Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch In Situ Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen
10. Dezember 2016
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wechselwirkungen der Mitochondrien des endoplasmatischen Retikulums mit Hilfe eines in situ Proximity-Ligationsassays in fixierten Zellen sichtbar und quantifizierbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten, um ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen mit einer einfachen Immunfluoreszenztechnik besser zu analysieren. Hoffentlich werden neue Behandlungsstrategien vorgeschlagen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ER-Mitochondrien-Wechselwirkungen in fixierten Zellen visualisieren und quantifizieren können und diese Technik auf in Paraffin eingebettete Gewebebiopsien von Patienten angewendet werden kann. Unter Verwendung des in situ Proximity-Ligationsassays, der in diesem Video demonstriert wird, verbinden sich ein Maus-Primärantikörper, der gegen VDAC1 an der äußeren Mitochondrienmembran gerichtet ist, und ein Kaninchen-Primärantikörper, der gegen IP3R1 an der endoplasmatischen Retikulummembran gerichtet ist, mit ihren Epitopen in der Nähe an der mitochondrialen assoziierten Membrangrenzfläche. Proximity-Ligationssonden mit DNA-Endenden und die gegen Maus- und Kaninchen-IgG gerichtet sind, werden hinzugefügt und können Templates für die Ligation von Konnektoroligos bilden und können mit Texas Red Oligonukleotiden amplifiziert und sichtbar gemacht werden.Dies kann nur geschehen, wenn sich die beiden Zielproteine in einem Abstand von weniger als 40 Nanometern befinden. In Übereinstimmung mit dem Abstand zwischen beiden Organellenmembranen, an der mitochondrialen assoziierten Membrangrenzfläche. Um Zellen für den In-situ-Proximity-Ligationsassay zu fixieren und zu blockieren, werden humane H7-Zellen mit 150.000 Zellen pro unkodierter 35-mm-Glasbodenschale plattiert. Entfernen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium und verwenden Sie 1 ml PBS, um die Zellen zu waschen. Aspirieren Sie dann den Puffer und fügen Sie 1 ml zehn Prozent Formaldehyd hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur unter Rühren für 10 Minuten, um die Zellen zu fixieren. Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 1 ml 1 M Glycin hinzu und mischen Sie die Platten durch Rotation. Entfernen Sie die Glycinlösung und fügen Sie 1 ml 1XPBS hinzu. Rühren Sie dann die Platten kurz um und saugen Sie den Puffer an. Geben Sie anschließend 1 ml 100 mM Glycin in die Zellen. Die Platten bei Raumtemperatur unter Rühren 15 Minuten inkubieren. Nach dem Aspirieren der Lösung permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 0,1 % Triton-X100 in PBS hinzufügen. Und wiederholen Sie die Inkubation. Aspirieren Sie das Reinigungsmittel und fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Nachdem Sie den Puffer entfernt haben, geben Sie 40 Mikroliter Blockierungslösung in jede Zellschale und inkubieren Sie die Proben in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Klopfen Sie dann die Verstopfungslösung von den Schalen ab und versuchen Sie, für jeden Objektträger das gleiche Restvolumen an Puffer zu erhalten, ohne die Objektträger trocknen zu lassen. Um den Proximity-Ligationsassay durchzuführen, verwenden Sie PBS, um die primären Antikörper zu verdünnen. Vortexen und die Lösung zu den Gerichten geben. Inkubieren Sie die Proben bei 4
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung der Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und den Mitochondrien in fixierten Zellen mit hoher Empfindlichkeit vorgestellt. Die Methode nutzt einen optimierten in-situ-Proximity-Ligationsassay, um gezielt spezifische Protein-Komplexe an der Schnittstelle der mitochondrienassoziierten Membran anzusteuern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Biochemie
Hintergrund
- Das endoplasmatische Retikulum und die Mitochondrien spielen entscheidende Rollen im zellulären Stoffwechsel.
- Das Verständnis ihrer Wechselwirkungen ist entscheidend, um zelluläre Funktionen aufzuklären.
- Die Nähe-Ligationsanalyse bietet eine empfindliche Methode zur Untersuchung von Proteinwechselwirkungen.
- Diese Studie konzentriert sich auf einen spezifischen Proteinkomplex, der an diesen Wechselwirkungen beteiligt ist.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien entwickeln.
- Diese Wechselwirkungen mit hoher Empfindlichkeit quantifizieren.
- Das Verständnis des zellulären Stoffwechsels und der Signalübertragung verbessern.
Verwendete Methoden
- In-situ-Näherungs-Ligationsassay
- Targeting des Inositol-1,4,5-triphosphat-Rezeptors
- Beteiligung des glucose-regulierten Proteins 75
- Analyse des spannungsabhängigen Anionenkanals und des Cyclophilin-D-Komplexes
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Interaktionen zwischen ER und Mitochondrien.
- Quantifizierung von Protein-Komplexen an der Membrangrenzfläche.
- Nachweis einer hohen Empfindlichkeit bei der Detektion von Wechselwirkungen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ermöglicht eine detaillierte Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können zum Verständnis metabolischer Prozesse beitragen.
- Diese Methode kann auf verschiedene Bereiche der biologischen Forschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung endogener ER-Mitochondrien-Interaktionen ist entscheidend, um frühe Entdeckungshypothesen im Zusammenhang mit zellulärer Signalübertragung und metabolischer Regulation abzusichern. Der in situ Nachweissatz für Nähe-Ligation ermöglicht einen empfindlichen, multiplexfähigen Nachweis von Organellenkontaktstellen ohne Proteinüberexpression und stützt so die Vorhersagekraft in krankheitsrelevanten Systemen. Diese Fähigkeit stärkt Portfolio-Entscheidungen im Bereich der Zielvalidierung und der Analyse mechanistischer Signalwege.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantifizierung von ER-Mitochondrien-Kontakten auf molekularer Ebene.
- Unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken, indem die Nähe endogener Proteine in fixierten Zellen und Gewebeproben bestätigt wird.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung für Signalwege, die Calcium-Signalübertragung und die Interaktion zwischen Organellen beinhalten.
- Verbessert die Vorhersagegenauigkeit für die Weiterentwicklung von Zielstrukturen, die bei Stoffwechsel- und Signalübertragungsstörungen eine Rolle spielen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet einen standardisierten, reproduzierbaren Assay zur Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit suborganellärer Auflösung.
- Ermöglicht Tests unter mehreren Bedingungen, um den Einfluss von Verbindungen oder genetischen Störungen auf die Kontakte zwischen ER und Mitochondrien zu bewerten.
- Liefert quantitative Ergebnisse, die für vergleichende Analysen zwischen experimentellen Ansätzen geeignet sind.
- Unterstützt die Skalierbarkeit des Assays und die Wiederverwendung der Plattform für umfassendere Screening-Initiativen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Analyse in von Patienten stammenden Gewebeproben und ist somit auf krankheitsrelevante Systeme ausgerichtet.
- Gewährleistet eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Zielstrukturen für Organellenwechselwirkungen.
- Unterstützt eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem sie mechanistische Nachweise zur Aktivierung von Signalwegen liefert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser in-situ-Proximity-Ligationsassay verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Forschung, indem er eine robuste Quantifizierung der ER-Mitochondrien-Interaktionen in fixierten Zellen und Geweben ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen bei der Kommunikation zwischen Organellen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte für Substanz- oder genetische Screening-Kampagnen.
- Analytik: Ermöglicht den empfindlichen Nachweis von Protein-Proximität unterhalb von 40 nm und damit statistische Vergleiche von Interaktionshäufigkeiten.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Biomarker-Korrelation und die mechanistische Validierung in krankheitsrelevanten Proben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform für vielfältige Proteininteraktionsstudien über mehrere Forschungs- und Entwicklungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschären bei der Target-Validierung.
- Operativer Wert: Standardisiert den Nachweis endogener Proteinwechselwirkungen mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem robuste mechanistische Daten früh im Entwicklungsprozess bereitgestellt werden.
- Portfolio-Beitrag: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Targets mit validierten Organellen-Interaktionsprofilen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunfluoreszenz- und Nachbarschaftsligationsassay-Protokollen.
- Benötigt Zugang zu hochwertigen Antikörpern und einer Infrastruktur für Fluoreszenzbildgebung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg für reproduzierbare Quantifizierung über verschiedene Studien hinweg voraus.
- Einsatzmöglichkeiten sowohl bei Zelllinien als auch bei paraffin-eingebetteten Gewebeproben, was eine translationale Relevanz bietet.
- Auf fixierte Proben beschränkt; nicht geeignet für die Untersuchung dynamischer Wechselwirkungen in lebenden Zellen.
