Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Chemilumineszenz zur Quantifizierung von Salpeteroxid in biologischen Proben zu verwenden, indem der Gehalt an Nitrit und Nitrat unter Verwendung von Triiodid- und Vanadiumchlorid-Reduktionslösungen quantifiziert wird. Dieses Protokoll bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Verfolgung des Salpeteroxidstoffwechsels und der Signalübertragung, sowohl regional als auch longitudinal aus einer Vielzahl biologischer Proben. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit und hohe Empfindlichkeit.

Katelyn Cassel, unsere IRTA-Stipendiatin, wird dieses Verfahren demonstrieren. Sie wird uns zeigen, wie man Nitrit durch Chemilumineszenz in Verbindung mit Triiodidlösung messen kann. Stellen Sie zunächst eine Nitrit-Konservierungslösung her.

Bereiten Sie eine Lösung her, die ein 118 Millimolar NEM und 890 Millimolar Kalium-Ferrocyanid in destilliertem Wasser enthält. Löse die Feststoffe auf, bis die Lösung klar, gelb und ohne Kristalle ist. Geben Sie dann diese Lösung in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 9 zu 1 zu NP 40.

Mischen Sie die Lösung vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden. Wirbeln Sie diese Mischung niemals ein. Die Nitrit-Konservierungslösung kann bei 4 Grad Celsius etwa eine Woche lang verwendet werden.

Das Protokoll kann auf viele frisch gewonnene biologische Proben angewendet werden. In diesem Fall wurde frisch entnommenes Blut zentrifugiert, um eine Plasmaprobe für die Untersuchung zu erhalten. Es ist sehr wichtig, Blut oder biologische Proben, die eine große Menge an Häm-Proteinen enthalten, wie Hämoglobin oder Myoglobin, so schnell wie möglich zu verarbeiten, da die Häm-Proteine mit dem Nitrit reagieren und das Nitrit zerstören.

Um nun den größten Teil des endogenen Blutnitrits zu erhalten, mischen Sie das Plasma sofort mit einer nitritkonservierenden Lösung in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 1 bis 4. In jeder Phase dieser Vorbereitung kann die Probe auf Trockeneis eingefroren werden. Um die Probe zu deproteinieren, mischen Sie sie mit einem gleichen Teil kaltem Methanol.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 13000 g für 15 Minuten bei 4 Grad Celsius, um Proteine auszufällen. Nehmen Sie den Überstand und verwenden Sie ihn für die Nitritmessung. Für die empfindliche Messung von Nitrit wird eine Triiodid-Reduktionslösung als am wirksamsten angesehen.

Achten Sie bei der Zubereitung darauf, dass sich alle Kristalle auflösen. Bewahren Sie die Lösung in einer dunklen Flasche auf und verwenden Sie sie innerhalb einer Woche nach der Zubereitung. Eine Vanadiumchlorid-Reduktionslösung bietet die größte Präzision für die Messung von Nitrat.

Eine 1 mikromolare Lösung von Nitrit wird zur Bestimmung der Standardkurve für Nitrit sowie Nitrat verwendet. Richten Sie den Salpeteroxid-Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Öffnen Sie zuerst den Sauerstofftank, schalten Sie das Instrument ein und schließen Sie es an eine Säurefalle an, die ein molares Natriumhydroxid enthält.

Öffnen Sie anschließend den Heliumtank und verbinden Sie dann die Glasreaktionskammer mit dem Heliumtank. Beladen Sie nun die Reaktionskammer mit Triiodidlösung für die Nitritmessung. Antischaummittel hinzufügen.

Stellen Sie den Gasdurchfluss ein, um das Blasen zu verlangsamen. Verbinden Sie dann die Säurefalle mit der Reaktionskammer. Stellen Sie den Heliumfluss durch Versuch und Irrtum richtig ein, um ihn an die Saugleistung des Instruments anzupassen.

Starten Sie nun die auf visueller Programmierung basierende Liquid-Software. Aktivieren Sie zunächst die Kommunikation zwischen dem Gerät und der Erfassungssoftware über das Menü "Daten" und starten Sie dann über das Hauptmenü auf der Vorderseite die Analyse. Warten Sie, bis der Photomultiplier-Kühler unter minus 12 Grad Celsius abgekühlt ist und sich der Photomultiplier stabilisiert hat.

Nach etwa 30 Minuten hat sich die Basislinie auf 1 oder 2 Millivolt stabilisiert. Entscheidend ist die Stabilität des Wertes, nicht der Wert selbst. Nachdem sich der Analysator stabilisiert hat, verwenden Sie eine gut gewaschene Hamilton-Spritze, um Lösungen zu injizieren.

Injizieren Sie zunächst mindestens drei verschiedene Volumina des 1-Mikromolar-Nitrit-Standards. Injizieren Sie die Lösungen durch das Septum in die Reduktionslösung. Injizieren Sie jeden Standard oder jede Probe zweimal.

Wenn hohe Nitritgehalte und Proben zu erwarten sind, sollten Sie die Injektion eines großen vierten Volumens der Standardnitritlösung in Betracht ziehen, um die Steigung der Standardkurve besser bestimmen zu können. Beobachten Sie immer die Ausgabe und warten Sie, bis sich der Analysator wieder auf die Ausgangslinie stabilisiert hat, bevor Sie die nächste Probe injizieren. Dies dauert mindestens eine Minute.

Verwenden Sie Probenvolumina mit einem Spitzenwert von unter 700 Millivolt, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Waschen Sie die Spritze zwischen den Durchläufen gründlich mit entionisiertem Wasser. Es ist sehr wichtig, die Spritze gründlich zu waschen.

Nachdem alle Messungen durchgeführt wurden, drücken Sie die Stoppoption in der Software. Die Daten werden automatisch gespeichert. Durch Drücken von Abbruch wird die Messung beendet, ohne dass die Daten gespeichert werden.

Schließen Sie den Absperrhahn oben auf dem Reaktionsgefäß und trennen Sie die Schläuche, die die Säurefalle und das Reaktionsgefäß verbinden. Versetzen Sie den Analysator nach dem Experiment in den Standby-Modus. Drücken Sie auf dem Hauptfenster auf Analyse und vergewissern Sie sich, dass es in den Standby-Modus wechselt.

Schalten Sie anschließend den zugeführten Sauerstoff aus. Trennen Sie die Schläuche vom O2-Tank zur Säurefalle. Spülen Sie dann die Triiodidlösung mit Helium aus.

Schließen Sie anschließend den Heliumtank und trennen Sie ihn vom Glasreaktionsgefäß. Reinigen Sie das Gefäß abschließend nach Bedarf mit Ethanol und Wasser. Die Untersuchung von Standards und Plasmaproben zeigt, dass die Photomultiplier-Spannung unmittelbar nach ihrer Injektion ansteigt und auf den Ausgangswert zurückkehrt, sobald das gesamte Nitrit reduziert wurde, was bis zu einer Minute dauern kann.

Um das Signal zu quantifizieren, wurde aus den Standards eine Standardkurve konstruiert, wobei die Fläche unter der Spannungssprungspitze verwendet wurde. Unter Verwendung der Standardkurve war die Quantifizierung der Proben zwischen ihren doppelten Injektionen sehr reproduzierbar. Die Chemilumineszenz gilt als Goldstandard für die Bestimmung der Nitritkonzentrationen.

Einmal gemeistert, liegt die Empfindlichkeitsgrenze für Nitrit bei nur zwanzig Millimolaren. Das Wichtigste bei der Arbeit mit Chemilumineszenz ist Präzision. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Methode wirkt sich jeder einzelne Fehler auf das Endergebnis aus.

Nehmen Sie sich also Zeit und beeilen Sie sich nicht. Nachdem diese Technik in den frühen 2000er Jahren entwickelt wurde, ebnete sie den Weg für Forscher, die Stoffwechselwege von Stickstoffmonoxid zu erforschen und zu lernen, dass ein Mangel an Stickstoffmonoxid viele Krankheiten verursacht, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen.