Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Selbstverabreichung von Ethanol bei Fruchtfliegen als Proxy für Veränderungen der Belohnungszustände zu messen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Erfahrung im Gehirn kodiert wird und zu Verhaltensänderungen führt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach ist und keine komplizierte Einrichtung erfordert.

Das Protokoll besteht aus zwei separaten Teilen. Die erste besteht darin, die Fliegen lohnenden und nicht lohnenden Erfahrungen auszusetzen, und die zweite besteht darin, den freiwilligen Ethanolkonsum als Maß für die Motivation zu testen, eine Drogenbelohnung zu erhalten. Die beiden Teile des Protokolls können unabhängig voneinander verwendet werden.

Zur Induktion der Modulation der Erfahrung als erster Schritt für weitere nachgelagerte Assays oder, als unabhängiger, Zwei-Choice-Fütterungsassay. Shir Zer, ein Masterstudent, und Julia Ryvkin, eine Doktorandin, beide aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Um mit dem Bau des Kapillardosierers zu beginnen, nehmen Sie zunächst ein Standard-Fliegenfläschchen mit kleinen Löchern an der Seite des Fläschchens.

Schneide den Stopfen des Fläschchens mit einer Rasierklinge quer in zwei Hälften. Markieren Sie vier Punkte auf der Oberfläche des Steckers, so dass eine quadratische Form entsteht, um die Kapillarhalter zu positionieren. Stechen Sie mit einer 18-Gauge-Nadel vier Löcher durch den Stopfen an der Stelle der Markierungen.

Und machen Sie die Löcher mit einer Mikropipette breiter. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge vier Mikropipetten so ab, dass sie fünf Mikroliter-Glaskapillaren fest halten. Stecken Sie diese in die Löcher im vorbereiteten Stecker.

Markieren Sie die Position der beiden Kapillaren, die Ethanol enthalten sollen, auf dem Stopfen. Ordnen Sie anschließend die Glasfläschchen in Mikrozentrifugengestellen an. Schmelzen Sie das Fliegenfutter und gießen Sie dann zwei Milliliter in jedes der Fläschchen.

Lassen Sie die Lebensmittel aushärten und decken Sie die Fläschchen dann mit Plastikfolie ab. Beginnen Sie damit, männliche Fliegen zu nehmen, die separat in kleineren Fläschchen in Abgeschiedenheit untergebracht wurden. Ordnen Sie diese nach dem Zufallsprinzip zwei Gruppen zu.

Diejenigen, die belohnende und nicht lohnende Paarungserfahrungen machen werden. Beginnen Sie mit der nicht belohnenden Gruppe, fügen Sie jedem Fläschchen ein zuvor verpaartes Weibchen hinzu. Gehe zur Belohnungsgruppe über und füge jedem Fläschchen ein jungfräuliches Weibchen hinzu.

Beobachten Sie die Paarungsbegegnungen, um sicherzustellen, dass Männchen, die mit jungfräulichen Weibchen interagieren, sich innerhalb der ersten Stunde erfolgreich paaren. Und dass Männchen, die mit zuvor verpaarten Weibchen interagieren, sich nicht paaren. Es ist wichtig, genau zu beobachten, um sicherzustellen, dass die verpaarte Kohorte tatsächlich begattet wird und dass die verworfene Kohorte es nicht schafft, sich zu paaren.

Entfernen Sie nach einer Stunde alle Männchen aus der verworfenen Kohorte, die es geschafft haben, sich zu paaren, und Männchen aus der verpaarten Kohorte, die sich am Ende der ersten Trainingssitzung nicht gepaart haben. Beenden Sie die Konditionierungssitzung, indem Sie die zuvor verpaarten Weibchen aus dem nicht lohnenden Zustand absaugen und diese Individuen für spätere Versuche aufbewahren. Zum Schluss entfernen und entsorgen Sie die Weibchen aus der Gruppe der verpaarten Männchen.

Lassen Sie die Fliegen eine Stunde ruhen und wiederholen Sie dann den einstündigen Konditionierungstest zwei weitere Male mit einer einstündigen Pause dazwischen. Diese Trainingseinheiten sollten jeden Tag für drei weitere Tage wiederholt werden. Nach der letzten Konditionierungssitzung am vierten Tag aspirieren Sie die einzelnen Männchen und legen sie in Gruppen von sechs bis acht in die Kapillarfutterfläschchen, wobei Sie die Fliegen in derselben Belohnungsgruppe zusammen halten.

Verwenden Sie einen weichen Plug, um die Männchen während des Transfers an Ort und Stelle zu halten. Sobald alle Fliegen eingesetzt sind, ersetzen Sie den Softstopfen durch den Kapillardosierstopfen. Befeuchten Sie die Stopfen, indem Sie vorsichtig fünf Milliliter Wasser auf die Oberseite jedes Stopfens geben, um ein Verschütten in das Fläschchen zu vermeiden.

Bereiten Sie die Ethanol- und Wasser-Lebensmittellösungen vor und geben Sie dann fünf Mikroliter davon auf einen Streifen Laborfolie. Lassen Sie die Lösung die Kapillare füllen, bis sie die Fünf-Mikroliter-Marke erreicht. Und klopfen Sie sie dann vorsichtig auf den Streifen, um die Lösung genau an der vormarkierten Linie zu positionieren.

Versiegeln Sie die Enden der Kapillaren, indem Sie sie in kleine Tröpfchen Mineralöl tauchen. Setzen Sie abschließend die beiden ethanolhaltigen und nicht ethanolhaltigen Kapillaren in die Adapter im Stopfen ein. Die freiliegenden Seiten sollten einen Millimeter oder weniger aus der Steckeroberfläche herausragen.

Die Öffnung für die Kapillaren in der Nähe des nassen Pfropfens zu halten, reduziert die Verdunstung und ermöglicht einen einfachen Zugang zum Futter, da Fliegen normalerweise auf den Pfropfen sitzen und auf die freiliegende Kapillare klettern, um sich zu ernähren. Bereiten Sie außerdem ein Scheinfläschchen ohne Fliegen vor, das als Kontrolle zur Beurteilung der natürlichen Verdunstung verwendet wird. Notieren Sie abschließend die relative Position der Flüssigkeit in jeder der Kapillaren in Fläschchen in Bezug auf die schwarze Linie in Millimetern.

Stellen Sie die Fläschchen für 24 Stunden in den Versuchsinkubator. Messen und notieren Sie den Flüssigkeitsstand in jeder entnommenen Kapillare in Bezug auf die schwarze Linie. Sobald das Experiment im Gange ist, tauschen Sie die Kapillare jeden Tag zu einer festgelegten Zeit aus.

Befeuchten Sie die Stopfen erneut mit zwei Millilitern Wasser und setzen Sie die Fläschchen dann wieder in den Inkubator ein. Männliche Fruchtfliegen vom Wildtyp des Stammes Canton S, die nach der Eklosion gesammelt und bis zum Alter von vier Tagen gealtert wurden, wurden über einen Zeitraum von vier Tagen auf ihre angeborene Vorliebe für den Konsum von Alkohol untersucht. Die Analyse der Mengen, die von Ethanol und nicht ethanolhaltigen Lösungen konsumiert werden, zeigt, dass die Fliegen eine signifikante Präferenz für die 15%ige Ethanol-Nahrungsquelle zeigten.

Das CAFE-Experiment wurde mit verpaarten und abgelehnten Männchen wiederholt. Beide Gruppen waren zuvor einzeln untergebracht und Weibchen ausgesetzt gewesen, die die Paarung entweder akzeptierten oder ablehnten. Bei der Einführung in Gruppen in die CAFE-Fläschchen konsumierte die abgelehnte Gruppe mehr aus den Ethanolkapillaren.

Dies deutet darauf hin, dass der wahrgenommene Mangel an Belohnung zu einer Zunahme des Belohnungsverhaltens führte. Umgekehrt erhöht eine erfolgreiche Paarung das interne Belohnungsniveau, was wiederum den Ethanolverbrauch senkt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, während des gesamten Experiments eine gut befeuchtete Umgebung aufrechtzuerhalten, wobei der Schwerpunkt auf dem Verbrauchsteil liegt, die Stopfen jeden Tag gegossen werden und die Kapillarenden in unmittelbarer Nähe der nassen Stopfen gehalten werden.