Linear Agarose Kanäle zu studieren Drosophila Larval Krabbeln Verhalten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Drosophila im Larvenstadium zu beobachten, die in einem linearen Agarosekanal kriechen, um die Entwicklung neuronaler Schaltkreise zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Neuroethologie und Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis der neuronalen Codes, die motorische Muster erzeugen, und die Identifizierung wichtiger genetischer und zellulärer Prozesse, die neuronale Schaltkreise für die Bewegungskontrolle nutzen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Verhaltensrepertoire der Larven einschränkt, so dass die Forscher ein einzelnes Multimuster im Detail untersuchen können.

Das Verfahren wird von Zarion Marshall, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt. Zunächst ist es wichtig, den Gesundheitszustand der Larve zu beurteilen. Setzen Sie drei bis vier Tage vor der Aufnahme die Auffangplatte des Käfigs für erwachsene Tiere wieder auf.

Fahren Sie damit fort, dies täglich und zur gleichen Tageszeit zu tun. Die Eier und frisch geschlüpften Larven auf dem Teller zählen. Die erwartete Anzahl der Eier liegt zwischen 500 und 2.000.

Passen Sie die Anzahl der erwachsenen Tiere im Käfig nach Bedarf an. 24 Stunden später untersuchen wir die Platte, um festzustellen, ob die Larven gesund sind. Die meisten Eier sollten zu Larven geschlüpft sein, und die Larven sollten in die Hefepaste gekrochen sein.

Anzeichen für einen schlechten Gesundheitszustand sind eine große Anzahl ungeschlüpfter Eier, tote Larvenkörper, die von der Hefepaste entfernt sind, und Larven mit ungewöhnlich dunklen Flecken im Bauchraum, was ein Indikator für eine Immunreaktion ist. Wenn die Larven ungesund erscheinen, wechseln Sie den Käfig mit frisch vorbereiteten Platten und überprüfen Sie den Genotyp der adulten Tiere. Für das Experiment sammeln Sie frisch geschlüpfte Larven des zweiten Stadiums von ein bis zwei Tage alten Platten.

Alle diese Stufen können in der Analyse verwendet werden. Verwenden Sie für dieses Protokoll eine PDMS-Gießform mit linearem Kanal. Reinigen Sie die Gussform mit Isopropylalkohol.

Sobald sie getrocknet ist, legen Sie die Form in einen zehn Zentimeter großen Deckel oder ein ähnliches Gefäß. Füllen Sie dann die Form mit drei Prozent Agarose, die auf 55 Grad Celsius abgekühlt ist. Gießen Sie die Agarose vorsichtig ein, um zu vermeiden, dass Luftblasen in der Form eingeschlossen werden.

Der Schimmel sollte gerade von der Agarose bedeckt sein. Sobald sie erstarrt sind, entferne die Agarosekanäle aus der Form. Schneiden Sie die Ränder der scheibenförmigen Kanäle ab und tauchen Sie die Kanäle dann in Wasser.

Sie können bis zu sieben Tage in vier Grad Celsius heißem Wasser gelagert werden. Lassen Sie die Kanäle vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen. Wählen Sie einen Kanal, der der Breite der Larve entspricht.

Die Kanäle sind zwischen 100 und 300 Mikrometer breit und alle 150 Mikrometer tief. Schneiden Sie dann mit einer sauberen Rasierklinge einen einzelnen Kanal aus der vorbereiteten Scheibe ab. Mit einer Pinzette den Kanal mit der gerillten Seite nach oben auf einen Glasdeckel oder -schieber in geeigneter Größe übertragen.

Als nächstes nimmst du mit einer feinen Pinzette eine Larve vorsichtig auf, ohne sie zu quetschen. Ein fein bestückter Pinsel funktioniert auch gut. Wenn sie zusammengedrückt wird, können Schmerzreflexe wie Rollen oder Buckeln das Verhalten der Larve im Kanal dominieren.

Waschen Sie nun die Larve, indem Sie sie kurz in Wasser tauchen, und legen Sie sie dann in den geschnittenen Kanal, um sie vorsichtig in Position zu bringen. Sobald Sie sich im Kanal befinden, passen Sie die Ausrichtung der Larve an, um die gewünschte Struktur leicht abbilden zu können. Geben Sie dann ein oder zwei Tropfen Wasser an beide Enden des Kanals, um den Kanal mit Wasser zu füllen.

Wenn Luftblasen eingeschlossen werden, heben Sie vorsichtig die Seiten des Kanals an, um sie zu entfernen. Um die Ausrichtung der Larve weiter anzupassen, schieben Sie den Kanal vorsichtig an, um die Larve herumzurollen. Die Larve ist nun bereit, abgebildet zu werden.

Larven in linearen Kanälen führen anhaltende Anfälle von rhythmischem Krabbeln aus. Fluoreszierende Sonden lassen sich leicht untersuchen. Zum Beispiel zeigen Larven, die GFP in ihren Neuronen vom GAL4-Treiber exprimieren, dynamische Veränderungen der Fluoreszenzintensitäten, die während des Kriechzyklus vom Nervenstrang ausgehen

Das ZNS bewegt sich fast gleichzeitig mit dem Kopf und Schwanz der Larve vorwärts, da eine Welle der Muskelkontraktion entlang der Körperachse verläuft, das ZNS bewegt sich in die Fokusebene hinein und aus ihr heraus, wodurch sich die Fluoreszenz des Nervenstrangs ändert. Die Veränderungen der Fluoreszenz wurden anhand von drei Krabbelschritten für drei Larven quantifiziert. Die Dynamik der Fluoreszenz des Nervenstrangs über den Schrittzyklus folgte einem reproduzierbaren Muster, das für die Phänotypisierung verwendet werden konnte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie man Larven für das Verhalten sammelt, Agarosekanäle vorbereitet und die Larven in die Kanäle lädt, um das lineare Krabbelverhalten zu visualisieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Larven schonend zu behandeln.