Mit hoher Dichte Elektroenzephalographische Acquisition in einem Nagetiermodell unter Verwendung von Low-Cost-und Open-Source-Ressourcen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, ein kostengünstiges alternatives Verfahren zur Herstellung und Ableitung mit einer chronischen, hochdichten transkraniellen Elektrodenanordnung zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten, wie beispielsweise die großräumige Organisation neuronaler Netzwerke sowie räumliche und zeitliche Merkmale sensorisch hervorgerufener Antworten. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen in ihren geringen Kosten, ihrer Reproduzierbarkeit und der einfachen Anpassung an experimentelle Anforderungen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die komplexen Analysen von elektroenzephalographischen Daten ermöglicht, eignet sie sich ideal für Studien in der Anästhesiologie, Epileptologie und Schlafneurobiologie. Um die Kopfplatte herzustellen, isolieren Sie zunächst die Stifte eines 2-mal-50-Stift-Bricks mit einem sehr dünnen Anstrich Nagellack. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette jede achte Stiftreihe, indem Sie das Aufnahmende durch den Brick drücken.

Nachdem der Lack vollständig getrocknet ist, entfernen Sie die Beschichtung von den Spitzen der Stifte mit einem kleinen Tuch und Aceton. Schneiden Sie anschließend die Blöcke mit einem Rasiermesser oder einer Drahtschere zurecht, um zweimal-sieben-Stift-Ziegel zu erhalten. Zwei dieser Ziegel dienen als transkranielle EEG-Elektroden.

Bereiten Sie anschließend an jedem Ende eines 2-mal-50-Steins zwei 1-mal-2-Stiftsteine vor, um das EMG-Signal mit dem gleichen Verfahren aufzuzeichnen. Jeder 1-mal-2-Stein sollte eine der äußeren glatten Seiten des 2-mal-50-Steins beibehalten. Um die beiden Hälften des vollständigen Arrays abzuschließen, richten Sie die Stiftlöcher und Stifte eines 1-mal-2-Steins mit der hintersten Reihe der Stifte eines 2-mal-7-Steins aus.

Verwenden Sie anschließend einen zweikomponentigen Epoxidharz, um ihre glatten Oberflächen zu verbinden, und verstärken Sie die Verbindung bei Bedarf mit zusätzlichem Epoxidharz. Lassen Sie die beiden Hälften über Nacht aushärten. Um zwei thorakale EMG-Drahtelektroden herzustellen, beginnen Sie mit einem 3 cm langen isolierten Silberdraht.

Entfernen Sie 1 cm der Isolierung von einem Ende und bilden Sie zwei Schleifen aus dem blanken Draht, indem Sie ihn um eine Pinzette wickeln. Entfernen Sie anschließend 25 mm der Isolierung vom anderen Ende. Stellen Sie nun zwei ähnliche zervikale EMG-Drähte her, beginnend mit einem 1,5 cm langen Draht.

Entfernen Sie von jeder Hälfte des Kopfstücks den seitlichen Stift in der vordersten Reihe, da dieser Stift keine relevanten Gewebe berühren wird. Zum Anbringen der Drähte schneiden Sie die Stifte der 1×2-Steine 3 mm von ihren Spitzen ab. Dann löten Sie einen zervikalen EMG-Draht an den vorderen Stift und einen thorakalen EMG-Draht an den hinteren Stift.

Bevor Sie fortfahren, verwenden Sie ein Multimeter im Durchgangsprüfmodus, um sicherzustellen, dass jeder Pin elektrisch isoliert ist. Schließen Sie die Messleitungen an verschiedene Pin-Kombinationen an, und falls ein Paar elektrisch verbunden ist, gibt das Messgerät einen akustischen Signalton aus. Sobald es trocken ist, biegen Sie die EMG-Kabel, bis sie parallel zur AP-Achse mit minimaler seitlicher Verschiebung verlaufen.

Dann bedecken Sie die verlöteten Stellen mit Nagellack. Passen Sie nun mithilfe einer Drahtschere und eines Gehirnatlas die Nadellängen an. Suchen Sie die Nadel, deren ventraler Abstand zur Bregma am größten sein wird.

Schneiden Sie diesen Stift nicht ab, sondern schneiden Sie alle anderen Stifte in Bezug auf diesen Stift zu. Um die Kopfteile fertigzustellen, bedecken Sie alle Stiftspitzen mit einer Silberlösung, indem Sie einen Applikatorstift verwenden. Um einen Adapter herzustellen, beginnen Sie mit einem 36-poligen Dual-Row-Männchen-Nano-Stecker.

Zuerst die Anschlussdrähte auf eine einheitliche Länge von 2 cm kürzen. Anschließend 2,5 mm Isolierung an jedem Drahtende abisolieren. Zum Schluss die feinen Drahtenden verzinnt verbinden und die abisolierte Isolierung vom verzinnten Draht abschneiden.

Als Nächstes erstellen Sie einen passenden männlichen-männlichen Stecker für die Kopfplatte aus einem zweireihigen 50-poligen Stiftleistenblock. Wie zuvor bereiten Sie zwei zweireihige 7-polige und zwei zweireihige 1-polige Abschnitte vor. Löten Sie nun einen der Masseadern des Nano-Steckverbinders an den Pin, der 0,6 mm anterior und 1 mm lateral zum Bregma liegt.

Dieser Pin fungiert als Referenz und als Masse, wenn ein RHD-2132-Verstärkerchip verwendet wird. Als Nächstes löten Sie die abisolierten Nano-Verbindungsdrähte auf die gleiche Seite wie den Massepin-Anschluss. Da jeder Draht einem bestimmten Kanal zugeordnet ist, konsultieren Sie ein Kanalzuordnungsdiagramm der Verstärkerkopfstufe und weisen Sie die Kanäle zu.

Wenn alle Drähte an ihre jeweiligen Stifte gelötet sind, schneiden Sie alle ungenutzten Drähte ab. Überprüfen Sie anschließend mit einem Voltmeter, ob jeder Stift elektrisch von den anderen Stiften isoliert ist. Sobald die elektrische Isolation bestätigt ist, tragen Sie einen dünnen Lackfilm aus Nagellack um jede Lötstelle auf, um jeden Stift zusätzlich zu isolieren.

Danach mithilfe eines zweikomponentigen Epoxids den passenden Nano-Adapter an den bilateralen Stiftreihen der männlichen Steine verstärken. Es darf kein überschüssiges Epoxid auf den medialen Abschnitten der Adapter vorhanden sein, da dies verhindern würde, dass die Kopfteile gleichzeitig eingesteckt werden können. Zur Erhöhung der Haltbarkeit den Sockel des Nano-Verbinders verkleben.

Stellen Sie sicher, dass alle Lötstellen mit Epoxidharz abgedeckt sind. Sobald das Epoxidharz getrocknet ist, überprüfen Sie die Kanalzuordnung mithilfe von Impedanzmessungen. Nachdem die Maus sicher positioniert ist und Bregma als Ursprung des stereotaktischen Koordinatensystems definiert wurde, richten Sie den Schädel in der mediolateralen und in der anteroposterioren Achse aus.

Verwenden Sie dann einen Mikrobohrer mit einem Durchmesser von 0,5 mm, um Bohrungen im Abstand von 1,3 mm und 1 mm von der Mittellinie entfernt anzulegen, beginnend 3,3 mm anterior zur Bregma und endend 4,5 mm posterior zur Bregma. Erstellen Sie zwei Reihen beidseitig. Bohren Sie anschließend Bohrungen auf beiden Seiten der Mittellinie im Abstand von 1,3 mm, beginnend 2 mm anterior zur Bregma und endend 4,5 mm posterior zur Bregma.

Jetzt implantieren Sie die Kopfstücke. Bereiten Sie mit einer geraden Pinzette Kanäle für die EMG-Drahtelektroden für die thorakalen EMG-Drahtelektroden vor. Führen Sie diese von der Rückseite der Maus aus 2,5 cm unter der Haut hindurch und platzieren Sie die EMG-Drahtelektroden in der Kavität.

Bewegen Sie anschließend den EEG-Block mit einer gebogenen Pinzette so, dass die Stifte mit den Bohrlöchern ausgerichtet sind. Üben Sie leichten Druck aus und bewegen Sie die Stifte leicht hin und her, um sie in den Schädel einzuführen. Das EEG ist stabil, sobald es richtig eingefügt ist.

Als Nächstes stellen Sie die EMG-Drahtelektroden in ihre endgültige Position ein. Sobald sie fixiert sind, bereiten Sie eine Mischung im Verhältnis eins zu eins aus Methylmethacrylat und seiner Vernetzungsverbindung vor. Anschließend bedecken Sie den freiliegenden Schädel, die mit Nagellack behandelten Abschnitte der Stiftelektroden sowie den proximalen Teil der EMG-Drahtelektroden mit Zement.

Die weiblichen Aufnahmen der Halterung nicht bedecken oder Klebstoff in das Fell des Tieres gelangen lassen. Sobald der Klebstoff getrocknet ist, ist der Befestigungsvorgang abgeschlossen. Das Mäuschen aus dem stereotaktischen Rahmen nehmen und unter Überwachung der Vitalfunktionen aus der Narkose aufwachen lassen.

Zwei Wochen nach der Operation kann eine vollständig erholte Maus zur Gewöhnung mithilfe des Adapters an ein Aufnahmekabel angeschlossen werden. Nach der Gewöhnung können die Mäuse in Experimenten verwendet werden. Nachdem eine Maus über einen Adapter, einen Verstärker und ein Standard-Schnittstellenkabel an die Aufnahmeschaltung angeschlossen wurde, öffnen Sie die Open E-Fizz-Aufnahmesoftware.

Erstellen Sie dort eine Signalkette aus Rhythmus-FPGA und LFP-Anzeige, indem Sie die Module in die Signalkette ziehen. Anschließend ermitteln Sie die Elektrodenimpedanzwerte mit 30,0 Kilo-Samples pro Sekunde. Wählen Sie danach die gewünschte Abtastrate für die Aufzeichnung aus.

Filter können bei Bedarf ebenfalls in die Signalkette gezogen werden. Wählen Sie anschließend einen Speicherpfad für die Daten sowie die gewünschte Abtastrate aus. Klicken Sie dann auf das LFP-Anzeigefenster und drücken Sie die Wiedergabetaste.

Jetzt mithilfe der draw-Methode die EEG-Aktivität visualisieren und die Ansicht anpassen, indem die Signalamplitude, die Zeitskalierung sowie die Einstellungen eventuell verwendeter Filter geändert werden. Nachdem alle Einstellungen angepasst wurden, beginnen Sie mit der Aufnahme. Die Daten wurden von einer frei beweglichen Maus aufgezeichnet, der ein EEG-Kopfstück mit hoher Dichte implantiert wurde.

Die thorakale EMG-Aufzeichnung enthält eingebettete elektrische Aktivität, die vom Herzen stammt. Das zervikale EMG enthält Informationen über den Muskeltonus. Die einzelnen EEG-Wellenformen entsprechen dem Kanal-Mapping-Schema.

Mit dieser Aufzeichnung ist es möglich, die Herzfrequenz der Maus zu berechnen, indem die Zeit zwischen den elektrokardiographischen QRS-Spitzen gemessen wird. Ebenso lässt sich die Atemfrequenz der Maus ermitteln, indem die phasische Variabilität der QRS-Spitze analysiert wird, die auftritt, wenn sich der Brustkorb bei jedem Atemzug ausdehnt und zusammenzieht. Somit ermöglicht diese Versuchsanordnung die Erfassung einer murinen Polysomnographie.

Diese Anordnung ermöglicht die kortikale Kartierung visuell evozierter Potentiale. Wenn ein zehn Millisekunden langer Lichtimpuls ausschließlich an das linke Auge abgegeben wird, werden klassische Antworten im kontralateralen primären visuellen Kortex registriert, gefolgt von einer verzögerten Antwort im kontralateralen sekundären visuellen Kortex. Dies ist leicht an den zeitlich variierenden elektrischen Potentialen über die gesamte kortikale Oberfläche in kontralateralen V1 und V2 zu erkennen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochdichte Mikroelektrodenarrays für ein Nagetiermodell herstellt und von dem implantierten Array ableitet.

Wenn die Methode einmal beherrscht ist, können die Konstruktion und Implantation bei sachgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, einen geeigneten epiduralen Elektrodenkontakt herzustellen, ohne die Dura zu durchdringen. Das Kürzen der Stifte sowie besondere Sorgfalt beim Einsetzen der Kopfstücke erhöhen die Wahrscheinlichkeit für einen optimalen Elektrodenkontakt.

Viel Glück!