Immunostaining von Biocytin gefüllte und verarbeitete Abschnitte für Marker Neurochemisches

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine effiziente Methode zur Identifizierung von Neuronen vorzustellen, die während elektrophysiologischer Aufzeichnungen mit Biocytin und Immunfärbung gepatcht wurden, um die Morphologie vor der erneuten Färbung mit spezifischen Antikörpern zur Bestimmung der neurochemischen Identität wiederherzustellen. Diese Methode beschreibt also einen wichtigen Schritt, der erforderlich ist, um die Vielfalt in der neuronalen Struktur und Funktion zu untersuchen. Dies ist wichtig, um ihre Rolle in den Netzwerken des Gehirns zu verstehen.

Der Hauptvorteil der Verwendung einer sequentiellen Verarbeitungstechnik besteht darin, dass sie den Datenverlust aufgrund der Unfähigkeit, die Morphologie wiederherzustellen, eliminiert. Dies hilft also auch dabei, die neurochemischen Marker zu leiten, die in diesen Zellen getestet werden sollen. Obwohl diese Methode für die morphologische Rückgewinnung von Zellen in Dickschliffen beschrieben ist, kann sie auch auf Dünnschliffe und auf zuvor gefärbte und eingefasste Proben angewendet werden.

Im Allgemeinen können Neutrale, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, das Soma wieder zu verschließen, während sie sich von der Zelle lösen, und es kann sein, dass sie nicht genügend Zeit für erfolgreiche Füllungen lassen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da für eine effektive Biocytin-Füllung von Zellen spezielle Techniken erforderlich sind, um die vollständige Morphologie wiederherzustellen. Um dieses Verfahren zu starten, wenden Sie in der Spannungsklemmenkonfiguration kleine kurze Spannungsschritte an, indem Sie die Membrantestfunktion im Badmodus verwenden, während Sie sich der Zelle nähern.

Pflastern Sie die Zelle durch Saugen auf. Halten Sie dann die Zelle bei minus 70 Millivolt. Beachten Sie die Entwicklung einer Gigaohm-Dichtung

Kompensieren Sie kapazitive Transienten und saugen Sie dann kontrolliert mit einer Spritze oder durch den Mund an, um eine Ganzzellenkonfiguration zu erreichen. Schätzen Sie die Gesamtzellkapazität und den Serienwiderstand und stoppen Sie die Membrantestimpulse. Optimal ist ein Serienwiderstand von weniger als 10 Megaohm.

Dadurch wird die Etablierung von Bedingungen für die Aufzeichnung ganzer Zellen sichergestellt, um eine Biocytin-Füllung zu ermöglichen. Stellen Sie nach Abschluss der physiologischen Aufzeichnungen die Konfiguration der Patch-Klemme wieder her, indem Sie die Aufzeichnungspipette langsam in kleinen Schritten bewegen, abwechselnd nach oben und außen im Spannungsklemmenmodus. Der wichtigste Schritt bei der morphologischen Wiederherstellung der Zellen besteht darin, die Wiederversiegelung des neuronalen Somas sicherzustellen, während die Aufzeichnungspipette von der Zelle gelöst wird.

Visualisieren Sie mit der Membrantestfunktion den Verlust kapazitiver Transienten und den Kollaps der Stromreaktionen auf eine gerade Linie, die auf die Wiederversiegelung der Zelle und die Etablierung eines Outside-Out-Patches an der Pipettenspitze hinweist. In der Zwischenzeit erleichtert das Halten der Zelle auf einem depolarisierten Potential den Wiederverschließungsprozess. Nachdem Sie die Pipette von der Zelle gelöst haben, halten Sie die Scheibe drei bis fünf Minuten lang in der Aufnahmekammer, um sicherzustellen, dass der Farbstoff zu den distalen dendritischen und axonalen Prozessen transportiert wird.

Übertragen Sie dann die Scheibe zur Fixierung auf eine 24-Well-Platte mit 4 % PFA. 24 bis 48 Stunden nach der PFA-Fixierung übertragen Sie alle fixierten Scheiben zur Lagerung vor der Immunfärbung auf das molare PBS mit null Komma eins. Waschen Sie bei diesem Verfahren das Gewebe dreimal für jeweils 10 Minuten in Nullpunkt eins molaren PBS.

Blockieren Sie anschließend das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 10 Prozent blockierendem Serum. Anschließend werden die Abschnitte in den primären Antikörpern CB1R über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um die Expression des Cannabinoidrezeptors Typ 1 zu identifizieren. Waschen Sie dann die Gehirnabschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 molaren PBS.

Streptavidin und der Sekundärantikörper gegen den ersten Primärantikörper werden beide in die Well-Platte gegeben und über Nacht bei vier Grad Celsius aufbewahrt. Anschließend werden die Schnitte in Streptavidinrot-Farbstoffkonjugat über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubiert, um das Biocytin freizulegen. Waschen Sie danach die Hirnabschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 molaren PBS.

Um die Blütenpracht zu schützen und das Nachfärben in Zukunft zu erleichtern, montieren Sie die Abschnitte auf einem Eindeckmedium mit gleichmäßigem Abstand. Versiegeln Sie die Ränder der Deckgläser mit klarem Nagellack. In diesem Schritt entfernst du den Nagellack mit einem Wattestäbchen Aceton vom Objektträger.

Entfernen Sie den Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze und geben Sie einige Tröpfchen 0,1 molaren PBS auf die Abschnitte. Es ist wichtig, das Prozessgewebe nicht zu beschädigen, während das Gewebe vom wässrigen Einbettmedium gelöst wird. Entfernen Sie die Schnitte vorsichtig mit einem feinen Pinsel von der Folie und waschen Sie sie 24 bis 48 Stunden lang in 0,1 molaren PBS auf einem Shaker und halten Sie sie bei vier Grad Celsius lichtgeschützt.

Um eine vollständige Entfernung des Eindeckmediums zu gewährleisten, waschen Sie die Abschnitte am Folgetag ein- bis zweimal in 0,1 molaren PBS für jeweils 10 Minuten. Inkubieren Sie dann die Schnitte einen Tag lang mit einem zweiten primären Antikörper Cholecystokinin. Waschen Sie die Hirnabschnitte dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 molaren PBS.

Anschließend färben Sie die Schnitte mit einem Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper Ziegen-Anti-Maus. Es muss sichergestellt werden, dass sich die Anregungsemissionsspektren des Sekundärantikörpers nicht mit Streptavidin und früheren Immunfluoreszenzfärbungen überlappen. Anschließend montieren Sie die Abschnitte in wässrigem Einbettmedium.

Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. Nach erfolgreicher Biocytin-Füllung und dem ersten Immunfärbeprozess kann die neuronale Struktur visualisiert und abgebildet werden, wie auf dem konfokalen Bild bei 60-facher Vergrößerung zu sehen ist. Der Schnitt wurde auch für CB1R zusammen mit Biocytin immungefärbt, und die CB1R-Immunfärbung im Biocytin exprimierenden neuronalen Soma ist durch die Pfeilspitze angedeutet.

Derselbe Abschnitt wurde nach einer Woche auf CCK-Immunreaktivität untersucht, und das Bild zeigt eine erfolgreiche Wiederherstellung der CCK-Immunmarkierung in mehreren Neuronen, die durch das Sternchen gekennzeichnet sind. Es ist zu beachten, dass die mit Biocytin markierte Zelle, die durch die Pfeilspitze angezeigt wird, kein CCK exprimierte. Ein zusammengeführtes Bild der Felder A, B und C zeigt, dass alle drei Markierungen robust visualisiert sind und die Überlagerung zwischen Biocytin und CB1R offensichtlich ist.

Das Bild zeigt, dass der zweite Immunfärbeprozess das Signal des vorherigen Färbeprozesses nicht beeinträchtigt. Die Morphologie der mit Biocytin gefüllten Zelle wurde aus den konfokalen Bildern vor dieser CCK-Immunfärbung gewonnen. Entscheidend ist, dass neben dem Soma und dem Dendriten auch Axone sichtbar gemacht werden können und die Co-Markierung von CB1R- und Biocytin-markierten axonalen Prozessen beobachtet wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, gesunde Zellen unter der Schnittoberfläche ins Visier zu nehmen, um Neuronen mit durchtrennten Prozessen zu vermeiden. Und das könnte die Wiederherstellung der Morphologie beeinträchtigen. Nach der Beherrschung kann die morphologische Wiederherstellung von mit Biocytin gefüllten Zellen während der Patch-Clamp-Aufzeichnung zuverlässig durchgeführt werden.

Die erfolgreiche Implementierung der seriellen Immunfärbetechnik wird die Effizienz der Datenwiederherstellung verbessern und die neuronale Charakterisierung bei Standard-Patch-Clamp-Aufzeichnungen erleichtern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit Biocytin gefüllte Zellen effektiv nutzen können, um die neuronale Morphologie wiederherzustellen und neurochemische Marker zu bestimmen.