Name: Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie die photodynamische Therapie bei Lungenkrebs durch gezielte Nanopartikel mit Photosensibilisator und Antikrebsmittel verstärkt wird. Diese Methode wurde in vitro und in vivo evaluiert.

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Diese Studie wurde von Zuschuss nicht unterstützt. 14-2014-017 von der SNUBH Research Fund. Die Autoren danken J. Patrick Barron, Professor Emeritus, Tokyo Medical University und Adjunct Professor, Seoul National University Bundang Krankenhaus für seine Pro - bono - Bearbeitung dieses Manuskript.

HINWEIS: Alle Tierstudie Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Use Committee von der Seoul National University Bundang Krankenhaus genehmigt wurden (BA1308-134 / 072-01). 1. Synthese von Hyaluronsäure-Ceramid (HACE) <ol><li> Solubilisieren 12,21 mmol von Hyaluronsäure (HA) Oligomeren und 9,77 mmol Tetra- n -butylammonium Hydroxid (TBA) in 60 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW). Rühre 30 min. </li><li> Um die DS-Y30-Linker synthetisiert, aufzulösen 8,59 mmol DS-Y30 Ceramid und 9,45 mmol Triethylamin in 25 ml Tetrahydrofuran (THF). Mix mit 8,59 mmol 4-Chlormethylbenzoylchlorid in THF. Rühre 6 Stunden bei 60 ° C. </li><li> Löse das synthetisierte 8.10 mmol HA-TBA und 0,41 mmol des DS-Y30 Linkers in einem Gemisch aus THF und Acetonitril (4: 1, v / v). Rühre 5 Stunden bei 40 ° C. </li><li> Entfernen von Verunreinigungen mit einem Filtermittel Filterung und Beseitigung des organischen Lösungsmittels durch Vakuumverdampfung. Reinige das Produkt eine Dialysemembran (Molekulargewichts-Cut-off: 3,5 kDa) und lyophilisieren. </li></ol> 2. Herstellung der Nanoteilchen <ol><li> Man löst 1 mg HB und 1 mg Paclitaxel in 0.5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und Mischung mit 0,5 ml DDW durch Vortex-Mischen für 5 min. Dann solubilisieren HACE in diesem Gemisch durch Wirbelmischen für weitere 5 min. </li><li> Um das Lösungsmittel, Wärme bei 70 ° C für 4 Stunden unter einem schwachen Stickstoffgasstrom zu eliminieren. </li><li> Resuspendieren Film, der aus HACE, HB, und Paclitaxel mit 1 ml DDW. Filter mit einem Spritzenfilter (0,45 &amp; mgr; m Porengröße) zu offenen Drogen zu entfernen. </li></ol> 3. In - vitro - Phototoxizität <ol><li> Aufnahme von Nanopartikeln in Lungenkrebszelllinien <ol><li> Bereiten RPMI-1640-Medium enthaltenden 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 1% (w / v) Penicillin-Streptomycin. </li><li> Seed A549 - Zellen in 24-well Zellkulturplatten in einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen / Vertiefung (Triplikaten für jedeGruppe). In einem befeuchteten 5% CO 2 und 95% Luftatmosphäre bei 37 ° C für 24 Stunden inkubieren. </li><li> Nach Zellanheftung, um das Medium zu entfernen und die Zellen zu waschen, indem 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Man löst die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 &amp; mgr; M / ml HB. Dann brüten die Zellen mit 1 ml PBS, leer NPs, HB-NPs oder HB-P-NPs in jeder Vertiefung für 4 Stunden im Dunkeln. </li><li> Entfernen all der Lösung und Waschen der Zellen durch Zugabe von 1 ml kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. In frischem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Die Lebensfähigkeit der Zellen-Assay <ol><li> Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) im Dunkeln für verschiedene Zeiträume: 0, 5, 10, 20, 30 und 40 Sekunden (0, 2, 4 , 8, 12 und 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln. </li><li>Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; mgr; l der Zytotoxizität Messlösung in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln für 2 Stunden. </li><li> Messen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Reader. </li></ol></li><li> Die mikroskopische Analyse <ol><li> Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) im Dunkeln für 0, 20 oder 40 Sekunden (0, 8, oder 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln. </li><li> Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. </li><li> Je 50 ul von Annexin V-FITC und 50 ul 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1,5 ug / ml). Die Platte vorsichtig schütteln und für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. HINWEIS: Verwenden Sie Annexin V-FITC aus dem Fluoreszenzmikroskop-Kit. </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Halten Sie die Zellen in frischem PBS. Identifizieren Sie die apoptotischen Zellen unter Verwendung von Lichtmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung. </li></ol></li><li> Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Analyse <ol><li> Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) für 0, 20 oder 40 Sekunden (0, 8, oder 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln. </li><li> Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1 × Bindungspuffer (verdünnt 1 Teil des 10x Bindungspuffer, 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, und 25 mM CaCl 2 bis 9 Teile destilliertes Wasser) und den Transfer 100 ul der Probenlösung auf eine 5-mlKulturröhrchen. </li><li> In 5 ul von Annexin V-FITC und 5 ul Propidiumiodid (PI). Ziehen Sie das Rohr verwirbeln und für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln inkubiert. In 400 ul 1 × Bindungspuffer. HINWEIS: Verwenden Sie Annexin mit V-FITC und PI aus dem Fluoreszenzmikroskop-Kit. </li><li> Identifizieren Sie die apoptotischen Zellen durch FACS unter Verwendung von 14. Die Anregungslaserlinien von PI und Annexin V-FITC sind 488 nm und 635 nm. Messen der Fluoreszenzemission von PI und Annexin V-FITC bei 610 ± 20 nm und 660 ± 20 nm. Sammeln Sie die erworbenen Zellen auf dem Durchflusszytometer pro 10.000 Veranstaltungen. </li></ol></li></ol> 4. In vivo Wirksamkeit gegen Krebs in Tumor-tragenden Mäusen <ol><li> Lungenkrebs-induzierte Mausmodell <ol><li> Vorbereitung 1 × 10 6 A549 - Zellen in 0,1 ml RPMI-1640 - Medium; halten Sie es in Eis. </li><li> Anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten. </li><li> Injizieren Sie die Zellen subkutan in die linken Flanken von Balb / C männliche Nacktmäuse (6 - 7 Wochen alt, 20 bis 22 g). </li><li> Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen. HINWEIS: Verwenden Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt hat. Halten Sie die Mäuse unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen. </li><li> Messen Sie die Größe des Tumors mit täglich Sätteln. Berechnen Sie den Tumorvolumen (mm 3) als (Länge × Breite 2) / 2. Wenn die Tumorgröße etwa 200 mm 3 im Volumen erreicht, das Experiment zu starten. </li&gt; </ol></li><li> Anti-Krebs-Wirksamkeitsstudie <ol><li> Teilen Randomly die Mäuse in 4 Gruppen (n = 10 pro Gruppe). </li><li> Anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten. </li><li> Man löst die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml HB. Injizieren PBS, frei HB, HB-NPs oder HB-P-NPs über die Schwanzvene (2 mg / kg als HB) zweimal an den Tagen 0 und 7. </li><li> Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen. HINWEIS: Verwenden Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig durchlaufen hatzurückgewonnen. Halten Sie die Käfige dunkel und unter bestimmten Bedingungen SPF. </li><li> 24 Stunden nach jeder Injektion anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten. </li><li> Platzieren Sie den Tumor unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser auf den Tumor). Tragen Laserschutzbrille, drehen Sie den Schalter ab und beleuchten den Tumor mit einer PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) für 500 sec (200 J / cm 2) zweimal an den Tagen 1 und 8. </li><li> Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die Renovierungsarbeite hate Chirurgie an der Gesellschaft von anderen Tieren, bis sie vollständig erholt. </li><li> Halten Sie die Käfige unter SPF Bedingungen. Pflegen Sie die Käfige im Dunkeln für 24 Stunden nach der Laserbehandlung. </li><li> Optisch überwachen jeden Tag das Tumorvolumen und die Änderungen an der Tumorstelle. Messen Sie die Größe des Tumors mit einer Schieblehre, und berechnen Sie die Lautstärke (Länge × Breite 2) / 2 (mm 3). Machen Sie Fotos von den Tumorstellen für Tumoroberflächenveränderungen nach der PDT jeden Tag überprüfen. </li><li> Am Tag 16, opfern fünf Mäuse pro Gruppe von Terminal Anästhesie mit Isofluran. </li><li> Mit einer Pinzette und Schere, schneiden Sie die Außenhaut und setzen die Tumore 15. Sorgfältig ernten. Fix sie in 10% Formalin, betten sie in Paraffin und färben sie mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) für die histologische Analyse 16. </li><li> Nach 45 Tagen der Überwachung, opfern, um die restlichen Mäuse durch Klemme Narkose mit Isofluran. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der wichtigste Schritt in dieser Studie ist die Auswahl der richtigen Laserbedingungen: Wellenlänge, Leistung und Bestrahlungszeit. Die richtige Wellenlänge des Lichts, geeignet für die spezifische Photosensibilisator für die PDT notwendig. Wir haben eine 630-nm - Laser, der für Hypokrellinverbindung B. Die Ausgangsleistung angemessen war , war ein weiterer wichtiger Faktor, der bei 400 mW / cm 2 basiert auf vielen Pilotstudien festgelegt wurde. Ausgangsleistungen von mehr als 400 mW / cm 2 , um di...

Photodynamische Therapie (PDT) setzt sich aus drei Hauptfaktoren zusammen: Photosensibilisatoren, Licht und Sauerstoff. Die PDT gilt als vielversprechende Behandlung für verschiedene Krebsarten3. Wenn die Photosensibilisatoren dem Krebspatienten verabreicht werden, reichern sie sich selektiv im Tumorgewebe an. Wenn die richtige Wellenlänge des Lichts angewendet wird, führen der hochreaktive Singulett-Sauerstoff und andere freie Radikale zu einer Schädigung der Tumorzellen4. 
Lungenkrebs wurde als eine der ersten Anwendungen für PDT in den frühen 1980er Jahren eingeführt5. Die PDT bietet mehrere Vorteile bei der Behandlung von Lungenkrebs. Da es sich bei der PDT um eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Behandlung handelt, ist sie eine attraktive Alternative für Patienten, bei denen eine chirurgische Resektion nicht geeignet ist.
Es gab viele Herausforderungen, um die krebsbekämpfende Wirksamkeit der Photosensibilisatoren zu verbessern. Die Erhöhung der Akkumulation von Photosensibilisatoren in Krebsherden und die Verringerung der Akkumulation in normalem Gewebe sind die identischen Ziele für die Krebs-Targeting-Studien. Eine Vielzahl von zielgerichteten Wirkstoffabgabesystemen, wie Polymere, Liposomen und Nanopartikel, werden als Photosensibilisatorenträger eingesetzt6-8. In unseren früheren Studien erhöhten Nanopartikel effektiv die krebsbekämpfenden Fähigkeiten der Photosensibilisatoren9,10. Nanopartikel sind ideale Träger für die Krebsbekämpfung, da sie sowohl passive als auch aktive Targeting-Fähigkeiten besitzen. Die undichten Tumorgefäße bieten die Möglichkeit, dass sich Träger in Nanogröße leicht in Tumoren anreichern können, was als verbesserter Permeabilitäts- und Retentionseffekt (EPR) bekannt ist11,12. Die Interaktion zwischen den Nanopartikeln und den spezifischen Rezeptoren auf Krebszellen ermöglicht ein aktives Targeting von Krebs. In dieser Studie haben wir Nanopartikel auf Hyaluronsäurebasis so hergestellt, dass sie mit CD44 interagieren, dem wichtigsten Hyaluronsäurerezeptor, der auf Lungenkrebszellen überexprimiert wird13. 
Um die Wirksamkeit gegen Krebs zu maximieren, wird in der vorliegenden Studie eine Kombination aus PDT und Chemotherapie angewendet. Dieses Kombinationskonzept kann eine erhöhte therapeutische Wirkung ermöglichen. Darüber hinaus können verringerte Dosen sowohl des Photosensibilisators als auch des Krebsmedikaments Nebenwirkungen verringern. In der vorliegenden Studie haben wir Hypocrellin B (HB) als neuen Photosensibilisator ausgewählt. HB wird aus dem chinesischen Heilpilz Hypocrella bambuase isoliert. Shang et al. berichteten, dass die HB-basierte PDT im Vergleich zur auf Hämatoporphyrinderivaten basierenden PDT1 eine höhere Wirksamkeit gegen Krebs besitzt. Paclitaxel wurde als Krebsmedikament ausgewählt, da es sich als potenzielle Behandlung für verschiedene Krebsarten, einschließlich Lungenkrebs, erwiesenhat 2. 
Hierin haben wir die Antikrebswirksamkeit von Photosensibilisatoren (Hypocrellin B, HB) Lösung, Photosensibilisatoren-verkapselten Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikeln (HB-NPs) und sowohl Photosensibilisator- als auch Antikrebsmittel (Paclitaxel)-verkapselte Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel (HB-P-NPs) nach PDT verglichen. Die in vitro Phototoxizität in A549 (humanes Lungenadenokarzinom) und die in vivo Antitumorwirksamkeit in A549 tumortragenden Mäusen wurden untersucht.

<table><tbody><tr><td>Oligo-Hyaluronsäure</td><td>Bioland Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>DS-Y30 (Ceramid 3B; hauptsächlich N-oleoyl-phytosphingosin)</td><td>Doosan Biotech Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Adipinsäure-Dihydrazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0638</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimethylaminopropyl)-N&prime; -ethylcarbodiimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td></td></tr><tr><td>4-(chlormethyl)benzoylchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270784</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>T0546</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>17762 15</td><td>mm, RC, PP, 0,45 &micro; m</td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Mini-GeBAflex Schläuche</td><td>Gene Bio-Application Ltd.</td><td>D070-12-100</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Taihua Corporations</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; Streptomycin</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>16140071</tr><tr><td>Celite (Filtermittel)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6858</td><td>Siehe Schritt 1.4</td></tr></tbody></table>

anti-krebs-wirksamkeit der photodynamischen therapie mit lungenkrebs-targeted-nanopartikel

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode, die eine attraktive Alternative zur Behandlung von Lungenkrebs darstellt. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen.
Um die therapeutische Wirkung der PDT zu erhöhen, haben wir sowohl mit Photosensibilisatoren als auch mit Antikrebsmitteln beladene Nanopartikel entwickelt, die auf Lungenkrebs abzielen. Es wurden sowohl das auf dem EPR-Effekt basierende passive Targeting als auch das auf Hyaluronsäure-CD44-Interaktion basierende aktive Targeting angewendet. CD44 ist ein bekannter Hyaluronsäure-Rezeptor, der häufig als Biomarker für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs eingeführt wird. 
Darüber hinaus wird in der vorliegenden Studie eine Kombination aus PDT und Chemotherapie angewendet. Dieses Kombinationskonzept kann die therapeutische Wirkung gegen Krebs verstärken und Nebenwirkungen reduzieren. 
Wir haben in dieser Studie Hypocrellin B (HB) als neuartigen Photosensibilisator gewählt. Es wurde berichtet, dass HB im Vergleich zu Hämatoporphyrinderivaten eine höhere Wirksamkeit der PDT gegen Krebs bewirkt1. Paclitaxel wurde als Krebsmedikament ausgewählt, da es sich als potenzielle Behandlung von Lungenkrebs erwiesenhat 2. 
Die Antitumorwirksamkeit von Photosensibilisator (HB)-Lösung, Photosensibilisator-verkapselten Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikeln (HB-NPs) und sowohl Photosensibilisator- als auch Antikrebsmittel (Paclitaxel)-verkapselte Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel (HB-P-NPs) nach PDT wurden sowohl in vitro als auch in vivo verglichen. Die in vitro Phototoxizität in A549 (humanes Lungenadenokarzinom) und die in vivo Antitumorwirksamkeit in A549 tumortragenden Mäusen wurden untersucht.
Die HB-P-NP-Behandlungsgruppe zeigte nach der PDT die wirksamste Antikrebswirkung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in der vorliegenden Studie hergestellten HB-P-NPs ein potenzielles und neuartiges Photosensibilisatoren-Verabreichungssystem bei der Behandlung von Lungenkrebs mit PDT darstellen.

Wir bereiteten sowohl HB-NPs und HB-P-NPs mit den oben genannten Techniken. Die mittleren Durchmesser von HB-NPs und HB-P-NPs waren 220,9 ± 3,2 nm und 211,9 ± 1,6 nm. Die Lebensfähigkeit der Zellen von A549 - Zellen nach 4 h Inkubation mit PBS, leere NPs, HB-NPs und HB-P-NPs durch Bestrahlung mit Licht gefolgt (0 bis 16 J / cm 2) ist in Abbildung 1. Ohne Licht gezeigt, ist die HB-NP zeigte Behandlun...

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine alternative Wahl zur Behandlung von Lungenkrebs. Um die therapeutische Wirkung der PDT zu erhöhen, wurden Nanopartikel entwickelt, die auf Lungenkrebs abzielen und mit einer Chemotherapie kombiniert werden. Sowohl in vitro als auch in vivo wurde die Wirksamkeit der PDT mit präparierten Nanopartikeln gegen Krebs untersucht.

Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die therapeutische Wirkung der photodynamischen Therapie bei der Behandlung von Lungenkrebs zu erhöhen, indem sowohl Photosensibilisator als auch zielgerichtete Nanopartikel, die einen Antikrebswirkstoff enthalten und gegen Lungenkrebs gerichtet sind, verwendet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der photodynamischen Therapie zu beantworten, beispielsweise welche geeigneten Bedingungen für die Wirkstoffe in in-vitro- und in-vivo-Studien vorliegen. Da photodynamische Therapien im Krebsbereich weit verbreitet sind, können mit dieser Technik Vorstudien an Präkanzerosen mit herkömmlichen Photosensibilisatoren oder neuen Indikationen durchgeführt werden.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie verschiedener Krankheiten wie Tuberkulose, Ulkus und dermatologische Bereiche unter Verwendung unterschiedlicher jährlicher Module. Zunächst wird Hyaluronsäure-Ceramid gemäß dem beigefügten textlichen Protokoll synthetisiert. Das Produkt wird anschließend mit einer 3,5-Kilodalton-Dialysemembran gereinigt und myophalisiert.Bereiten Sie anschließend Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel allein vor. Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel zusammen mit einem Photosensibilisator sowie Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel mit einem Antikrebsmittel und dem Photosensibilisator. Säen Sie die Lungenkarzinomzelllinie A549 in die Vertiefungen einer 24-Loch-Zellkulturplatte mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung aus und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.Am nächsten Tag das Medium entfernen und die Zellen mit einem Milliliter PBS waschen. Anschließend die hergestellten Nanopartikel in PBS unter Wirbeln so auflösen, dass die endgültige Konzentration des Photosensibilisators Hypocrellin B zwei Mikromol pro Milliliter beträgt. In jeweils vier Vertiefungen je einen Milliliter PBS, einen Milliliter der leeren Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel, einen Milliliter der Nanopartikel mit dem Photosensibilisator sowie einen Milliliter der Nanopartikel, die sowohl den Photosensibilisator als auch das Antikrebsmittel enthalten.Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Dunkeln, um die Aufnahme der Nanopartikel in die Zellen zu ermöglichen. Entfernen Sie anschließend die gesamte Lösung und waschen Sie die Zellen, indem Sie ein Milliliter kalte PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal und geben Sie dann frisches Kulturmedium hinzu.Als Nächstes stellen Sie die 24-Loch-Kulturplatte unter eine Lichtleitfaser für die photodynamische Therapie und positionieren die Faser einen Zentimeter vom ersten Loch entfernt. Der Abstand zwischen der Lichtleitfaser für die photodynamische Therapie und den Zellen war in dieser Studie der entscheidende Faktor. Es war wichtig, den optimalen Abstand zu ermitteln, der das gesamte Zellareal mit Licht erfassen kann.Danach Sicherheitsbrille tragen und das Licht ausschalten. Beleuchten Sie die Zellen im Dunkeln zwischen fünf und 40 Sekunden mit dem Laser, um hochreaktiven singulett Sauerstoff und andere freie Radikale in den Photosensibilisator enthaltenden Nanopartikeln zu aktivieren. Nach der Lichtexposition inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden im Dunkeln.Als Nächstes das Kulturmedium abpipettieren und die Zellen mit einem Milliliter kalter PBS waschen. Den Waschschritt einmal wiederholen und anschließend 100 Mikroliter Medium sowie 10 Mikroliter Lösung zur Messung der Zytotoxizität in jede Vertiefung geben. Die Zellen zwei Stunden im Dunkeln in der Lösung inkubieren und danach alle Proben in eine 96-Loch-Platte überführen.Messen Sie die Extinktion bei 450 Nanometern mithilfe eines Mikroplattenlesegeräts. Gewinnen Sie A549-Zellen und resuspendieren Sie eine Million Zellen in 0,1 Milliliter RPMI-1640-Medium. Stellen Sie die resuspendierten Zellen auf Eis.Bereiten Sie als Nächstes eine männliche BALB/C-Nacktmaus für die Injektion vor. Füllen Sie anschließend die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel und injizieren Sie sie in die linke Flanke der Maus. Messen Sie die Tumorgröße täglich mit einem Messschieber.Wenn die Tumorgröße ein Volumen von etwa 200 Kubikmillimetern erreicht hat, beginnen Sie das Experiment, indem Sie zunächst jede Maus wiegen. Lösen Sie anschließend die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter auf und geben Sie je einen Mikroliter der Suspension pro Gramm Mausgewicht in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Injizieren Sie die Nanopartikel am Tag null und am Tag sieben über eine Schwanzveneninjektion.24 Stunden nach jeder Injektion das Maus betäuben und die Tumorregion unter die Lichtleitfaser der photodynamischen Therapie bringen, sodass sie einen Zentimeter von der Faser entfernt ist. Es ist wichtig, die gesamte Tumoroberfläche mit Licht zu bedecken, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Laserschutzbrille anlegen, den Raumlichtschalter ausschalten und den Tumor an Tag eins und Tag acht jeweils 500 Sekunden lang mit einem Laser für die photodynamische Therapie beleuchten.Nach der Laserbehandlung die Mäuse 24 Stunden lang in ihren Käfigen im Dunkeln halten. Tumorvolumen und Veränderungen an der Tumorregion täglich visuell überwachen. Zur Überprüfung von Oberflächenveränderungen die Größe des Tumors täglich mit einem Messschieber bestimmen und Bilder der Tumorstellen aufnehmen.Die Lebensfähigkeit von Lungenkrebszellen wird hier nach vierstündiger Inkubation mit den Nanopartikeln und anschließender Bestrahlung gezeigt. Ohne Licht zeigten die Zellen, die Nanopartikeln mit nur Photosensibilisator ausgesetzt waren, keinerlei Anzeichen von Toxizität, während die Zellen, die Nanopartikeln mit sowohl Photosensibilisator als auch Paclitaxel ausgesetzt waren, eine Zelllebensfähigkeit von etwa 81 % aufwiesen. Mit zunehmender Bestrahlungsdauer nahm die Zelllebensfähigkeit in beiden Behandlungsgruppen mit dem Photosensibilisator ab.Die Behandlungsgruppe, die auch Paclitaxel enthielt, wies die stärkste Phototoxizität auf. Dies spiegelte sich ebenfalls in der Tumormodellstudie wider, da das Tumorvolumen bei Mäusen, die mit diesen beiden Behandlungsgruppen behandelt wurden, niedriger war als bei den Kontrollen. Außerdem war die Gruppe, die mit den Nanopartikeln behandelt wurde, die Paclitaxel und Photosensibilisator enthielten, signifikant niedriger als alle anderen Gruppen.Obwohl die Tumorgröße signifikant kleiner war, zeigten die mit Nanopartikeln, die sowohl den Photosensibilisator als auch Paclitaxel enthielten, behandelten Mäuse starke Blutungen und die schnellste Entwicklung von Nekrosen. Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Laserbehandlungen im Bereich der photodynamischen Therapie, um die Krebsbehandlung in in-vitro- und in-vivo-Systemen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die photodynamische Therapie in in-vitro- und in-vivo-Systemen anwendet.

anticancer-efficacy-photodynamic-therapy-with-lung-cancer-targeted

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Lungenkrebs. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen. In diesem Protokollvideo wird eine PDT-basierte Methode verwendet, um das phototoxische Potenzial eines potenziellen Photosensibilisators in Lungenkrebszellen zu bewerten.

In vitro Phototoxizitäts-Assay: Eine PDT-basierte Methode zur Bewertung des phototoxischen Potenzials eines Photosensibilisators in Lungenkrebszellen

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Lungenkrebs. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen. Dieses Video beschreibt die in vivo Anti-Tumor-Wirksamkeitsanalyse mit Hilfe von Photosensibilisatoren, die Nanopartikel enthalten, in einer tumortragenden Maus, um das phototoxische Potenzial des...

In vivo Antitumor-Wirksamkeitsanalyse der PDT: Eine Technik zur Bestimmung des phototoxischen Potenzials eines Photosensibilisators bei tumortragenden Mäusen

Dieses Video demonstriert eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapietechnik zur Behandlung von Lungenkrebs in einem manipulierten Mausmodell, das Luciferase-exprimierende Tumorzellen zeigt. Nach der Injektion eines Antikörper-Photosensibilisator-Konjugats (APC), das an spezifische Antigene auf den Tumorzellen bindet, wird die Maus Nahinfrarotstrahlung ausgesetzt, die photochemische Veränderungen im APC induziert und zum nekrotischen Tod der gebundenen Tumorzellen führt. Die Wirksamkeit der Behandlung...

Eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapietechnik zur Behandlung von Lungenkrebs im Mausmodell

Das Protokoll ermöglicht die hier berichteten Bewertung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie (PDT) in Zelllinien und der Optimierung der PDT Einstellungen, bevor die Therapie in Tiermodellen.

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em&gt; In-vitro-</em

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von leitenden Polymer-Nanopartikeln, die mit Fulleren gemischt werden. Diese Nanopartikel wurden auf ihren potenziellen Einsatz als Photosensibilisatoren der nächsten Generation für die Photodynamische Therapie (PDT) untersucht.

Photodynamische Therapie mit Blended leitendes Polymer / Fullerene Nanopartikel Photosensibilisatoren

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine aufstrebende krebstherapeutische Strategie, die ein Antikörper-Photoabsorber-Konjugat (IR700Dye) und NIR-Licht verwendet, um Krebszellen zu zerstören. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Antitumorwirkung von NIR-PIT in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs und malignes Pleuramesotheliom mittels Biolumineszenzbildgebung zu bewerten.

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.

Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell

Dieses Manuskript stellt ein neuartiges, innovatives 3D-gedrucktes Beleuchtungsgerät zur Untersuchung der durch Rose Bengal vermittelten photodynamischen Therapie in vitro vor.

Entwicklung eines innovativen LED-basierten Beleuchtungsgeräts für die in vitro Anwendung der photodynamischen Therapie mit Rose Bengal

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für eine gezielte hyperthermische Therapie in soliden Tumormodellen erforderlich sind. Der Ansatz nutzt die photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumoral injizierte Goldnanostäbchen, um eine lokale Erwärmung innerhalb der Tumormikroumgebung zu induzieren.

Induktion gezielter milder Hyperthermie in murinen Tumormodellen durch photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumorale Gold-Nanostäbchen

Ein Verfahren zur orthotopischen Implantation von grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Bauchspeicheldrüsenkrebszellen (PANC-1 GFP) in die Bauchspeicheldrüse von Balb-c Ola Hsd-Fox1nu Mäusen zur Beurteilung der Tumorprogression und Metastasierung wird hier vorgestellt.

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Erfahren Sie, wie die photodynamische Therapie bei Lungenkrebs durch gezielte Nanopartikel mit Photosensibilisator und Antikrebsmittel verstärkt wird. Diese Methode wurde in vitro und in vivo evaluiert.

Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

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