Name: Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch In Situ Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung und Quantifizierung von Interaktionen zwischen endoplasmatischem Reticulum und Mitochondrien in fixierten Zellen mittels optimiertem In Situ Nähe-Ligatur-Assay.

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Wir danken allen Menschen in unserem Labor, die das Protokoll beigetragen zu optimieren und zu validieren. Diese Arbeit wurde von INSERM und der nationalen Forschungsagentur (ANR-09-JCJC-0116 UND ANR-11-BSV1-033-02) unterstützt. ET wurde während ihrer Promotion durch ein Forschungsstipendium aus dem Französisch Ministerium für Hochschulbildung und Forschung unterstützt.

1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Herstellung von 10% Formaldehyd in PBS (low-Salz) von 5,5 ml 37% Formaldehyd in 14,5 ml PBS verdünnt. Vorbereitung 1 M Glycin, pH 8,0, die durch Auflösen von 3,8 g Glycin in 50 ml PBS; verdünnt diese Lösung 100 mM Glycin in 1x PBS zu erhalten. </li><li> Bereiten 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Bereiten Sie 20x Saline Sodium Citrate (SSC) unter Verwendung von 3,0 M Natriumchlorid und 0,30 M Trinatriumcitrat in einem VE-Wasser-Puffer mit pH 7,0 bei 25 ° C. Verdünnen Sie diesen Puffer auf 1x und 0,01x entsalztes Wasser. </li></ol> 2. Fixierung von Zellen HINWEIS: Es wird verwendet , um die HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie in dieser Studie, aber dieses Verfahren ist anwendbar auf andere adhärente Zellkulturen. <ol><li> Platte HuH7 Zellen (kultiviert in DMEM 1 g / l Glucose, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum und 0,01% Penicillin-Streptomycin Lager) bei 150000 Zellen pro unbeschichteten 35-mm Glasbodenschale. Bei Arbeiten an PrimärzelleKulturen, verwenden Kollagen-beschichteten Schalen. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und absaugen. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Formaldehyd 10% und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion mit 1 ml 1 M Glycin und mischen durch Rotation. Entfernen Sie die Stopp-Reaktionslösung und die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; durch Rotation und absaugen agitieren. 1 ml 100 mM Glycin zu den Zellen und inkubiere sie für 15 min bei RT unter Rühren und dann absaugen. HINWEIS: Das Protokoll hier angehalten werden kann und die folgenden Schritte können auf einen anderen Tag verschoben werden. In diesem Fall 1 ml 100 mM Glycin und halten bei 4 ° C, falls erforderlich. </li></ol> 3. Die Permeabilisierung der Zellen <ol><li> 1 ml 0,1% Triton-X100 in 1x PBS, Inkubation für 15 min bei RT unter Rühren, und dann gründlich absaugen. Diese Inkubationszeit erhöht 15 werden konnte - 20 min, wenn sie auf Primärzelle cultur Arbeitses (zB primäre Mäuse Hepatozyten). Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml 1x PBS; aspirieren. </li></ol> 4. Sperren <ol><li> Werden 40 &amp; mgr; l Blockierungslösung zu jeder Probe (vom kit); Dieses Volumen kann erhöht werden, um die Probe zu bedecken. Inkubiere das Geschirr für 30 min bei 37 ° C in einer Feuchtigkeitskammer. </li><li> Tippen Sie auf die Blockierungslösung aus der Gerichte. Versuchen Sie, gleich Restvolumina für jede Folie zu erhalten, da diese Reproduzierbarkeit beeinflussen. Lassen Sie sich nicht die Proben trocknen! </li></ol> 5. Primary Antibodies <ol><li> Verdünnen Sie die primären Antikörper in 1x PBS und fügen Sie die Lösung für die Gerichte (VDAC1 Maus-Antikörper: 1/100, IP3R1 Kaninchen-Antikörper: 1/500). Alternativ Grp75 oder CypD Antikörper (beide Maus-Antikörper bei 1/500 verwendet wird) kann anstelle von VDAC1 verwendet werden. </li><li> Inkubieren über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit Tris-gepufferte Salzlösung mit 0,01% Tween (TBS-T). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Proximity Ligatur Assay Probes <ol><li> Proximity-Ligation-Assay-Sonden werden von dem Kit zur Verfügung gestellt. Wählen Sonden entsprechend den Arten von primären Antikörpern. </li><li> Bereiten Sie die beiden Proximity Ligation Assay-Sonden 1: 5 in Antikörperverdünnung. Lassen Sie die Mischung 20 min bei RT zu sitzen. Fügen Sie die verdünnte Nähe Ligatur Assaysonde Lösung. Inkubieren des Geschirrs in einem vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für 1 h bei 37 ° C. Waschen Sie die Gerichte zweimal mit TBS-T. </li></ol> 7. Ligatur <ol><li> Verwenden Sie die in - situ - Nachweisreagenz Texas rot - Kit. </li><li> Verdünnen Sie die 5-fach Ligatur Lager (zur Verfügung gestellt von dem Kit) 1: 5 in hochreinem Wasser und gut mischen. Verdünnen Sie die Ligase in 1x Ligierungslösung (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 01.40 und Wirbel. Warten, um die Ligase hinzuzufügen, bis unmittelbar vor der Zugabe zu den Proben. </li><li> Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen) und Inkubation der Objektträger in einem vorgewärmten Feuchtigkeit chamber für 30 min bei 37 ° C. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit TBS-T. </li></ol> 8. Amplification HINWEIS: Achten Sie darauf, lichtempfindliche Reagenzien. <ol><li> Verdünnen Sie die 5-fach Verstärkung Lager (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1: 5 in hochreinem Wasser. Entfernen Sie die Polymerase aus der Tiefkühltruhe mit dem Gefrierblock (-20 ° C). Verdünnen Sie die Polymerase (von dem Kit zur Verfügung gestellt) 1:80 in der 1x Verstärkerlösung und Wirbel. Fügen Sie die Polymerase unmittelbar vor der Mischung verwendet wird. </li><li> Diese Lösung wird zu jeder Probe (40 ul für 35-mm-Glasbodenschalen). Inkubieren der Objektträger in einem vorgewärmten feuchten Kammer für 100 min bei 37 ° C. Tippen Sie auf die Amplification-Polymerase-Lösung aus der Folien. </li></ol> 9. Schluss Waschen <ol><li> Waschen Sie die Folien in 1x SSC Waschpuffer für 2 min. Waschen Sie die Folien in 0,01x SSC Waschpuffer für 2 min. Lassen Sie die Gerichte im Dunkeln bei RT trocknen. </li></ol> 10. Vorbereitung für Imaging <ol&gt; <li> Montieren Sie die Folien ein minimales Volumen von Montagemedium enthält DAPI (wässrige und nicht erstarrt), um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter dem Deckglas verfangen. Nagellack kann verwendet werden, um die Kanten zu versiegeln. Warten Sie ca. 15 Minuten vor der Verwendung eines Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop zu analysieren (Anregung: 594 nm, Emission: 624 nm, Vergrößerung: 63X). </li><li> Nach der Bebilderung, speichern Sie die Objektträger bei -20 ° C im Dunkeln. </li></ol>

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<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zusammenfassend deuten unsere Studien darauf hin, dass der in situ Proximity-Ligationsassay wirklich eine relevante Strategie ist, um endogene ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen zu verfolgen und zu quantifizieren, ohne dass organellenspezifische Fluorophore oder fluoreszierende Proteine verwendet werden müssen. Die spezifische Verwendung von VDAC1/IP3R1-Antikörpern wurde angepasst, um ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in HuH7-Zellen zu untersuchen. Je nach Zelltyp können jedoch alternative Isofor...

Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) nicht unabhängig sind Organellen in der Zelle, aber sie interagieren strukturell und funktionell an Kontaktstellen definiert als Mitochondrien-assoziierte endoplasmatischen Retikulum Membranen (MAM). Tatsächlich entsprechen MAMs zu Regionen, in denen die Membranen des ER und Mitochondrien eng angelagert werden, so dass Wechselwirkungen zwischen Proteinen von beiden Seiten. Dennoch verschmelzen die Membranen dieser Organellen nicht innerhalb dieser Regionen, so behalten sie ihre separate Einheiten. Die MAMs spielen eine entscheidende Rolle bei der Calcium (Ca 2+) und Phospholipid Transfer von ER zu den Mitochondrien, den Energiestoffwechsel und das Überleben der Zellen 1-3 zu beeinträchtigen. Die Assoziation zwischen dem ER und Mitochondrien wurde zuerst in den 1970er Jahren mit der Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht. Seitdem Transmissionselektronenmikroskopie 4,5, Elektronentomographie 6,7 oder Immuno-Lokalisierung von ER und Mitochondrien-spezifischen Fluorophores / fluoreszierende Proteine 8 wurden klassisch zu studieren ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen. Ein weiteres nützliches Werkzeug für die Analyse von MAM auf der Verwendung von subzellulären Fraktionierung basiert. Es erlaubt die Isolierung von MAM Fraktionen durch Differential Ultrazentrifugation gekoppelt mit einem Percollgradienten 9. Allerdings enthält das Endprodukt angereichert MAM Fraktionen, anstatt reinen Fraktionen. Insgesamt sind diese Strategien nicht besonders empfindlich und / oder quantitative, und sie sind nicht leicht zugänglich für große Screening. Alternativ haben genetische Ansätze unter Verwendung von arzneimittel induzierbaren fluoreszierendes inter-Organell Linkern entstanden, aber sie haben nicht die Analyse von Organell Wechselwirkungen an den endogenen Expressionsniveaus von 10 Proteinen ermöglichen. Basierend auf Szabadkai Entdeckung des IP3R / Grp75 / VDAC Komplex im MAM 11 entwickelten wir eine quantitative Methode ER-Mitochondrien - Interaktionen zu analysieren. Wir haben die in situ Nähe ligatiauf Assay Wechselwirkungen zwischen VDAC1 und IP3R1 zwei Organell-Oberflächenproteine im Ca 2+ -channeling Komplex an der Grenzfläche MAM in fixierten Zellen 12 beteiligt zu detektieren und zu quantifizieren. Kurz gesagt, sondiert wir VDAC1 an der äußeren mitochondrialen Membran (Maus - anti-VDAC1 primärer Antikörper) und IP3R1 an der ER - Membran (Kaninchen - anti-IP3R1 primärer Antikörper) (Abbildung 1, Tafel A). Dann wird gemäß dem Test haben wir sowohl anti-Maus- und anti-Kaninchen-IgG (Maus und Kaninchen Proximity Ligation Assay-Sonden), die an komplementäre Oligonukleotid Erweiterungen konjugiert sind. Wenn die beiden Proteine gezielt in einem Abstand von weniger als 40 nm sind, können die Oligonukleotide mit den anschließend zugegeben Verbinder Oligos hybridisieren die Bildung einer kreisförmigen DNA - Templat (1, Feld B) zu ermöglichen. Diese kreisförmige DNA - Molekül ligiert und amplifiziert, eine einzelsträngige DNA - Produkt kovalent an einer der Näherungssensoren zu schaffen (Abbildung 1, Tafel c) </strong&gt;. Da der Abstand zwischen dem ER und Mitochondrien im MAM - Schnittstelle im Bereich von 10 nm bis 25 nm 6, Proximity Ligation und Amplifikation kann durchgeführt werden, aufgrund der Hybridisierung von Texasrot-markierten Oligonukleotidsonden zum anschließenden Nachweis führen (Abbildung 1, Tafel d ). Jeder fluoreszierenden Punkt repräsentiert Wechselwirkungen zwischen VDAC1 / IP3R1, so dass die Quantifizierung der in - situ - ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in einzelnen Zellen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Detektion von endoplasmatischen Retikulum-Mitochondrien Wechselwirkungen von In Situ Proximity Ligation Assay. a) Antikörpers Eine Maus primären gegen VDAC1 und ein Kaninchen primären Antikörper gerichtet gegen IP3R1 an ihre Epitope in der Nähe an der Schnittstelle MAM binden kann, b) die Zugabe eines Paares von Annäherungs Ligierung Sondengegen Maus und Kaninchen-IgG. Diese Sonden wurden DNA-Stränge befestigt, die Vorlagen für die Unterbindung des Steckers Oligos bilden können. c) Die kreisförmige DNA - Strang nach Ligatur gebildet wird, kann verstärkt und d) durch Mikroskopie als fluoreszierender Punkt unter Verwendung Texas rot-markierten Oligonukleotiden sichtbar gemacht werden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ähnliche in situ Proximity Ligation Assay Experimente können mit dem Grp75 / IP3R1 Paar von Antikörpern sowie Cyclophilin D (CypD) / IP3R1 Antikörper durchgeführt werden, wenn man bedenkt , dass CypD wurde an der MAM Schnittstelle mit dem IP3R / Grp75 / VDAC - Komplex interagieren gezeigt 14.12.

<table><tbody><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenkulturschalen</td><td>MatTeK Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Blockierungslösung</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004 oder DUO-92002</td><td>in den Duolink PLA-Sonden enthalten, Sigma</td></tr><tr><td>VDAC1 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>IP3R1-H80 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc28614</td><td></td></tr><tr><td>CypD Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab110324</td><td></td></tr><tr><td>Grp75 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13967</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>euromedex</td><td>ET220</td><td>Verdünnt zu 1x</td></tr><tr><td>Tween 100x</td><td>euromedex</td><td>2001-B</td><td>Verdünnung in TBS zu 0,01%</td></tr><tr><td>PLA Sonden Maus MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>PLA Sonden Rabbit PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO-92002</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink Detektionsreagenzien rot</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Ligationslösung</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma</td></tr><tr><td>Amplifikationslösung</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma</td></tr><tr><td>Polymerase</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Teil der Duolink Detektionsreagenzien rot, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink Eindeckmedium</td><td>Sigma</td><td>DUO80102</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td colspan="4">Softwares</td></tr><tr><td>Blob-Finder-Software</td><td></td><td></td><td>BlobFinder ist eine frei vertriebene Software, die Berechnungen an Zellen aus Fluoreszenzmikroskopie-Bildern durchführen kann. Diese Software kann kostenlos vom Zentrum für Bildanalyse an der Universität Uppsala heruntergeladen werden, das die Software entwickelt hat, und die Arbeit wurde durch das EU-RP6-Projekt ENLIGHT und Olink Bioscience unterstützt. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td>Kann kostenlos heruntergeladen werden bei: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr></tbody></table>

studie des endoplasmatischen reticulum und mitochondria wechselwirkungen durch<em&gt; in situ</em&gt; nähe ligatur assay in fixierten zellen

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Strukturelle Wechselwirkungen zwischen der endoplasmatischen retikulären Membran (ER) und den mitochondrialen Membranen, in Bereichen, die als Mitochondrien-assoziierte Membranen (MAM) bekannt sind, sind entscheidende Knotenpunkte für die zelluläre Signalübertragung und das Zellschicksal. Insbesondere ermöglichen diese Kontaktstellen zwischen den Organellen den Transfer von Calcium vom ER zu den Mitochondrien durch den spannungsabhängigen Anionenkanal (VDAC)/glukosereguliertes Protein 75 (GRP75)/Inositol-1,4,5-triphosphatrezeptor (IP3R) Calciumkanalisierungskomplex. Während dieses subzelluläre Kompartiment sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen intensiv untersucht wird, gibt es keine einfache und empfindliche Methode, um das endogene Ausmaß des ER-Mitochondrien-Kontakts in Zellen zu quantifizieren. In ähnlicher Weise sind MAMs hochdynamische Strukturen, und es gibt keinen geeigneten Ansatz, um Modifikationen von ER-Mitochondrien-Interaktionen ohne Proteinüberexpression zu verfolgen. In dieser Arbeit berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das auf der Verwendung eines in situ Proximity-Ligationsassays basiert, um endogene ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren, indem die enge Nähe zwischen Proteinen der äußeren mitochondrialen Membran (VDAC1) und der ER-Membran (IP3R1) an der MAM-Grenzfläche genutzt wird. Ähnliche in situ Proximity-Ligationsexperimente können auch mit den Antikörperpaaren GRP75/IP3R1 und Cyclophilin D/IP3R1 durchgeführt werden. Dieser Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen bildgebenden Verfahren, da er hochspezifisch, sensitiv und für Tests unter mehreren Bedingungen geeignet ist. Daher sollte die Verwendung dieses in situ Proximity-Ligationsassays hilfreich sein, um die physiologischen Regulationsmechanismen von ER-Mitochondrien-Interaktionen sowie ihre Rolle in pathologischen Kontexten besser zu verstehen.

Basierend auf unserer Erfahrung dieses Protokoll verwenden, können wir diese Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in fixierten Zellen sicher zu empfehlen. Repräsentative Bilder von in situ Proximity Ligation Assay-visualisierten ER-Mitochondrien - Wechselwirkungen in der HuH7 hepatocarcinoma Zelllinie unter Verwendung von mehreren Paaren von Antikörpern, gezeigt. Wie in Figur 2 durch Fluoreszenzmikroskopie gezeigt,...

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Interaktionen zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien mithilfe eines in-situ-Proximity-Ligationsassays in fixierten Zellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten, indem sie eine genauere Analyse der ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen mittels einer einfachen Immunfluoreszenztechnik ermöglicht. Möglicherweise ergeben sich daraus neue Behandlungsstrategien. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen sichtbar machen und quantifizieren können, und sie kann auch auf paraffineingebettete Gewebeproben von Patienten angewandt werden. Mithilfe des in diesem Video demonstrierten in-situ-Proximity-Ligationsassays binden ein mausspezifischer Primärantikörper gegen VDAC1 an der äußeren mitochondrialen Membran und ein kaninchenspezifischer Primärantikörper gegen IP3R1 an der Membran des endoplasmatischen Retikulums an ihre Epitope in unmittelbarer räumlicher Nähe an der Schnittstelle der mitochondrienassoziierten Membran. Proximity-Ligationssonden, die DNA-E

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Biology

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Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen,...

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Eine Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Methode gilt für virusbedingte intrazellulären Bildstrukturen über Elektronenmikroskopie (EM) in Zellen, die zuvor durch Lichtmikroskopie (LM) ausgewählt werden. LM und EM sind kombiniert als bildgebende Hybridansatz, eine integrierte Ansicht der Virus-Wirt Interaktionen zu erreichen.

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die CryoAPEX-Methode, bei der ein APEX2-markiertes Membranprotein durch Transmissionselektronenmikroskopie innerhalb optimal konservierter Zell-Ultrastruktur lokalisiert werden kann.

Die CryoAPEX-Methode zur Elektronenmikroskopie-Analyse der Membranproteinlokalisierung in ultrastrukturell konservierten Zellen

Ein einfaches und umfassendes Protokoll, um dreidimensionale Details von Membrankontaktstellen zwischen Organellen in Hepatozyten aus der Leber oder Zellen in anderen Geweben zu erfassen.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Wir haben einen Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay etabliert, um die Kontakte zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen zu überwachen. Mit diesem Assay beschreiben wir ein Protokoll zur quantitativen Messung des Ausmaßes dieser Interorganellenkopplungen in HEK293T Zellen unter den Bedingungen einer chemischen Behandlung.

Split-Luciferase-Reassemblierungs-Assay zur Messung von Kontakten zwischen endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien in lebenden Zellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

Erfahren Sie die Visualisierung und Quantifizierung von Interaktionen zwischen endoplasmatischem Reticulum und Mitochondrien in fixierten Zellen mittels optimiertem In Situ Nähe-Ligatur-Assay.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch

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