Name: Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Kryofixierungsmethode für Suspensionszellen zur Untersuchung von Zellultrastrukturen und Immunlokalisierung in der Transmissionselektronenmikroskopie.

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Wir danken M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet und A. Devin für ihre Hilfe und Kommentare zum Manuskript. Wir sind dankbar, dass die elektronische Abbildungs ​​Pol Bordeaux Imaging Center, wo die Bilder aufgenommen wurden. Diese Arbeit wurde von Centre National de la Recherche Scientifique unterstützt.

1. Herstellung von Formvar Grid Film HINWEIS: Führen Sie Chloroform Manipulation unter einer Abzugshaube persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel, Brille). Verwenden Sie 400 mesh Elektronenmikroskopie Kupfergitter. Mit anderen Netztypen (andere Maschengrößen, Gold und Nickel Grids), ist die Qualität des Einfrierens schlechter. <ol><li> Vorbereiten einer 100 ml-Lösung von 0,3% Formvar in Chloroform. Lassen Sie es über Nacht ohne Rühren auflösen. </li><li> Setzen 400 Mesh (Anzahl der Löcher pro Quadratzoll) Elektronen microscopycopper Gitter (Durchmesser 3,05 mm) in einem Glasfläschchen (Höhe und 3 cm Durchmesser 2 cm) mit Aceton. Rührt das Glasfläschchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand. Entfernen des Acetons mit einer Kunststoff-Transferpipette. Das Lösungsmittel für 5 min zu verdampfen. Übertragen, die Gitter, indem sie auf ein Filterpapier gegossen, und es ihnen ermöglichen, für 5 Minuten zu trocknen. </li><li> Polier ein 76 x 26 mm 2 Glasträger indem sie mit einem fusselfreien Tuch , bis glänzend / rutschigem Abwischen.</li><li> Nimm einen Kristallisator (Durchmesser 15 cm, Höhe: 7 cm und Kapazität 1200 ml) und fülle mit destilliertem Wasser bis zum Rande. Reinigen der Wasseroberfläche durch einen Glasstab über die Oberfläche verläuft zweimal Staub zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Glasobjektträger zwischen zwei Fingern und tauchen sie in die Formvar-Lösung für einige Sekunden. Halten Sie es aufrecht unter einem Upside-Down-Becher für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Wenn der Film trocken ist, mit einer scharfen Rasierklinge, die Ränder der Glasträger punkten die Grenzen des Films zu definieren, von der Folie abgelöst werden. </li><li> Atmen Sie tief ein und ausatmen stark auf die Folie eine Schicht aus Wasserdampf erhalten auf und unter dem Film den Film leicht opak und verbessern die Sichtbarkeit zu machen. <ol><li> Unmittelbar schwebt die Folie auf die Kristallisator Wasseroberfläche durch den unteren Rand der Folie mit einem Winkel von etwa 30 ° zu berühren. Lassen Sie den Film Freigabe von der Rutsche und schälen sie auf den Kristallisator Wasseroberfläche ab. Ziehen Sie den Film mit der ausPinzette, falls erforderlich. </li></ol></li><li> Sanft lag die Gitter auf dem Film in den Bereichen auf der Wasseroberfläche schwimmenden Seite nach unten, die von der richtigen Dicke (etwa 10 nm) und ohne Falten sind. </li><li> Nimm den Film durch Abdecken der Gitter mit Joseph Papier , wie sie auf der Kristallisator Wasseroberfläche schwimmen. <ol><li> das Joseph-Papier mit einer Hand zu halten, ist ein Ende des Joseph Papier zu einem Ende des Films berühren. Warten Sie, bis das Joseph Papier vollständig nass ist. Entfernen Sie die Joseph-Papier mit den Gittern aufgeklebt. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Gitter für 24 h in einer bedeckten Petrischale für die endgültige Trocknung und Lagerung vor bei Raumtemperatur verwenden. </li></ol> 2. Herstellung von Gefriersubstitution Medium HINWEIS: Osmiumtetroxid (OsO 4) und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalien. Behandeln Sie sie im Abzug, während geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen (PSA) mit einem Laborkittel und Handschuhe. Follow Sicherheitswarnungen für die Handhabung (OsO 4) und Uranylacetat. Verwendung von O-Ring - Kryoröhrchen die Leckage von OsO 4 zu vermeiden. <ol><li> Elektronenmikroskopische Untersuchungen <ol><li> Setzen Glas OsO 4 Ampulle in einem Glaskolben. </li><li> Brechen Sie die Ampulle durch Schütteln des Kolbens. </li><li> Hinzufügen einer geeigneten Volumen Aceton 100% 4% Endkonzentration zu erhalten. </li><li> Umrühren und verteilen 1,5 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen. </li></ol></li><li> Protein Immunmarkierung <ol><li> Platzieren 0,05 g Uranylacetat in einem Glaskolben. </li><li> In 50 ml 100% Aceton. </li><li> Man rührt die Lösung mit einem Magnetrührer gerührt. Wenn die Lösung klar wird, filtern sie einen 0,2 um-Filter. </li><li> Dispense 1,5 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen. HINWEIS: Bereiten Sie die Kryoröhrchen Gefriersubstitution enthaltenden Medium vor dem Tauchgefrierverfahren und halten sie in -84 ° C Gefrierschrank. Kehren Sie die Glaskolben wegzuwerfen dieOsO 4 Ampulle in den Sondermüll. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Zellen HINWEIS: Dieser Schritt ist für den Erfolg des Verfahrens kritisch ist. Für alle Zelltypen, wachsen Zellen, die die angegebene Anzahl von Zellen zu erhalten. Zentrifuge in dem angegebenen Rohr zu der angegebenen Zeit und Geschwindigkeit. <ol><li> Um die geeignete Konsistenz der Pellets aus verschiedenen Zelltypen zu erhalten, wachsen Zellen wie folgt: <ol><li> Für Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe, Beimpfung von Hefe in 5 ml Minimal oder vollständigen flüssigen Mediums. über Nacht bei 28 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) der Übernachtkultur. Verdünnte Hefezellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 28 ° C inkubieren, Drehen , um 1 x 10 9 7 Hefezellen. </li><li> Für Leishmania flagellum, inoculate Parasiten in 5 ml AM-Medium mit 7,5% FCS (fötales Kälberserum). über Nacht bei 24 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messen Sie die OD 600 der Kultur über Nacht. Verdünnte Parasitenzellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 24 ° C inkubieren, Drehen , um 5 x 10 8 Parasitenzellen 12. </li><li> Für Trypanosoma brucei, Beimpfung von Parasiten in 5 ml SDM-79 - Medium mit 10% FCS und 30 &amp; mgr; g / ml Hygromycin. über Nacht bei 27 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messen Sie die OD 600 der Kultur über Nacht. Verdünnte Parasitenzellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem Selektivmedium. Weiterhin Zellen bei 27 ° C inkubieren, Drehen , um 5 × 10 8 Zellen 13 Parasiten. </li><li> Für Escherichia coli, Beimpfung von Bakterien in 5 ml DYT - Medium mit 100 ug / ml Ampicillin enthält. über Nacht bei 37 ° C inkubieren, Drehen (180rpm). Messen Sie die OD 600 der Kultur über Nacht. Verdünnte Bakterienzellen auf einen OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 37 ° C inkubieren, Drehen , um 5 × 10 10 Bakterienzellen 14. HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht wurden Zellen in Kultur können in entweder logarithmisch oder stationären Wachstumsphase sein. Sehr langsam wachsende Zellstämme können Inkubationszeiten länger als eine Nacht oder Impfung von einer größeren Anzahl von Zellen erfordern, wie empirisch ermittelt. </li></ol></li><li> Für alle Zelltypen, übertragen das Kulturmedium, die Zellen zu 50 ml Polypropylen-Röhrchen und zentrifugiert für 3 min bei 1.500 x g enthält. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet aller Zelltypen in 1 ml der jeweiligen Zellkulturmedium. </li><li> Zentrifuge alle Zelltypen in einem Mikrozentrifugenröhrchen für 1 min bei 3.900 x g. vollständig entfernen Sie den Überstand. </li><li> Halten Sie die Zellen auf Eis. </li></ol> Hinweis: Die beim Umgang mit flüssigem Stickstoff mit Vorsicht. Persönliche Schutzausrüstung einschließlich cryogloves und Brillen. Propan ist potentiell explosiv, so führt die Verflüssigung in einem gut belüfteten Raum oder unter einer Abzugshaube. Kein offenes Feuer ist nicht erlaubt. <ol><li> Setzen etwa 150 ml flüssiger Stickstoff in einer Polystyrolschale. Legen Sie eine Messingbecher (Höhe 3,6 cm, Durchmesser 2 cm und Dicke 1,5 mm) in flüssigem Stickstoff sie einzufrieren. Nicht der flüssige Stickstoff in die Messingbecher eindringen lassen. </li><li> Warten Sie, bis die Blasen sicher sein abklingen, dass die Messingbecher eingefroren. </li><li> Setzen Sie den Schlauch an die Propangasflasche in Kontakt mit der Messing Topfwandung verbunden. </li><li> öffnen sanft das Propan Flaschenventil. HINWEIS: Bei diesem Schritt verflüssigt das Propan in den Messingbecher. </li><li> Stoppen Sie die Verflüssigung des Propan Flaschenventil schließen und schnell den Gasschlauch zu entfernen. </li><li> Füllen Sie das Polystyrolschale mit flüssigem nitrogen bis zu 5 mm von der Oberseite der Messingbecher. Nicht der flüssige Stickstoff in Messingbecher eindringen lassen. </li></ol> 5. Plunge Einfrieren der Probe <ol><li> Setzen etwa 200 ml flüssiger Stickstoff in Polystyrolschale. Gefriert kleine Messingbecher (Höhe 1,5 cm Durchmesser 2,5 cm und Dicke 1 mm), indem sie in flüssigem Stickstoff setzen. Legen Sie eine Tasse für eine Suspensionszellprobe. Achten Sie darauf, Proben zu mischen. Zu diesem Zweck setzte die Probe 1 in der Tasse 1, Probe 2 in Becher 2 usw. </li><li> Frieren der Pinzette durch ihre Spitze in flüssigem Stickstoff eintauchen. </li><li> Tauchen einer Doppelkante Präpariernadel im Pellet in 3,5 erhalten. </li><li> Mit einer Pinzette ergreifen ein 400 mesh Kupfergitter Mikroskopie mit Formvar in Abschnitt 1 hergestellt, beschichtet. </li><li> Unter Verwendung des Präpariernadel, einen Tropfen des Pellets in 3,5 auf dem Gitter erhalten wird. Probieren Sie verschiedene Tropfengrößen (zB 2, 5 und 10 &amp; mgr; l). </li><li> Sehr schnell das Gitter durch die Pinzette in flüssiges Propan Gene gehalten stürzenin Abschnitt 4 und rühren das Gitter mit kreisförmiger Bewegung für einige Sekunden bewertet. </li><li> Schnell überträgt das gefrorene Gitter mit der Pinzette in die kleinen Messingbecher in Abschnitt 5.1 eingefroren. HINWEIS: Für jede Probe macht mindestens 3 Gitter. Immer die Pinzette einfrieren, bevor ein Kupfernetz nehmen. </li></ol> 6. Gefriersubstitution HINWEIS: Osmiumtetroxid ist möglicherweise volatil, so mit Dampf Patronen ein Luftfiltergerät verwenden. das Fixiermittel in flüssigem Stickstoff vor dem Eintauchen Einfrieren Einfrieren ist ebenfalls eine Lösung. <ol><li> Für Ultra Studien, öffnet die 1,8 ml Kryoröhrchen Röhren gefrierSubstitutionsMedium in Abschnitt 2.1 enthalten, hergestellt. Für Immunolokalisation Studien, öffnet die 1,8 ml Kryoröhrchen Röhren gefrierSubstitutionsMedium in Abschnitt 2.2 enthalten, hergestellt. Setzen Sie die Kappe auf dem Kryovials. </li><li> Frieren der Pinzette durch ihre Spitze in flüssigem Stickstoff eintauchen. </li><li> Schnell die Kappe entfernen und die gefrorenen Gitter i übertragennde Kryovials mit der Pinzette. </li><li> Setzen Sie die Kappe wieder auf dem Kryovials. </li><li> Wiederholen Sie die Operation für jedes Raster von jeder Probe. </li><li> Schließen Sie alle Kappen und rühren Sie die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand der Proben, um sicherzustellen, in dem Gefriertsubstitutionsmedium sind. </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einem luftdichten Kasten 3 Tage lang in einem -84 ° C-Gefrierschrank während des Gefriertsubstitutionsprozesses. </li></ol> 7. Proben Warming <ol><li> Ultra Studien <ol><li> Trägt die Kryoröhrchen in einer Polystyrol-Schale (ein plötzliches Ansteigen der Temperatur zu vermeiden) auf eine -30 ° C Gefrierschrank. Legen Sie sie in der -30 ° C Gefrierschrank für 1 h. </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einen -15 ° C Gefrierschrank für 2 h. Platzieren Sie die Proben bei 4 ° C für 2 h und dann 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen des Einfrierens Substitutionsmedium mit einer Kunststoff-Transferpipette. In etwa 500 &amp; mgr; l 100% Aceton. </li><li> Rühre das 1,8 ml Kryoröhrchenmit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und gießt das schnell Aceton (1,5 ml), die Gitter in einem Glasfläschchen (Höhe und 3 cm Durchmesser 2 cm) enthält. </li><li> Spülen Sie die gleiche Cryovial mit 1 ml 100% Aceton sicher sein, alle Netze zu übertragen haben. Rühren Sie die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und schütten den Inhalt der Kryoröhrchen in einen Glaskolben. </li><li> Spülen jedes Glasfläschchen mit 3 ml 100% igem Aceton 3 Mal für 10 min. </li><li> Folgen der Einbettung und Inklusion Verfahren wie in Referenz 15 beschrieben. Imprägnieren, um die Probe mit Konzentrationen von Epoxidharz in Aceton (25%, 50% und 75%) und Einbetten die Probe mit 100% Epoxidharz in Gelatinekapseln zu erhöhen. </li></ol></li><li> Immunmarkierung Studien <ol><li> Tragen die 1,8 ml Kryoröhrchen in einer Polystyrolschale mit dem -30 ° C Gefrierschrank (ein plötzliches Ansteigen der Temperatur zu vermeiden). </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen für 2 h in einem -30 ° C-Gefrierschrank. </li><li> In einem -30 °<html> C Gefrierschrank, rührt die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und schnell das Gefriertsubstitutionsmedium in einer Polypropylenampulle (Höhe 5 cm und Durchmesser 1,5 cm) gießen. </li><li> Ersetzen des Einfrierens Substitutions Medium mit 2 ml frischem gefrierSubstitutionsMedium. </li><li> Platzieren Sie die Polypropylenfläschchen für 2 h in einem -30 ° C-Gefrierschrank. </li><li> Spülen Sie das Polypropylenfläschchen für 1 h mit 2 ml 100% igem Aceton und dreimal für 1 h mit 2 ml 100% igem Ethanol. </li><li> Folgen der Einbettung und Inklusion Verfahren wie in Referenz 15 beschrieben. Imprägnieren, um die Probe mit steigenden Konzentrationen von Acrylharz (25%, 50% und 75% in Aceton) und Einbetten die Probe mit 100% Acrylharz in Gelatinekapseln. </li></ol></li></ol> 8. Visualization of Samples <ol><li> Nach dem Einbetten, stellt 80 nm ultra-dünne Schnitte der Proben mit einem Ultramikrotom. Kontrast, um die Abschnitte mit 2% Bleicitrat bei Raumtemperatur für 1 minass = &quot;xref&quot;&gt; 15. </li><li> Verwenden , um ein 80 kV oder 120 kV Elektronenmikroskops die Abschnitte 15 zu beobachten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

TEM ist eine leistungsfähige Methode für die ultrastrukturelle Beobachtung von Organellen, Zellen und Geweben. Kryofixierung / Gefrier-Substitution ist derzeit die beste Methode zur Erhaltung der Ultrastruktur- und Protein-Antigenität. Chemische Fixiermittel durchdringen und wirken sehr langsam, wodurch strukturelle Umlagerungen vor der vollständigen Stabilisierung der Ultrastruktur 2 möglich sind . Umgekehrt stabilisiert die Kryofixierung / Gefrier-Substitution sofort die Zellstrukturen <sup cla...

Die Probenvorbereitung ist für den Erfolg eines jeden Elektronenmikroskopie Studie kritisch. Herkömmliche EM Fixierung war die primäre Methode für Gewebe oder Zellen für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 1 fixiert. Erstens, Aldehyde und Osmiumtetroxid verwendet werden, um chemisch das Material bei Raumtemperatur fest. Dann wird das Material mit organischen Lösemitteln dehydratisiert, infiltriert und in Epoxyharz eingebettet. Dieses Verfahren ist auf die Penetrationsrate von Fixierungsmittel in die Zelle abhängig. Folglich werden die Artefakte und Extraktion von Zellinhalt in der Regel 2 beobachtet. Kryofixation ist eindeutig eine bessere Alternative für die Erhaltung der Zellstrukturen 3, sie intakt zu halten. Die höchste Qualität der TEM - Aufnahmen 4 in dünnen Harzabschnitte können mit Hilfe der Kryofixation / Gefriersubstitution Verfahren erhalten werden. Das Ziel dieser Technik ist verglast bi zu erhaltengischen Proben ohne Eiskristalle Bildung oder Eiskristalle enthalten klein genug, um nicht die Ultrastruktur der Zellen zu beschädigen. Hochdruck-Gefrieren (HPF) und ultra-schnelle Kryofixation, die auch plunge Gefrieren (PF) genannt wird, sind zwei Methoden Proben cryofix. HPF bewegungsunfähig Moleküle in der Zelle augenblicklich und vermeidet die durch herkömmliche EM Fixierung verursacht wird. Verschiedene Arten von Gefriermaschinen und automatische Substitution Geräte wurden 5 entwickelt. Die Gefriermaschinen und Verbrauchsmaterialien (flüssiger Stickstoff, Probenträger, etc.) sind teuer, aber sie ermöglichen die Herstellung qualitativ hochwertige elektronenmikroskopische Aufnahmen 6, 7. PF ist eine Technik , die in den frühen 1950er Jahren verwendet wurde und wird in der Literatur als einfach und billig 8 .Während die PF Verfahren, die vorbereitete Probe mit einer schnellen Rate eingefroren wird beschrieben Eiskristalle Größe von weniger als 3 bis 5 nm zu erhalten. Zu diesem Zweck wird die ProbeIn ein flüssiges Kryogen, wie Ethan, Propan oder ein Ethan-Propan-Gemisch eingetaucht. Seit den 1950er Jahren wurden Verbesserungen von PF durchgeführt, um diese Technik einer größeren Anzahl von Benutzern zur Verfügung zu stellen. Hochdruckgefrieren ist derzeit der einzige lebensfähige Weg, um eine große Vielfalt von Proben dicker als 50 μm (bis zu einer Dicke von 200 μm für scheibenförmige Proben) 5 , während PF weit verbreitet ist, um kleine Objekte (&lt;100 nm ), Wie makromolekulare Komplexe, die in einem dünnen Film aus amorphem Eis 9 suspendiert sind. Größere Proben, beispielsweise eukaryotische Zellen, können durch PF kryofixiert werden, benötigen aber Probenhalter, wie Kapillarkupferrohre oder Sandwich-Systeme 8 , 10 , 11 . Hier wird eine schnelle, einfach zu bedienende und kostengünstige Einfrier- / Gefrier-Substitutionstechnologie vorgestellt, die für verschiedene Suspensionszellkulturen verwendbar ist.

<table><tbody><tr><td>Gitter</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften 15800</td><td></td></tr><tr><td>Propan N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelkanten-Präpariernadel</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 19130</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen 8,5 mL</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 64252</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 48851</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Glas Objektträger</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylharz</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidharz M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidharz M Härter</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Dibutylphthalat</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Epoxidharz M accelerateur</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisator</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph Papier</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Messingbecher</td><td></td><td></td><td>zum Selbermachen oder selbst hergestellt</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luftdichte Box</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Atemschutzmaske zur Luftreinigung</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kartusche für Atemschutzmaske</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Partikelfilter</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

freezing plunge: ein werkzeug für den elektronenmikroskopische und immunolokalisation studium der suspensionszellen in transmissions-elektronen-mikroskopie

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein außergewöhnliches Werkzeug für die Ultrastruktur der Zelle zu studieren, um die Proteine ​​zu lokalisieren und makromolekularen Komplexe mit sehr hohen Auflösung sichtbar zu machen. Doch so nah wie möglich an den nativen Zustand, perfekte Probenkonservierung zu bekommen ist nicht erforderlich. Herkömmliche Elektronenmikroskopie (EM) Fixierung mit Aldehyden, zum Beispiel, bietet keine gute ultra Erhaltung. Die langsame Eindringen von Fixateure induziert Zell-Reorganisation und Verlust verschiedener Zellkomponenten. Daher tritt herkömmliche EM Fixierung nicht für eine sofortige Stabilisierung und Konservierung von Strukturen und Antigenität ermöglichen. Die beste Wahl intrazelluläre Ereignisse für die Prüfung ist Kryofixation durch das Verfahren gefrier Substitution Fixierung gefolgt zu verwenden, die Zellen in ihrem nativen Zustand hält. Hochdruck-Gefrier / Gefriersubstitution, die die Integrität der zellulären Ultrastruktur bewahrt, ist die am häufigsten verwendete Methode, erfordert aber expensive Ausrüstung. Hier eine einfach zu bedienende und kostengünstige Gefriertfixationsmethode gefolgt von Gefriersubstitution für Suspensionszellkulturen vorgestellt.

In diesem Artikel wird eine einfach zu bedienende und kostengünstige Tauchgefrierverfahren für ultrastrukturelle (Abbildungen 1 und 2) und Immunmarkierung (Abbildung 3) Studien vorgestellt. Wir zeigen, dass es nicht notwendig ist, spezielle Ausrüstung für die Gefriert Auswechselbestimmungen zu haben und dass die Erwärmung Vorgang dauert weniger als 6 h statt der 24 h ein dediziertes System. <p c...

Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Das Ziel der folgenden Experimente ist es, ein Werkzeug für Ultrastruktur- und Immunlokalisationsstudien von Suspensionszellen zur Visualisierung in der Transmissionselektronenmikroskopie vorzuschlagen. Diese Technik ist einfach zu bedienen, kostengünstig und bietet eine hervorragende Erhaltung der Zellstruktur. Hierbei handelt es sich um eine Kultur von Suspensionszellen.Zunächst werden die Zellen durch verschiedene Zentrifugen geerntet, um ein Pellet in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu erhalten. In einem zweiten Schritt wird die Probe durch Tauchfrosten schnell eingefroren, wodurch die Zellen immobilisiert und die Bildung von Eiskristallen begrenzt wird. Als nächstes wird eine Gefriersubstitution durchgeführt, um Wasser durch Lösungsmittel zu ersetzen, das Osmiumtetroxid als Fixiermittel enthält, um die Zellstrukturen zu stabilisieren.Die Ergebnisse zeigen, dass das Einfrieren und die Gefriersubstitution die Infrastruktur der Zellen perfekt erhalten. Die chemische Fixierung war eine primäre Methode zur Fixierung von Gewebe oder Zellen für die Transmissionselektronenmikroskopie, aber bei dieser Methode werden in der Regel Artefakte und die Extraktion von zellulärem Inhalt beobach

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Forschung

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Biology

Biologie

Wir zeigen hier, wie Elektronen cryotomography (ECT) zu verwenden, um auf die Ultrastruktur von Bakterienzellen in nahezu native Staaten zu studieren, "makromolekularen" (~ 4 nm) Auflösung.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Grundlegende Techniken und Ausgestaltungen der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben und Nanomaterialien für die Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. Diese Technik ist eine bevorzugte Methode für die Entdeckung ultrastrukturelle Merkmale und Spezialisierungen von biologischen Membranen und für den Erhalt von ultrastruktureller Ebene dimensionale und räumliche Daten in den Materialwissenschaften und der Nanotechnologie-Produkte.

Technische Grundlagen Elemente der Gefrierbruch-/ Gefrier Etch in Biological Elektronenmikroskopie

Es ist eine Herausforderung, qualitativ hochwertige Transmissionselektronenmikroskopie-Bilder zu erhalten, insbesondere im Fall von Pflanzenzellen, die reichlich große wassergefüllte Vakuolen und belüftete Räume haben. Das Tandem-Hochdruckgefrieren und die Schnellgefriersubstitution verkürzen die Vorbereitungszeit von Pflanzenproben für die TEM erheblich und erzeugen gleichzeitig Proben mit hervorragender ultrastruktureller Konservierung.

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Wir entwickeln eine neue Technik in der Elektronenmikroskopie, „flash-and-freeze“, die die Visualisierung von Membrandynamik mit ms zeitlicher Auflösung ermöglicht. Diese Technik kombiniert die optogenetische Stimulation von Neuronen, die mit Hochdruck-Einfrieren. Hier haben wir die Verfahren zeigen, und die Protokolle im Detail beschreiben.

Flash-and-Freeze-: eine neuartige Technik Membrandynamik mit Elektronenmikroskopie zu erfassen

Hier wird ein Protokoll zur Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und zum Einfrieren vor der Röntgenfluoreszenz-Bildgebung mit einer synchromtronen kryogenen Röntgensonde vorgestellt. Wenn nur raumtemperaturnano-analyse zur Verfügung gestellt wird, können die gefrorenen Proben weiter gefriergetrocknet werden. Dies sind wichtige Schritte, um Informationen über die intrazelluläre elementare Zusammensetzung zu erhalten.

Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Hier zeigen wir, wie man das Sandwich-Gefriergerät zum schnellen Einfrieren von biologischen Proben verwendet, einschließlich Bakterien, Hefen, kultivierten Zellen, isolierten Zellen, tierischem und menschlichem Gewebe und Viren. Wir zeigen auch, wie man Proben für ultradünne Schnitte nach schnellem Einfrieren vorbereitet.

Schnelles Einfrieren mit Sandwich-Gefriergerät zur guten ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben in der Elektronenmikroskopie

Dieses Manuskript skizziert die Blot-and-Plunge-Methode zum manuellen Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Elektronenmikroskopie mit einem Partikel.

Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie

Hier stellen wir eine Pipeline für das 3D-korrelative fokussierte Ionenstrahlfräsen vor, um die Präparation zellulärer Proben für die Kryo-Elektronentomographie zu steuern. Die 3D-Position von fluoreszenzmarkierten Proteinen von Interesse wird zunächst durch Kryo-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und dann gezielt gemahlen. Das Protokoll eignet sich für Säugetier-, Hefe- und Bakterienzellen.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Dieses Videoprotokoll veranschaulicht die Durchführung einer Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie von virologischen Proben. Für optimale Ergebnisse werden die Proben durch Hochdruckgefrieren und anschließende Gefriersubstitution vorbereitet.

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

Lernen Sie eine kostengünstige Kryofixierungsmethode für Suspensionszellen zur Untersuchung von Zellultrastrukturen und Immunlokalisierung in der Transmissionselektronenmikroskopie.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

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