Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch In Situ Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen
10. Dezember 2016
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wechselwirkungen der Mitochondrien des endoplasmatischen Retikulums mit Hilfe eines in situ Proximity-Ligationsassays in fixierten Zellen sichtbar und quantifizierbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten, um ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen mit einer einfachen Immunfluoreszenztechnik besser zu analysieren. Hoffentlich werden neue Behandlungsstrategien vorgeschlagen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in fixierten Zellen visualisieren und quantifizieren können und diese Technik auf in Paraffin eingebettete Gewebebiopsien von Patienten angewendet werden kann. Unter Verwendung des in situ Proximity-Ligationsassays, der in diesem Video demonstriert wird, verbinden sich ein Maus-Primärantikörper, der gegen VDAC1 an der äußeren Mitochondrienmembran gerichtet ist, und ein Kaninchen-Primärantikörper, der gegen IP3R1 an der endoplasmatischen Retikulummembran gerichtet ist, mit ihren Epitopen in der Nähe an der mitochondrialen assoziierten Membrangrenzfläche. Proximity-Ligationssonden mit DNA-Endenden und die gegen Maus- und Kaninchen-IgG gerichtet sind, werden hinzugefügt und können Templates für die Ligation von Konnektoroligos bilden und können mit Texas Red Oligonukleotiden amplifiziert und sichtbar gemacht werden.Dies kann nur geschehen, wenn sich die beiden Zielproteine in einem Abstand von weniger als 40 Nanometern befinden. In Übereinstimmung mit dem Abstand zwischen beiden Organellenmembranen, an der mitochondrialen assoziierten Membrangrenzfläche. Um Zellen für den In-situ-Proximity-Ligationsassay zu fixieren und zu blockieren, werden humane H7-Zellen mit 150.000 Zellen pro unkodierter 35-mm-Glasbodenschale plattiert. Entfernen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium und verwenden Sie 1 ml PBS, um die Zellen zu waschen. Aspirieren Sie dann den Puffer und fügen Sie 1 ml zehn Prozent Formaldehyd hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur unter Rühren für 10 Minuten, um die Zellen zu fixieren. Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 1 ml 1 M Glycin hinzu und mischen Sie die Platten durch Rotation. Entfernen Sie die Glycinlösung und fügen Sie 1 ml 1XPBS hinzu. Rühren Sie dann die Platten kurz um und saugen Sie den Puffer an. Geben Sie anschließend 1 ml 100 mM Glycin in die Zellen. Die Platten bei Raumtemperatur unter Rühren 15 Minuten inkubieren. Nach dem Aspirieren der Lösung permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 0,1 % Triton-X100 in PBS hinzufügen. Und wiederholen Sie die Inkubation. Aspirieren Sie das Reinigungsmittel und fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Nachdem Sie den Puffer entfernt haben, geben Sie 40 Mikroliter Blockierungslösung in jede Zellschale und inkubieren Sie die Proben in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Klopfen Sie dann die Verstopfungslösung von den Schalen ab und versuchen Sie, für jeden Objektträger das gleiche Restvolumen an Puffer zu erhalten, ohne die Objektträger trocknen zu lassen. Um den Proximity-Ligationsassay durchzuführen, verwenden Sie PBS, um die primären Antikörper zu verdünnen. Vortexen und die Lösung zu den Gerichten geben. Inkubieren Sie die Proben bei 4
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung der Interaktionen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien in fixierten Zellen mit hoher Empfindlichkeit. Die Methode nutzt einen optimierten In-situ-Proximity-Ligation-Assay, um spezifische Proteinkomplexe an der Mitochondrien-assoziierten Membran-Schnittstelle zu zielen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Biochemie
Hintergrund
- Das endoplasmatische Retikulum und die Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel.
- Das Verständnis ihrer Interaktionen ist wesentlich für die Aufklärung zellulärer Funktionen.
- Proximity-Ligation-Assays bieten eine empfindliche Methode zum Studium von Proteinwechselwirkungen.
- Diese Studie konzentriert sich auf einen spezifischen Proteinkomplex, der an diesen Interaktionen beteiligt ist.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Visualisierung von ER-Mitochondrien-Interaktionen.
- Quantifizierung dieser Interaktionen mit hoher Empfindlichkeit.
- Verbesserung des Verständnisses des Zellstoffwechsels und der Signalübertragung.
Verwendete Methoden
- In-situ-Proximity-Ligation-Assay
- Zielen auf den Inositol-1,4,5-Triphosphat-Rezeptor
- Einbeziehung des glucoseregulierten Proteins 75
- Analyse des spannungsabhängigen Anionenkanals und des Cyclophilin-D-Komplexes
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von ER-Mitochondrien-Interaktionen.
- Quantifizierung von Proteinkomplexen an der Membran-Schnittstelle.
- Demonstration hoher Empfindlichkeit bei der Erkennung von Interaktionen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ermöglicht eine detaillierte Untersuchung zellulärer Interaktionen.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können zum Verständnis metabolischer Prozesse beitragen.
- Diese Methode kann in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantifying endogenous ER-mitochondria interactions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular signaling and metabolic regulation. The in situ proximity ligation assay enables sensitive, multiplexed detection of organelle contact sites without protein overexpression, supporting predictive confidence in disease-relevant systems. This capability strengthens portfolio decisions at the intersection of target validation and mechanistic pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of ER-mitochondria contacts at the molecular level.
- Supports mechanistic de-risking by confirming endogenous protein proximity in fixed cells and tissue biopsies.
- Facilitates functional target validation for pathways involving calcium signaling and organelle crosstalk.
- Improves predictive confidence for advancing targets implicated in metabolic and signaling disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying protein-protein interactions at sub-organelle resolution.
- Enables multi-condition testing to assess the impact of compounds or genetic perturbations on ER-mitochondria contacts.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental arms.
- Supports assay scalability and platform reuse for broader screening initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling analysis in patient-derived tissue biopsies.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation of organelle interaction targets.
- Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic evidence of pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This in situ proximity ligation assay bridges early discovery and preclinical research by enabling robust quantification of ER-mitochondria interactions in fixed cells and tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for organelle crosstalk mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Provides sensitive detection of protein proximity below 40 nm, enabling statistical comparison of interaction frequencies.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic validation in disease-relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse protein interaction studies across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection of endogenous protein interactions with high sensitivity and specificity.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing robust mechanistic data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated organelle interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence and proximity ligation assay protocols.
- Needs access to high-quality antibodies and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible quantification across studies.
- Adaptable to both cell lines and paraffin-embedded tissue biopsies for translational relevance.
- Limited to fixed samples; not suitable for live-cell dynamic interaction studies.
