Name: Die Messung der Partikelgrößenverteilung in trüber Lösungen durch Dynamic Light Scattering Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Lernen Sie die dynamische Lichtstreuungsmikroskopie zur Partikelgrößenanalyse in trüben Lösungen ohne Verdünnung. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen konzentrierter Proben bei variierenden Temperaturen.

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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (Nr. 25248027 an M.S.).

1. Probenvorbereitung <ol><li> Reinigung von temperaturempfindlichen Monomeren <ol><li> Man löst 20 g N Isopropylacrylamid (NIPA) in 100 ml Toluol. </li><li> Filtern Sie die Lösung unter Staubabsaugung zu beseitigen. </li><li> Mischen Sie das Filtrat mit 500 ml Petrolether. </li><li> Legen Sie das Reaktionsgefäß in einem Eis-Wasser-Bad. </li><li> Rühren Sie die Lösung bis die Monomere gefällt werden (in der Regel 30 min). </li><li> Filtern Sie die Lösung unter Absaugen der ausgefällten Monomere zu erhalten. </li><li> Trocknen Sie die Monomere unter vermindertem Druck (100 Pa) über Nacht. </li></ol></li><li> Vorbereitung des temperaturempfindlichen Polymerlösung <ol><li> Entgasen 20 ml deionisiertem Wasser für 1,0 min eine Membranpumpe verwendet wird. </li><li> Man löst 780,8 mg des gereinigten NIPA in 9,5 ml entgastem und entionisiertem Wasser. </li><li> Legen Sie das Reaktionsgefäß in einem Eis-Wasser-Bad. </li><li> Schirmen Sie die Reaktion vonLicht, das durch die Vorrichtung mit Aluminiumfolie abdecken. </li><li> Rühren Sie die Lösung vorsichtig für 10 min, während eine moderate Fluss von Ar-Gas sanft über einer Pipettenspitze mit einem Rohr an der Gasflasche angebracht einzuführen. </li><li> Hinzufügen 11,9 ul N, N, N ', N' N' - Tetramethylethylendiamin zu der Lösung über eine Mikropipette. </li><li> Rühren Sie die Lösung für 1,0 min unter Einleiten von Ar-Gas, wie es in Schritt 1.2.5 erwähnt. </li><li> Während die Probe gerührt wurde, in 0,5 ml entgastem und entionisiertem Wasser 4,0 mg Ammoniumpersulfat aufzulösen. </li><li> Mischen Sie die Probenlösung (aus Schritt 1.2.7) und Ammoniumpersulfatlösung (aus Schritt 1.2.8). </li><li> Rühren Sie die Lösung für 30 s, während Ar-Gas-Einführung, wie es in Schritt 1.2.5 erwähnt. </li><li> Decken Sie die Lösung mit Aluminiumfolie und halten es in einem Kühlschrank (4 ° C) über Nacht. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Probe Halterungen <ol><li> Platzieren 60 &amp; mgr; l der Probenlösung (vonSchritt 1.2.11) in einem Hohlraum Folie. </li><li> Decken Sie die Lösung mit einem kreisförmigen Deckglas. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu stoppen. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Lösung mit einer Mikro und Labortücher verwenden. </li><li> Verschließen Sie die Probe mit Klebstoff. Lassen Sie den Kleber trocken bei Raumtemperatur (typischerweise 6 h). </li><li> Bereiten Sie eine andere Folie mit 0,1 Gew% Polystyrol-Latex gefüllt (100-nm Partikeldurchmesser) Suspension durch folgende Schritte an 1.3.1-1.3.4. Diese Folie wird als Standard verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Die Partikelgrößenmessung mit einem Dynamic Light Scattering Mikroskop <ol><li> Optimierung des Instruments <ol><li> Legen Sie die Polystyrol-Latex-Suspension Schieber (aus Schritt 1.3.5) auf der Bühne des inversen Mikroskops. Das Deckglas Seite sollte nach unten zeigen. </li><li> Platzieren Sie einen Strahl Dämpfer vor dem Detektor (eine Lawinenphotodiode und einen Autokorrelator). </li><li> Tragen Sie einen Laserstrahl (Festkörperlaser, λ = 488 nm, 30 mW, kontinuierlichewave) zu der Probe durch eine Objektivlinse (10 ×). Ein Teil des reflektierten Lichts geht durch einen Startspiegel des Mikroskops und wird durch eine CCD - Kamera angebracht an der Seitenöffnung des Mikroskops (1) beobachtet. </li><li> Stellen Sie die Höhe der Objektivlinse, um den Brennpunkt in der Probensuspension zu setzen, indem die Höhe der Objektivlinse von der niedrigen bis hohen Position verschieben. Während dieses Vorgangs wird das reflektierte Bild dreimal konzentriert: an der Oberfläche des Deckglases an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas und der Probe, und an der Grenzfläche zwischen der Probe und dem Lochglasobjektträger. Stellen Sie den Brennpunkt zwischen dem zweiten und dem dritten Punkt. </li><li> Dämpft die Streulichtintensität von der Laserleistung ändert. </li><li> Einzuführen, um die Streulicht in den Detektor durch den Strahldämpfer vor dem Detektor zu entfernen. Dieses Gerät misst die zeitliche Korrelation der Lichtintensität. </li><li> Legen Sie ein Pinhole (φ = 50 &amp; mgr; m) between das Mikroskop und der Detektor die konfokale Wirkung zu erzielen. Stellen Sie die Position des Pinholes, die Lichtintensität am Detektor zu maximieren. </li><li> Messen der Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität für 30 s durch den Betrieb des Korrelators über einen Computer zu initiieren. Die gemessene Korrelationsfunktion wird oft als g (2) (t) ausgedrückt - 1, wobei t die Korrelationszeit 4 und <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq1.jpg"> . Hier I (t) ist die Streulichtintensität zur Zeit t und (•••) T ist Zeitmittelung. Die Abklingzeit wird etwa 0,1 ms betragen. </li><li> Stellen Sie den Brennpunkt ein breites Spektrum für die anfängliche Amplitude der Zeitkorrelationsfunktion zu erhalten (g (2) (t = 0) - 1). HINWEIS: Die anfängliche Amplitude stark von der Menge des reflektierten Lichts beeinflusst wird. Durch den Brennpunkt Schlepptau bewegenard die Schnittstelle zwischen dem Deckglas und der Probe, die Menge des reflektierten Lichts zunimmt. Für starke Licht streuenden Teilchen, wie Polystyrollatex, kann die Anfangsamplitude von 0 bis 1 verändert werden, jedoch ist es schwierig, die Anfangsamplitude nahe 1 für üblichere Polymerlösungen zu setzen, weil die Intensität des reflektierten Lichts wesentlich höher ist als die des gestreuten Lichts. </li><li> Tragen Sie die inverse Laplace - Transformation (mit dem eingeschränkten Regularisierungsprogramm CONTIN 13,14) auf die Funktion erhalten zeitliche Korrelation der Größenverteilungsfunktion zu erwerben. In Fällen, in denen die anfängliche Amplitude auf weniger als 0,2 eingestellt ist, zeigt die Verteilungsfunktion des hydrodynamischen Radius eine scharfe Spitze um 100 nm, die zweimal der tatsächliche Radius ist (siehe die Diskussion für weitere Details). </li></ol></li><li> Probenmessung <ol><li> Stellen Sie die Stufe Temperatur auf 25 ° C. </li><li> Legen Sie eine Folie, hergestellt mit Poly-NIPA (PNIPA) solution (Schritt 1.3.4) auf dem Tisch des Mikroskops. </li><li> Messen Sie die Zeitkorrelationsfunktion der Intensität des gestreuten Lichts durch folgende Schritte an 2.1.4-2.1.8. Wenn die anfängliche Amplitude größer als 0,2 ist, stellen Sie den Brennpunkt der anfänglichen Amplitude der Zeitkorrelationsfunktion zu machen weniger als 0,2 für Schritt 2.1.9 folgen. Eine kleine Anfangsamplitude vereinfacht die Analyse. </li><li> Stellen Sie die Stufe Temperatur auf 35 ° C und warten, bis die Lösung trüb macht. Die untere kritische Lösungstemperatur (LCST) von PNIPA Lösung beträgt 32 ° C 15. </li><li> Messen Sie die Zeitkorrelationsfunktion durch folgende Schritte 2.1.4-2.1.8. Wenn möglich, justieren die Position des Brennpunkts der Anfangsamplitude der Zeitkorrelationsfunktion weniger als 0,2 zu machen. Für trübe Lösungen, ihre anfänglichen Amplituden neigen, da die Intensität des gestreuten Lichtes zunimmt, während der des reflektierten Lichts konstant bleibt. </li><li> Tragen Sie die inverse Laplace transformatian die Zeitkorrelation erhaltenen Funktionen die Größenverteilungsfunktionen zu erhalten. Beachten Sie, dass die tatsächliche Größe, wobei die Ausgangsamplitude kleiner als 0,2 ist die Hälfte der erhaltene Wert in Fällen. </li></ol></li></ol>

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<li>Hiroi, T., Ata, S., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+of+Aggregation+States+for+Concentrated+Carbon+Nanotube+Dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Transitions of Aggregation States for Concentrated Carbon Nanotube Dispersion.</a> J. Phys. Chem. C. 120, 5776-5782 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die anfängliche Amplitude der Zeitkorrelationsfunktion hängt stark von der Brennpunkt, wie in Abbildung 2 (a) gezeigt. Dies widerspricht scheinbar die Tatsache , dass die Lösung homogen ist ( mit Ausnahme der dünnen Schicht an der Grenzfläche) 8. Diese Variation in der Ausgangsamplitude wird in der Menge des reflektierten Lichts auf eine Veränderung zurückzuführen. Teil heterodyne Theorie 16 sagt voraus , daß die Anfangsamplitude, A, die Streulichtintensität, I s, und die reflektierte Lichtintensität I r, die folgende Gleichung erfüllen 1 <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq2.jpg"> Diese Gleichung zeigt , daß , je größer I r wird, wird die kleinere A. Daher wird eine reduziert , indem die Fokusposition auf die Schnittstelle Schliessstellung. Die scheinbare Diffusionskonstante D A caim Falle von monodispersen Lösungen n durch Anpassung der Funktionszeitkorrelation erhalten werden: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq3.jpg"> woher <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq4.jpg"> . Hierbei ist n der Brechungsindex des Lösungsmittels (Wasser, 1,33), ist θ der Streuwinkel (180 °) und λ die Wellenlänge von Licht (514,5 nm). Da wir Rückstreugeometrie angewendet wird , wird der Wert von q fixiert. Jedoch ist dieser Punkt durch die Verwendung verschiedener Wellenlängen des Lichts gelöst. Bitte beachten Sie, dass jede Art von Dauerstrichlaserquelle vorhanden ist, das DLS Mikroskop zu bauen. Dank der geringen bestrahlten Volumens, der Kohärenzfaktor 17 wird auf mehr als 0,99 sein und ist zu vernachlässigen. Für polydisperse Lösungen wird die Verteilungsfunktion von D A durch die inverse Laplace - Transformation erhalten. Teilüberlagerungs thEory sagt auch voraus , dass D A nicht die gleiche wie die tatsächliche Diffusionskonstante D ist. Diese beiden Diffusionskonstanten die folgende Gleichung erfüllen: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq5.jpg"> Die konstante Diffusion D wird in den hydrodynamischen Radius R h umgewandelt , um die Einstein-Stokes - Gleichung 4. Wenn A = 1, wird diese Beziehung D A = D. In diesem Fall ist das Datenumwandlungsverfahren das gleiche wie das für die gemeinsame dynamische Lichtstreuung. Die rote Linie in Figur 2 (b) gezeigt , entspricht diesem Fall. Im Gegensatz dazu wird diese Beziehung D A = 0,5 D an der Grenze der A → 0. Daher wird die Größe geschätzt doppelt so groß wie die tatsächliche Größe zu sein , wenn A klein ist (praktisch weniger als 0,2), wie durch die gezeigte blaue Linie von 2 (b) eine signifikant klein ist, kann die horizontale Achse verschoben werden, wie in 2 (c) gezeigt. Im Prinzip können wir D A in D für jeden Wert von A zu konvertieren. In der Praxis ist es jedoch besser , die Anfangsamplitude kleiner als 0,2 eingestellt, da die einfache Näherung D A ~ 0,5 D gilt. Die herausragenden Merkmale der dynamischen Lichtstreuung Technik Mikroskop wurden unter Verwendung einer PNIPA Lösung unter Beweis gestellt. Die Konformation von PNIPA unterhalb und oberhalb der LCST wurde 15,18 Neutronenkleinwinkel mit intensiv untersucht Streuung. Im Gegensatz dazu dynamischer Lichtstreuung wurde für die Analyse von PNIPA oberhalb der LCST verwendet wegen seiner Trübung 19 nicht. Dieses Problem wird durch das dynamische Lichtstreuungsmikroskop gelöst, wie in den 3 (a) und (b) gezeigt. Die Größe dieser Aggregate ist mehrere &amp;# 181; m, die durch entweder Kleinwinkelröntgen / Neutronenstreuung oder herkömmlichen Lichtstreuungsverfahren nicht erhalten werden kann. Zeitaufgelöste Messungen mit diesem System geben Informationen über den Aggregationsprozess während der Temperaturänderung. Der Nachteil der dynamischen Streuung Mikroskoplicht wird auch in Figur 3 veranschaulicht. Für das Ergebnis unterhalb der LCST wird die Zeitkorrelationsfunktion durch die sehr kleine Menge an Staub vorhanden ist (die schwarzen Linien in 3) stark beeinflusst. Beispielsweise zerfallen die Zeitkorrelationsfunktion nicht vollständig, auch bei Korrelationszeiten in der Größenordnung von 1,0 s. Dies ist, weil das Volumen mit dieser Vorrichtung bestrahlt (ungefähr 1,0 &amp; mgr; m) deutlich kleiner als die bestrahlt mit der üblichen dynamischen Lichtstreuungsvorrichtung (ca. 100 um). In Fällen, in denen die Intensität des gestreuten Lichtes zu schwach ist, wird das Signal durch das Rauschen verdeckt, wie die durch s verursachtMall Mengen an Staub in der Lösung. Daher sind die drei Spitzen in Abbildung 3 (b) gezeigt haben , kann nicht quantitative Bedeutung , obwohl die allgemeine Ordnung der Größe von Bedeutung ist. Man beachte, dass solch eine schwache Streuer kann durch ein herkömmliches dynamisches Lichtstreuungsvorrichtung gemessen werden. Wir haben gezeigt, dass die dynamische Lichtstreuung Mikroskop ermöglicht es uns, sowohl transparente als auch trübe Proben mit dem gleichen Setup zu messen. Da die optische Weglänge in den Proben kurz ist, kann diese Technik zu stark lichtabsorbierenden Proben angewendet werden, wie beispielsweise Kohlenstoff - Nanoröhrchen - Suspensionen 20. Darüber hinaus aufgrund der hohen räumlichen Auflösung kann diese Technik auf biologische Zellen aufgebracht werden. Für ihre Anwendung in der Biologie kann dieses Verfahren auch mit anderen bildgebenden Verfahren, wie Fluoreszenz und Raman-Bildgebung kombiniert werden. So glauben wir, dass die dynamische Lichtstreuung Mikroskop ein leistungsfähiges Werkzeug für ein breites Spektrum von Forschungsfeldern ist.

Die Partikelgröße ist eine der grundlegendsten Eigenschaften von kolloidalen und polymeren Lösungen. Zur Messung der Partikelgröße kommen zahlreiche Techniken zum Einsatz. Partikelgrößen von 1,0 μm oder größer können direkt mit einem optischen Mikroskop gemessen werden. Für kleinere Partikel werden alternative Techniken wie Laserbeugung, Elektronenmikroskopie oder Rasterkraftmikroskopie eingesetzt2,3. Die dynamische Lichtstreuung ist eine häufig verwendete Technik zur Messung von Partikelgrößenverteilungen in Lösungen4. Die mit dieser Technik erzielten Ergebnisse ergeben sich nicht aus Bildern der Teilchen, sondern aus der charakteristischen Zeit der Fluktuationen der Streulichtintensität. Diese Fluktuationen stammen aus der Brownschen Bewegung, die durch eine Diffusionskonstante gekennzeichnet ist. Die Größenverteilung ergibt sich aus der Verteilung der Diffusionskonstanten unter Verwendung der Einstein-Stokes-Gleichung. Aufgrund ihrer Einfachheit wird die dynamische Lichtstreuung häufig für die routinemäßige Bewertung von Lösungen wie Farben und Lebensmittelkolloiden eingesetzt.
Für die meisten Techniken, die zur Messung der Partikelgröße von Lösungsproben verwendet werden, ist eine Vorbehandlung erforderlich. Bei der Elektronenmikroskopie und der Rasterkraftmikroskopie muss die Probe unter Vakuumbedingungen analysiert werden. Daher ist es schwierig, die Proben in ihrer nativen Form zu beobachten. Darüber hinaus können bei der Laserbeugung und der dynamischen Lichtstreuung nur verdünnte Proben gemessen werden, die frei von Mehrfachstreuung und Lichtabsorption sind. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, wurden mehrere neue Techniken für die Messung der dynamischen Lichtstreuung aus unverdünnten, konzentrierten Lösungen vorgeschlagen, wie z. B. die Kreuzkorrelationsspektroskopie5,6, die dynamische Lichtstreuung mit niedriger Kohärenz7,8, die Diffusionswellenspektroskopie9,10 und die dynamische Differentialmikroskopie11,12.
Wir haben eine neue Vorrichtung entwickelt, die als dynamisches Lichtstreumikroskop1 bezeichnet wird. Dieses Gerät ermöglicht es uns, trübe Proben ohne Verdünnung mit Hilfe eines konfokalen optischen Systems zu messen, bei dem die Mehrfachstreuung durch eine Lochblende eliminiert wird. Allerdings sind das Messverfahren und die Datenanalyse etwas komplizierter als bei kommerziell erhältlichen Geräten. In diesem Video wird das Messverfahren und die Datenanalyse am Beispiel der Analyse des temperaturempfindlichen Polymers Poly(N-isopropylacrylamid) im Detail erläutert.

<table><tbody><tr><td>N-Isopropylacrylamid, 98%</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>I0401</td><td></td></tr><tr><td>Toluol, 99%</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>201-01876</td><td></td></tr><tr><td>Petrolether, Destillationstemperatur 30 ~ 60 &Grad; C</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-22565</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin, 99%</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat, 98%</td><td>Sigma</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Latexsuspension, 1 Gew.%</td><td>Duke Scientific Corporation</td><td>3500A</td><td></td></tr><tr><td>Argon</td><td>Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.</td><td></td><td>Reinheit > 99.999 Vol.%Hohlraum</td></tr> <tr><td></td><td>Objektträger Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>83-0336</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon Instech Co., Ltd.</td><td>ECLIPSE Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate</td><td>Tokai Hit CO.,Ltd</td><td>TP-108R-C</td><td></td></tr><tr><td>Festkörperlaser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 488LX</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche Photodiode</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode</td><td></td></tr><tr><td>Korrelator</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-5000/EPP</td><td></td></tr></tbody></table>

die messung der partikelgrößenverteilung in trüber lösungen durch dynamic light scattering mikroskopie

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Es wird ein Protokoll zur Messung der Polydispersität von konzentrierten Polymerlösungen mittels dynamischer Lichtstreuung beschrieben. Die dynamische Lichtstreuung ist eine Technik, mit der die Größenverteilung von Polymerlösungen oder kolloidalen Partikeln gemessen wird. Obwohl diese Technik häufig für die Beurteilung von Polymerlösungen verwendet wird, ist es aufgrund des Mehrfachstreueffekts oder der starken Lichtabsorption schwierig, die Partikelgröße in konzentrierten Lösungen zu messen. Daher sollten die konzentrierten Lösungen vor der Messung verdünnt werden. Die Implementierung der konfokalen optischen Komponente in ein dynamisches Lichtstreumikroskop1 hilft, diese Barriere zu überwinden. Mit einem solchen mikroskopischen System können sowohl transparente als auch trübe Systeme unter dem gleichen Versuchsaufbau ohne Verdünnung analysiert werden. Als repräsentatives Beispiel wurde eine Größenverteilungsmessung einer temperaturempfindlichen Polymerlösung durchgeführt. Die Größen der Polymerketten in einer wässrigen Lösung betrugen mehrere Dutzend Nanometer bei einer Temperatur unterhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST). Im Gegensatz dazu stiegen die Größen auf mehr als 1,0 μm an, wenn sie über dem LCST lagen. Dieses Ergebnis stimmt mit der Beobachtung überein, dass die Lösung über dem LCST trüb wurde.

Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität für eine Polystyrol - Latexsuspension (Partikelradius: 50 nm) wurden bei verschiedenen Brennpunkten gemessen, wie in 2 (a) gezeigt. Diese Korrelationsfunktionen wurden in die Verteilungs umgewandelt Funktionen des hydrodynamischen Radius durch die inverse Laplace - Transformation (siehe Figur 2 (b) und (c)). Nach dem gleichen Verfahren werden die Zeitkorrelationsfunktionen und Verteilungsfunktionen des hydrodynamischen Radius der PNIPA Lösung wurden bei 25 ° C und 35 ° C erhalten wurden. Figuren 3 (a) und (b) zeigen die Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität und die entsprechenden Funktionen Verteilungs Größe der PNIPA Lösung unterhalb (25 ° C) und höher (35 ° C) der LCST. Die Größenverteilungsfunktionen wurden durch die inverse Laplace-Transformation durch die gefolgt erhaltenKorrektur des Teil heterodyne. Die durchschnittliche hydrodynamischen Radius unterhalb der LCST ist mehrere zehn Nanometer, die für die Polymerlösungen typisch ist. Im Gegensatz dazu ist der hydrodynamische Radius oberhalb der LCST etwa 1,0 &amp; mgr; m. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der Tatsache, dass die Lösung über die LCST trüb wird. Die roten und blauen Linien in Abbildung 3 für die Größenverteilung der PNIPA Lösungen erhalten sofort nach und 20 Minuten nach der Lösung wurde trübe sind. Figur 3 (b) zeigt deutlich das Wachstum der Aggregation. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig1.jpg"> Abbildung 1. Schema der dynamischen Lichtstreuung Mikroskop. Pinhole (PH), Strahlteiler (BS), einen Polarisator (Pol) und Avalanche-Photodiode (APD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">um</a>eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig2.jpg"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für einen Polystyrol - Latex - Suspension. (A) Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität für die Polystyrol - Latex - Suspension. Der Nennradius beträgt 50 nm und die Konzentration von 0,1 Gew%. Zwei Datensätze wurden aus verschiedenen Streupunkte erhalten. (B), (c) entsprechende Größe Verteilungsfunktionen für die Polystyrol - Latex - Suspension , erhalten durch die inverse Laplace - Transformation von (a). Die rote Linie entspricht der Zeitkorrelationsfunktion, dessen Anfangsamplitude beträgt etwa 1,0, und die blaue Linie entspricht, die mit einer Anfangsamplitude, die etwa 0,2 ist. Die horizontale Achse berechnet wurde ohne (b) und (c) unter Berücksichtigung der Wirkung des partiellen Überlagerung (PHD), wenn A &lt;&lt; ; 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig3.jpg"> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für eine PNIPA Lösung. (A) Zeitkorrelationsfunktionen von Streulichtintensität für die PNIPA Lösung. (B) Entsprechende Größenverteilungsfunktionen für die PNIPA Lösung durch die inverse Laplace - Transformation von (a) erhalten. Die horizontale Achse wurde berechnet, um die Wirkung von Teillagerung für jeden Datensatz unter Berücksichtigung. Die schwarze Linie stellt die bei 25 ° C erhaltenen Daten. Die rote Linie gibt die erhaltenen Daten nur nachdem die Lösung trübe gedreht (35 ° C). Die blaue Linie stellt die erhaltenen Daten nach einer 20-minütigen Messung der roten Linie./54885/54885fig3large.jpg "Target =" _ blank "&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ein Protokoll für die direkte Messung der Partikelgrößenverteilung in konzentrierten Lösungen dynamische Lichtstreuung Mikroskopie dargestellt.

Die Messung der Partikelgrößenverteilung in trüber Lösungen durch Dynamic Light Scattering Mikroskopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, zu zeigen, dass dynamische Lichtstreuung und konfokale Mikroskopie verwendet werden können, um die Partikelgrößenverteilung in trüben Lösungen ohne Verdünnung zu messen. Dies ist der Aufbau für das dynamische Lichtstreumikroskop. Er verfügt über einen Festkörperlaser, der einen Dauerstrichbetrieb von 30 Milliwatt bei 488 Nanometern ermöglicht.Es gibt auch eine Avalanche-Fotodiode, einen Autokorrelator, der für Messungen an einen Computer angeschlossen ist. Das inverse Mikroskop im Aufbau verfügt über einen Tisch mit einem Temperaturregler. Die Box enthält die restlichen optischen Elemente, die für das Experiment benötigt werden.Dieser Schaltplan bietet eine vollständigere Ansicht des Layouts für die Einrichtung. Nach der Formung des Strahlprofils wird der Strahl in das Mikroskop eingeführt. Die Lichtstreuung wird mit einer Rückstreugeometrie erhalten und zu einem Detektor geführt.Ein Launch-Spiegel ermöglicht die Beobachtung eines Teils des reflektierten Lichts über eine CCD-Kamera. Die Proben für das Experiment müssen einen Tag vorher vorbereitet werden. Für die Probenvorbereitung werden 20 Milliliter entgastes, deionisiertes Wasser sowie gereinigtes NIPA benötigt.Darüber hinaus werden geringe Mengen an TMEDA und Ammoniumpersulfat benötigt. Bei den Vorbereitungsschritten kommen außerdem ein Eiswasserbad auf einem Rührer, zwei Reaktionsgefäße, Aluminiumfolie und eine Quelle für den Argongasfluss zum Einsatz. Beginnen Sie mit dem Abmessen von 9,5 Millilitern entgastem und entionisiertem Wasser in ein Reaktionsgefäß.Gib den NIPA in das Wasser. Schieben Sie dann das Reaktionsgefäß in das Eiswasserbad auf dem Rührwerk und setzen Sie den Rührstab ein. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um das Bad und das Gefäß abzudecken, um die Reaktion vor Licht zu schützen.Verwenden Sie eine Pipettenspitze, die mit der Argonquelle verbunden ist, um einen mäßigen Argonfluss in die Lösung zu gewährleisten. Schalten Sie den Rührer ein, um die Lösung 10 Minuten lang vorsichtig zu rühren. Verwenden Sie anschließend eine Mikropipette, um 11,9 Mikroliter TMEDA zu messen.Ziehen Sie die Folie kurz zurück, um das TMEDA zur Lösung hinzuzufügen, und rühren Sie dann eine weitere Minute lang unter Argongas weiter. Während die Probe gerührt wird, mit dem zweiten Reaktionsgefäß arbeiten. Geben Sie 4 Milligramm Ammoniumpersulfat in das Gefäß.Fügen Sie dann 0,5 Milliliter entgastes und entionisiertes Wasser hinzu. Wenn sich das Ammoniumpersulfat aufgelöst hat, geben Sie die Lösung in die Probenlösung und rühren Sie 30 Sekunden lang unter Argonfluss weiter. Nehmen Sie nach 30 Sekunden das Reaktionsgefäß aus dem Eisbad und rühren Sie es auf.Decken Sie das Gefäß zur Vorbereitung der Lagerung mit Alufolie ab und stellen Sie die Lösung zur Lagerung bei vier Grad Celsius über Nacht in einen Kühlschrank, bevor Sie sie verwenden. Nachdem Sie die Probenlösung entnommen haben, bereiten Sie sie für die Verwendung mit dem Mikroskop vor. Halten Sie zwei Objektträger, zwei kreisförmige Glasabdeckungen und den entsprechenden Kleber bereit, um ein Muster und einen Standard-Referenzobjektträger herzustellen.Messen Sie für den Probenobjektträger 60 Mikroliter der Probenlösung ab. Geben Sie die Lösung in einen der Objektträger. Decken Sie die Lösung mit einer kreisförmigen Abdeckung ab und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden.Entfernen Sie überschüssige Lösung mit einer Mikropipette und Labortüchern. Tragen Sie dann Klebstoff auf den Umfang der Abdeckung auf, um den Lösungsobjektträger abzudichten. Erstellen Sie als Nächstes eine Standardreferenz.Verwenden Sie dazu eine Polystyrol-Latexlösung mit 0,1 Gewichtsprozent. Geben Sie in den zweiten Objektträger 60 Mikroliter der Polystyrol-Latexlösung, decken Sie ihn mit einer Glasabdeckung ab und stellen Sie sicher, dass keine Blasen eingeschlossen werden. Nachdem Sie überschüssige Lösung entfernt haben, tragen Sie Klebstoff auf, um die Lösung im Objektträger zu versiegeln.Lassen Sie den Kleber bei beiden Dias bei Raumtemperatur trocknen. Bringen Sie an dieser Stelle den Objektträger zum inversen Mikroskop, das mit einer 10-fach-Objektivlinse ausgestattet ist, und legen Sie ihn auf den Mikroskoptisch. Das Deckglas sollte nach unten zeigen.Fahren Sie fort, indem Sie einen Strahldämpfer vor dem Detektor platzieren. Wenden Sie anschließend den Laserstrahl durch die Objektivlinse auf die Probe an. Fahren Sie mit der Arbeit mit der Objektive fort.Passen Sie die Höhe des Objektivs an, um den Fokuspunkt festzulegen. Wenn das Objektiv mit dem CCD betrachtet wird, wird das reflektierte Bild, wenn es sich aus seiner niedrigsten Position erhebt, zuerst auf die Oberfläche des Deckglases fokussiert. Anschließend fokussiert es sich auf die Grenzfläche zwischen dem Deckglas und der Probe.Es fokussiert sich ein drittes Mal auf die Grenzfläche zwischen der Probe und dem Objektträgerglas. Legen Sie den Mittelpunkt zwischen der Cover-Musterschnittstelle und der Musterfolienschnittstelle fest. Dämpfen Sie das Streulicht, indem Sie die Laserleistung reduzieren.Entfernen Sie dann den Strahlblock, um Streulicht in den Detektor zu bringen. Wenn Sie bereit sind, initiieren Sie eine 30-sekündige Zeitkorrelationsmessung über den Steuercomputer. Stellen Sie anschließend den Brennpunkt des Mikroskops ein, bevor Sie die Messung wiederholen.Verwenden Sie mehrere Fokuspunkte, um einen weiten Bereich für die Anfangsamplitude der Zeitkorrelationsfunktion zu erhalten. Wenn genügend Daten gesammelt wurden, platzieren Sie einen Strahldämpfer vor dem Detektor. Entfernen Sie am Mikroskop den Standard-Objektträger.Starten Sie die Probenmessung mit einem leeren Mikroskoptisch und stellen Sie die Temperatur auf 25 Grad Celsius ein. Legen Sie dann den vorbereiteten Objektträger mit der Deckseite nach unten auf den Tisch. Passen Sie die Höhe der Objektivlinse an, um die Schnittstelle des Abdeckungsmusters zu identifizieren.Passen Sie es weiter an, um die Benutzeroberfläche der Beispielfolie zu finden. Stellen Sie für die Messung den Brennpunkt zwischen diesen beiden Positionen ein. Entfernen Sie den Strahldämpfer vor dem Detektor.Führen Sie am Computer eine 30-Sekunden-Zeitkorrelationsmessung durch. Stellen Sie als Nächstes die Bühnentemperatur auf 35 Grad Celsius ein. Da dieses Klima über der unteren kritischen Lösungstemperatur liegt, wechselt die Lösung von klar zu trüb.Führen Sie eine weitere Messung der Zeitkorrelationsfunktion durch. Hier sind die Zeitkorrelationsfunktionen für den Polystyrol-Latex-Suspensionsstandard bei zwei verschiedenen Brennpunkten. Die rote Kurve entspricht einer Zeitkorrelationsfunktion, deren Anfangsamplitude ungefähr eins beträgt.Die blaue Kurve entspricht einer Anfangsamplitude von etwa 0,2. Dies ist die Größenverteilung, die durch die inverse Laplace-Transformation der Daten mit einer Anfangsamplitude von 0,2 erhalten wird. Bei der Berechnung wird der Effekt der partiellen Überlagerung berücksichtigt.Der nominale Teilchenradius beträgt 50 Nanometer. Diese Zeitkorrelationsfunktionen gelten für Poly(NIPA) unterhalb und oberhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur. Die schwarze Kurve entspricht einer Messung bei 25 Grad Celsius.Die rote Kurve entspricht einer Messung bei 35 Grad Celsius und unmittelbar nachdem die Lösung trüb wurde. Die blaue Kurve ist für eine Messung bei 35 Grad Celsius, 20 Minuten, nachdem die Lösung trüb geworden ist. Im Folgenden finden Sie die Größenverteilungen, die den einzelnen Messbedingungen zugeordnet sind.Unterhalb der unteren kritischen Lösungstemperatur beträgt der mittlere hydrodynamische Radius mehrere Zehntel Nanometer. Oberhalb der kritischen Temperatur beträgt die Größe etwa 1 Mikrometer. Die Verschiebung der Kurven mit der Temperatur und der Zeit deutet auf eine Zunahme der Aggregation hin.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

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