Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der C. elegans Germline

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, aktive ERK-Spiegel in vivo in C.elegans-Gonaden zu testen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der ERK-Signalwege und Keimzellen zu beantworten, wie z.B. die Auswirkungen von medikamentösen Behandlungen oder Genstörungen auf den RAS-ERK-Signalweg und damit auf die Keimzellentwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das ERK-Signalmuster und die Stärke in vivo quantifiziert werden können.

Entnehmen Sie 100 bis 150 Würmer im gewünschten Entwicklungsstadium und sammeln Sie sie in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern M9-Puffer. Füllen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mit weiteren 900 Mikrolitern M9-Puffer und zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei Raumtemperatur mit 1000 mal g. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop vorsichtig 900 Mikroliter des M9-Puffers.

Wiederholen Sie dann die Wäsche noch zwei weitere Male, um die meisten anhaftenden Bakterien zu entfernen. Übertragen Sie anschließend die Würmer mit einer 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze mit einer Breitendbohrung in 100 Mikroliter M9-Puffer in eine Glasschale mit flachem Boden. Geben Sie dann ein bis drei Mikroliter 0,1 molaren Levamisol in die Schüssel und schwenken Sie es vorsichtig.

Befestigen Sie nun zwei 25-Gauge-Nadeln an zwei Spritzen, um ein Präparierwerkzeug für jede Hand herzustellen. Positionieren Sie unter einem Präpariermikroskop jede Nadel unter und über jedem Wurm und machen Sie mit einer scherenartigen Bewegung einen feinen Schnitt an jedem Wurm in der Nähe des zweiten Rachenkolbens. Schneiden Sie alle Tiere mindestens einmal, alle innerhalb von fünf Minuten, damit das Levamisol wirksam bleibt.

Es ist sehr wichtig, dass das Sezieren der Tiere in der Schale in weniger als fünf Minuten abgeschlossen ist. Falls eine extrudierte Gonade nicht sichtbar ist, überspringen Sie einfach das Tier. Hier sind ordentlich extrudierte Gonaden sichtbar.

Nachdem die Sektion abgeschlossen ist, geben Sie unter einem Abzug zwei Milliliter 3%iges Paraformaldehyd direkt in die Glasuhr und decken Sie sie mit Parafilm ab. Warten Sie dann zehn Minuten. Geben Sie dann mit einer 9-Zoll-Glaspipette drei Milliliter PBS-T in das Uhrglas und mischen Sie die Lösung mit der Pipette.

Ziehen Sie dann mit einer neuen Glaspipette die fünf Milliliter Flüssigkeit mit den Würmern auf und geben Sie sie in ein frisches konisches Fünf-Milliliter-Glasröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen dann 30 Sekunden lang in einer klinischen Zentrifuge bei 1000 g. Entfernen und entsorgen Sie nun unter einem Präpariermikroskop den Überstand, ohne das präparierte Gewebe zu stören.

Wiederholen Sie dann mit fünf Milliliter Aliquots PBS-T den Waschschritt noch zwei weitere Male und beenden Sie mit den Würmern in einem kleinen Volumen der Lösung. Fügen Sie dann mit einer Glaspipette zwei Milliliter 100%Methanol hinzu und mischen Sie das Gewebe vorsichtig, indem Sie es mit einer frischen Pasteurpipette auf und ab ziehen. Inkubieren Sie nun das Röhrchen mindestens eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius.

Führen Sie nach der Methanolbehandlung drei PBS-T-Wäschen durch und schließen Sie mit etwa 500 Mikrolitern PBS-T ab. Übertragen Sie nun das Gewebe mit einer frischen Pasteur-Pipette in ein neues Ein-Milliliter-Glasröhrchen und lassen Sie es durch die Schwerkraft absetzen. Verwenden Sie nach fünf bis 10 Minuten eine frische Pipette und die Hilfe eines Mikroskops, um so viel wie möglich von der Wäsche aus dem Röhrchen zu entfernen, ohne das Gewebe zu stören.

Um den Block zu starten, fügen Sie 100 Mikroliter 30% normales Ziegenserum hinzu, das der Blockierungspuffer ist. Decken Sie dann die Tube mit Parafilm ab und lassen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie nach einer Stunde mit einem Mikroskop so viel Flüssigkeit wie möglich mit einer neuen Pipette.

Stellen Sie als Nächstes 100 Mikroliter MAPKYT-Antikörper her, verdünnt mit eins zu 400 in 30 % NGS, und fügen Sie ihn dem Gewebe hinzu. Verschließen Sie dann das Röhrchen mit Parafilm und inkubieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag erwärmen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur und fügen Sie 800 Mikroliter PBS-T hinzu.

Ziehen Sie dann die Probe in eine frische Glaspipette und lassen Sie sie vorsichtig los, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Sobald sich das Taschentuch am Boden abgesetzt hat, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche insgesamt dreimal, immer mit einer frischen Pipette und niemals mit einem Wirbel. Der Sekundärantikörper wird genau wie der Primärantikörper appliziert, es wird nur zusätzlich darauf geachtet, dass das Gewebe von hier an im Dunkeln bleibt, bis es abgebildet werden kann.

Nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper geben Sie 800 Mikroliter der verdünnten DAPI-Lösung in das Gewebe, sobald die letzte Wäsche entfernt wurde. Decken Sie die Öffnung der Tube mit Parafilm ab und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie später unter einem Präpariermikroskop mit einer neuen Pipette so viel wie möglich von der DAPI-Lösung.

Nachdem Sie den letzten Fleck oder die letzte Wäsche entfernt haben, geben Sie einen Tropfen Einbettlösung auf die Tuben. Bereiten Sie nun einen Montageschlitten mit einem Agarose-Pad vor. Geben Sie einen Tropfen geschmolzene 2%ige Agarose auf einen sauberen Objektträger und legen Sie schnell einen zweiten sauberen Objektträger senkrecht zu und auf die Agarose.

Entfernen Sie zum Schluss sehr vorsichtig den oberen Objektträger. Übertragen Sie nun die präparierten Tiere auf das Pad und entfernen Sie mit Hilfe eines Mikroskops die gesamte überschüssige Flüssigkeit vom Pad. Zum Schluss tragen Sie einen 24 x 50 Millimeter großen Deckslip auf, ohne Luftblasen zu bilden.

Sobald der Deckglas aufgebracht ist, üben Sie keinen zusätzlichen Druck mehr aus. Dies führt oft zu Signalverlusten. Repräsentative Bilder von adulten hermaphroditischen Wildtyp-Tieren zeigten, dass die diphosphorylierte aktive Form von ERK typischerweise in der mittleren Pachytenregion, Zone 1, und in den reifsten Eizellen in Zone 2 sichtbar ist.

Störungen in diesem Aktivierungsmuster spiegeln Veränderungen des Signalwegs wider. Weibliche Keimbahnen spezifizieren keine Spermien und zeigen daher in Zone 2 keine Aktivierung von ERK, nur schwache Aktivierung in Zone 1. Einmal gemeistert, kann diese Technik höchstens zwei Tage dauern, wobei der erste Tag mit einer Stunde die meiste Zeit in Anspruch nimmt, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie RNA-Fische verwendet werden, um Dinge zu quantifizieren, wie z. B. den RNA-Transkriptspiegel, zusätzlich zu den Informationen über die Proteinhäufigkeit. Nach ihrer Entwicklung im Jahr 1995 ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Keimzellentwicklung, um die Proteinhäufigkeit in vivo zu testen und die Chromosomenmorphologie in C. elegans zu verfolgen.