie dann die Pumpen und schließen Sie die Säule wieder an die Detektoren an. Mit der neuen schrittweisen Methode können Sie einen einzigen HPLC-Lauf ohne automatische Probeninjektion einrichten.Öffnen Sie den Beamline-Shutter und erfassen Sie die SAXS- und UV Vis-Daten. Überwachen Sie die summierte Intensität im Zeitverlauf. Verwenden Sie dann eine Nachbearbeitungssoftware, um die HPLC-Daten in ein ASCII-Format zu konvertieren.Identifizieren Sie mit einem Online-Datenmanager die SAXS-Frames, die dem Probenelutionspeak entsprechen. Stellen Sie sicher, dass der Giyrationsradius während des gesamten Peaks stabil ist. Importieren Sie die Peak-Frames in ein SAXS-Datenverarbeitungsprogramm und erstellen Sie eine durchschnittliche, nicht korrigierte Streukurve.Vergewissern Sie sich bei SCC SAXS, dass der obere Q-Bereich des durchschnittlichen Puffers und nicht nur die nicht korrigierte Streukurve gilt. Laden und skalieren Sie die automatisch subtrahierten Frames vom Peak, und stellen Sie sicher, dass es keine systematischen Unterschiede gibt. Mittelwerten Sie alle Kurven, um die endgültige SAXS-Kurve zu erhalten.Für IEC SAXS ist der Durchschnitt von 50 Frames aus jedem Verlaufsschritt zu erreichen. Vergleichen Sie diese Durchschnittswerte mit der nicht korrigierten Kurve und wählen Sie den Verlaufsschritt mit der besten hohen Q-Übereinstimmung aus. Subtrahieren Sie den ausgewählten Durchschnitt von der nicht korrigierten Kurve, um die endgültige SAXS-Kurve zu erstellen.Bestimmen Sie schließlich die Paarabstandsverteilung und führen Sie eine Ab-initio-Modellierung durch, um das repräsentativste Modell des Proteins zu bestimmen. Die strukturellen Datenparameter, die aus SEC und IEC SAXS des D5-Proteins gewonnen wurden, waren sehr ähnlich. Die Schätzungen der Molekülmasse stimmten beide mit der vorhergesagten Masse überein.Die Ab-initio-Modellierung wurde ohne auferlegte Symmetrie und mit C6-Symmetrie durchgeführt. Beide Modelle sind mit den Experimentdaten kompatibel, was darauf hindeutet, dass die Proteinstruktur eine C6-Symmetrie besitzt. Die molekulare Modellierung ergibt eine hexogonale pyramidenartige Struktur mit einem teilweise verstopften zentralen Kanal.Die gemittelten SEC- und IEC-Modelle waren sehr ähnlich. Bei der Untersuchung einzelner Modelle stellte sich heraus, dass die Kanalobstruktionen wahrscheinlich ein Artefakt des Mittelungsprozesses sind. SAXS wird immer mehr zum Standard, aber für viele Reinigungs- und andere Ionenaustausch-Chromotographie-Schritte, die zur Beseitigung von Aggregaten oder Verunreinigungen erforderlich sind.In diesem Protokoll wurden beide Techniken vorgestellt, die Online-Größenausschluss-Chromotographie und die Online-Ionenaustausch-Chromotographie auf einer bio-SAXS-Beamline. Ein Nachteil beider Techniken ist, dass die genaue Proteinkonzentration nicht bekannt ist, so dass wir die molekulare Massenstreuung nicht bestimmen können. Für globuläre Proteine können wir jedoch immer noch das Massenvolumen abschätzen.Anstelle des schrittweisen Gradienten, den wir hier in der Ionenaustausch-Chromotographie verwendet haben, kann ein linearer Gradient angewendet werden, obwohl dies eine Optimierung der Pufferbedingung für eine optimale Trennung der Peaks erfordert. Diese Techniken ermöglichen es uns, auch auf komplizierten Systemen SAXS-Daten in guter Qualität zu sammeln.

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Forschung

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Biochemie

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der hohen Spezifität Ionenaustausch-Chromatographie mit Multiwinkel Lichtstreuung für eine genaue molare Masse Bestimmung von Proteinen, Protein-komplexe und Peptide in einer heterogenen Stichprobe. Diese Methode ist wertvoll für die Qualitätsbewertung, sowie für die Charakterisierung der native Oligomere, kostenlos Varianten und gemischt Proteinproben.

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Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

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SEC-BioSAXS-Messungen biologischer Makromoleküle sind ein Standardansatz zur Bestimmung der Lösungsstruktur von Makromolekülen und deren Komplexen. Hier analysieren wir SEC-BioSAXS-Daten aus zwei Arten häufig auftretender SEC-Spuren – Chromatogramme mit vollständig aufgelösten und teilweise aufgelösten Peaks. Wir zeigen die Analyse und Dekonvolution mit Scatter und BioXTAS RAW.

Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung

Hier stellen wir ein Protokoll für die kryogene Probenvorbereitung und den Transfer von Kristallen in die Vakuumendstation auf der Beamline I23 an der Diamond Light Source für langwellige makromolekulare Röntgenkristallographie-Experimente vor.

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Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

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Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

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