Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Das Ziel der folgenden Experimente ist es, ein Werkzeug für Ultrastruktur- und Immunlokalisationsstudien von Suspensionszellen zur Visualisierung in der Transmissionselektronenmikroskopie vorzuschlagen. Diese Technik ist einfach zu bedienen, kostengünstig und bietet eine hervorragende Erhaltung der Zellstruktur. Hierbei handelt es sich um eine Kultur von Suspensionszellen.

Zunächst werden die Zellen durch verschiedene Zentrifugen geerntet, um ein Pellet in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu erhalten. In einem zweiten Schritt wird die Probe durch Tauchfrosten schnell eingefroren, wodurch die Zellen immobilisiert und die Bildung von Eiskristallen begrenzt wird. Als nächstes wird eine Gefriersubstitution durchgeführt, um Wasser durch Lösungsmittel zu ersetzen, das Osmiumtetroxid als Fixiermittel enthält, um die Zellstrukturen zu stabilisieren.

Die Ergebnisse zeigen, dass das Einfrieren und die Gefriersubstitution die Infrastruktur der Zellen perfekt erhalten. Die chemische Fixierung war eine primäre Methode zur Fixierung von Gewebe oder Zellen für die Transmissionselektronenmikroskopie, aber bei dieser Methode werden in der Regel Artefakte und die Extraktion von zellulärem Inhalt beobachtet. Eine Alternative zur chemischen Fixierung ist die Kryofixierung.

Diese Methode stellt die beste Wahl dar, um die höchste Qualität der Morphologie in dünnen Harzschnitten zu erzeugen. Plunge Freezing ist eine Kryofixationstechnik, bei der Moleküle in der Zelle sofort immobilisiert werden, um Schäden durch herkömmliche chemische Fixierung zu vermeiden. Vor dem Tauchgefrieren der Probe muss ein mit Formvar-Folie geschnittenes Gitter vorbereitet werden, das als Träger für das Einfrieren verwendet werden kann.

Glasobjektträger mit einem fusselfreien Tuch auf Hochglanz polieren und abwischen. Tauchen Sie den Objektträger einige Sekunden lang in eine Lösung von Formvar 0,3% in Chloroform und lassen Sie ihn aufrecht in einem Becherglas trocknen. Die Manipulation muss aufgrund des Vorhandenseins von Chloroform unter einem Abzug mit persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.

Nachdem Sie einen Kristallisator mit destilliertem Wasser gefüllt haben, führen Sie einen Glasstab über die Wasseroberfläche, um Staub zu entfernen. Wenn die Folie trocken ist, ritzen Sie die Kanten mit einer scharfen Rasierklinge ein, damit sich die Folie abheben kann. Frosten Sie den Objektträger, indem Sie stark auf den Objektträger ausatmen, um eine Schicht Wasserdampf auf der Folie zu erhalten.

Sie die Folie sofort auf die Wasseroberfläche schwimmen, indem Sie den Boden der Rutsche in einem Winkel von etwa 30 Grad zur Wasseroberfläche berühren. Senken Sie den Schieber langsam in die Badewanne ab und ziehen Sie die Folie bei Bedarf ab. Der Formvar-Film setzt sich langsam auf der Wasseroberfläche ab.

Befestigen Sie die Folie mit einer Pinzette am Rand des Kristallisators. Legen Sie die 400er Kupfergitter vorsichtig mit der Vorderseite nach unten auf die Folie in den Bereichen, die die richtige Dicke und ohne Falten haben. Die Folie mit den Gittern wird aufgenommen, indem man sie mit Joseph-Papier überzieht, während sie auf der Wasseroberfläche schwimmen.

Nimm den Rand des Joseph-Papiers und die Folie mit den Gittern sollte dazu kommen. Lassen Sie Ihre Finger nicht die Wasseroberfläche berühren, sonst laufen Sie Gefahr, einen Film im Wasser zu hinterlassen. Lassen Sie die Gitter einige Stunden trocknen, bevor Sie sie verwenden.

Für ultrastrukturelle Untersuchungen geben Sie Osmiumtetroxid-Ampulle in einen Glaskolben. Schütteln Sie den Kolben gut, um die Ampulle zu zerbrechen. Fügen Sie ein geeignetes Volumen Aceton von 100 % hinzu, um eine Endkonzentration von 4 % zu erreichen. Rühren Sie den Kolben mit dem Gefriersubstitutionsmedium um und geben Sie 1,5 Milliliter Aliquots mit einer Kunststoff-Transferpipette in Kryofläschchen ab.

Alle Verschlüsse verschließen und vor der Verwendung bei minus 84 Grad im Gefrierschrank aufbewahren. Für Studien zur Proteinimmunmarkierung bereiten Sie 0,1 % Uranylacetat in Aceton vor. Wenn die Lösung klar wird, filtrieren Sie mit einem 0,2-Mikrometer-Filter und geben Sie 1,5-Milliliter-Aliquote in Kryoröhrchen ab.

Vor der Verwendung bei minus 84 Grad im Gefrierschrank aufbewahren. Um sicherzustellen, dass die Pellets aus verschiedenen Zelltypen die entsprechende Konsistenz haben, werden Rohhefezellen in mindestens vollständiges flüssiges Medium gegeben, um eine 10 bis neun Zellen zu erhalten. Escherichia coli in DTY-Medium, um fünf 10 bis 10 Bakterienzellen zu erhalten.

Leishmania flagellum in AM-Medium und Trypanosoma brucei in SDM79-Medium, um fünf 10 bis acht Parasitenzellen zu erhalten. Das Kulturmedium mit den Suspensionszellen wird in ein 50-Milliliter-Propylenröhrchen überführt und drei Minuten lang bei 1.500 g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter des jeweiligen Zellkulturmediums.

einem Mikrozentrifugenröhrchen eine Minute lang bei 3.900 g zentrifugieren. Den Überstand vollständig entfernen. Für die Tauchgefriermethode muss eine Propanflasche mit einem Schlauch verwendet werden, der mit dem Propanzylinder verbunden ist.

Da Propan potenziell explosiv ist, sollten Sie die Verflüssigung in einem gut belüfteten Raum oder in einem Abzug durchführen. Offene Flammen sind nicht erlaubt. Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff muss immer persönliche Schutzausrüstung einschließlich Kryohandschuhe getragen werden.

Geben Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff in eine Styroporschale. Stellen Sie den Messingbecher in flüssigen Stickstoff. Blasen entstehen.

Warten Sie, bis die Blasen abgeklungen sind. Anschließend wird der Messingbecher eingefroren. Bringen Sie das mit der Propanflasche verbundene Rohr in Kontakt mit der Messingkappenwand.

Öffnen Sie vorsichtig das Ventil der Propangasflasche. Es bildet sich viel Rauch, da sich Propan nicht zu verflüssigen beginnt. Wenn sich das Propan zu verflüssigen beginnt, verschwindet der Rauch.

Stoppen Sie die Verflüssigung, indem Sie das Ventil der Propanflasche schließen und den mit der Propanflasche verbundenen Schlauch schnell entfernen. Füllen Sie die Styroporschale bis zu fünf Millimeter von der Oberseite des Messingbechers entfernt mit flüssigem Stickstoff. Frieren Sie kleine Messingbecher ein, in denen wir die Probe nach dem Einfrieren ersetzen, indem wir sie in flüssigen Stickstoff legen.

Geben Sie einen Becher für eine Probe. Achten Sie darauf, die Proben nicht zu vermischen. Um die entsprechende Konsistenz des Pellets zu erhalten, ist es nur notwendig, die Kulturbedingungen und die zuvor angegebenen Zentrifugationsparameter zu beachten.

Frieren Sie die Pinzette ein, bevor Sie sie verwenden. Nehmen Sie ein 400-Mesh-Kupfermikroskopiegitter, das mit Formvar geschnitten wurde. Tauchen Sie eine zweischneidige Präpariernadel in das Pellet.

Legen Sie mit dem Werkzeug einen Tropfen Pellet auf das Gitter. Tauchen Sie das Gitter sehr schnell in flüssiges Propan und rühren Sie einige Sekunden um. Den gefrorenen Rost schnell in den kleinen Messingbecher geben.

Erstellen Sie für jedes Beispiel mindestens drei Raster. Vergessen Sie nicht, die Pinzette einzufrieren, bevor Sie ein Gitter aufnehmen. Frieren Sie die Pinzette ein, bevor Sie sie verwenden.

Nehmen Sie den Becher schnell heraus und geben Sie die gefrorenen Gitter mit der Pinzette in das Kryofläschchen. Setzen Sie die Kappe wieder auf das Kryofläschchen. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Raster jeder Probe.

Schließen Sie die Verschlüsse und rühren Sie das Kryofläschchen um, um sicherzustellen, dass sich die Proben in einem Gefriermedium befinden. Lassen Sie die Kryofläschchen drei Tage lang im minus 84 Grad heißen Gefrierschrank. Transportieren Sie die Kryofläschchen in einer Styroporschale, um einen plötzlichen Temperaturanstieg auf den minus 30 Grad heißen Gefrierschrank zu vermeiden.

Lassen Sie eine Stunde bei minus 30 Grad. Tragen Sie die Kryofläschchen zwei Stunden lang bei minus 15 Grad, dann setzen Sie die Proben zwei Stunden lang bei vier Grad und 30 Minuten bei Raumtemperatur ein. Entfernen Sie das Gefriersubstrat mit Kunststoff-Transferpipetten und geben Sie es in eine geeignete, deutlich gekennzeichnete Abfallflasche.

Geben Sie etwa 500 Mikroliter 100% Aceton. Öffnen Sie das Glasfläschchen, rühren Sie das Kryoröhrchen um und geben Sie das Gefriermedium schnell in ein Glasfläschchen. Spülen Sie ein Kryofläschchen mit 100% Aceton.

Dreimal 10 Minuten mit 100% Aceton spülen. Transportieren Sie die Kryofläschchen in einer Styroporschale, um einen plötzlichen Temperaturanstieg auf den minus 30 Grad heißen Gefrierschrank zu vermeiden. Lassen Sie zwei Stunden bei minus 30 Grad.

Nachdem Sie die Proben in ein Polypropylenfläschchen gegeben haben, ersetzen Sie das Gefriersubstitutionsmedium durch frisches Gefriersubstitutionsmedium und lassen Sie es zwei Stunden bei minus 30 Grad stehen. Spülen Sie eine Stunde mit 100% Aceton und dreimal eine Stunde mit 100% Ethanol. Die Tauchgefrier-/Gefriersubstitutionsmethode führte zu einer hervorragenden Konservierung der intrazellulären Strukturen der Suspensionszellen.

Bei Saccharomyces cerevisiae sind die Strukturen nicht geschrumpft und das Zytoplasma erscheint dicht. Darüber hinaus sind die Membranen glatt, was ein Beweis für eine gute Konservierung ist. Alle Organellen, wie Zellkern, Mitochondrien und Vakuolen, können perfekt identifiziert werden.

Eine hervorragende Konservierung wird auch bei Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei und Escherichia coli beobachtet. Im Zellkern sind die Doppelmembran, die die Kernhülle bildet, die Kernpore, der Spindelpolkörper und die Ribosomen, die an der äußeren Membran der Kernhülle befestigt sind, deutlich sichtbar. In den Mitochondrien sind die Einstülpungen der inneren Membran, die sogenannten Cristae, deutlich sichtbar.

Kritische Organellen sind die Vakuolen, denn große Eiskristalle können sich leicht entwickeln. Auf dem Bild sind die Vakuolen perfekt erhalten, ohne dass die Eiskristalle beschädigt werden. Die Tauchgefrier-/Gefriersubstitutionsmethode kann auch zur Durchführung einer Proteinimmunlokalisierung verwendet werden.

Das Verfahren bewahrt die Proteinantigenität perfekt, und wie bereits erwähnt, werden die Organellen eindeutig identifiziert. Es wurden bereits verschiedene Antikörper getestet, die auf verschiedene Proteine in Hefe abzielen, wie z. B. Anti-ATP-Synthase und Anti-Porin. Ein solches Experiment ist auch für verschiedene experimentelle Systeme möglich, wie z.B. bei Leishmania, wo das Flabarin-Protein lokalisiert wurde.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben mit der Tauchgefrier-/Gefriersubstitutionsmethode vorbereitet, um sie in der Transmissionselektronenmikroskopie zu visualisieren. Diese Technik ist schnell, einfach zu bedienen, kostengünstig und bietet eine hervorragende Konservierung der Zellinfrastrukturen. Seien Sie vorsichtig mit flüssigem Stickstoff, vor allem aber mit Osmiumtetroxid und Uranylacetat.

Sie sollten im Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich Laborkittel und Handschuhen, gehandhabt werden.