Name: Kombiniert intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie der Maus Megalosauridae Insulin-induzierte Vasodilatation und Muskel-Durchblutung zu untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Lernen Sie eine kombinierte Methode aus kontrastverstärkter Sonographie und intravitaler Mikroskopie zur Untersuchung insulininduzierter Vasodilatation und Muskel-Durchblutung bei CD57 BL6 Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Analyse mikrovaskulärer Dynamiken und trägt zum Verständnis von Insulinresistenz bei.

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Wir bedanken uns bei Ing. Duncan van Groen für die Programmierung der Bildanalyse-Software (ImageGrabber) in dieser Studie verwendet. Die Finanzierung dieser Forschung zur Verfügung gestellt worden durch einen VIDI-Zuschuss von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (Grant 016.136.372).

Alle Tierversuche wurden von den lokalen Tierpflege und Ethik-Ausschuß genehmigt. Das gesamte Protokoll von Induktion der Anästhesie in der Maus bis zum Ende der Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klemme dauert ca. 2 h.
1. mikrochirurgische Vorbereitung
<ol><li>Anästhesie und Analgesie in einer männlichen Maus mit einem Gewicht von 20-25 g, ab 14 Uhr zu induzieren oder Übernachtung Fasten mit einer intraperitonealen Injektion von Fentanyl (0,31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) und Acepromazine (6,25 mg/kg) (FMA-Anästhesie) und legen Sie es auf eine rektale Temperatur-gesteuerten homöotherm Heizkissen unterhält Körpertemperatur auf 37 ° C.</li>
	<li>Dem OP-Tisch und das Gerät mehrmals mit einer alkoholhaltigen Lösung zu desinfizieren.</li>
	<li>Legen Sie eine 27 G Nadel auf eine 10 cm lange Polyethylene-Rohr (PE-20) und befestigen Sie den Schlauch an einen 4-Wege-Connector. Stechen Sie die Nadel in die Vene Schweif und fixieren Sie es mit Gewebe Kleber Gel. Diese Kanüle wird für die Infusion von Mikroblasen, Insulin, Glukose und Anästhesie verwendet werden. Hinweis: Hinzufügen von Heparin (5 U/mL) in steriler Kochsalzlösung während der Kanülierung Prozess, spülen Sie die Rute Vene (ca. 10 µL) reduziert die Möglichkeit von verstopften Kanülen.</li>
	<li>Während der chirurgischen Eingriffen und experimentelle Protokolle aufrechterhalten Sie Anästhesie durch eine kontinuierliche intravenöse Infusion von FMA Anästhesie über die Rute Vene Kanüle mit Rate von 33.75 µL/kg/min.</li>
	<li>Legen Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben und befestigen Sie die Füße mit einem thermostabile Band um die Oberschenkel-Bereich verfügbar zu machen. Verwenden Sie eine leichte Exorotation des Hüftgelenks (Megalosauridae Pfoten nach oben) und einem 40-60°-Winkel am Kniegelenk, um die Dehnung des Muskels auf das Fach der Adduktoren des Oberschenkels zu standardisieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haare an der Leiste und Oberschenkel Bereichen bilateral mit einer Enthaarungscreme. Sammeln Sie alle lose Haare mit einem feuchten Wattestäbchen.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger unter einem Stereomikroskop und führen Sie die folgenden chirurgischen Schritte mit 10 X bis 16 X Vergrößerung.</li>
	<li>Machen Sie einen 2 cm Schnitt mit Haut-Schere, die parallel zur inguinalen Ligament, nur seitliche Bauch Krümmung (Abbildung 1). Tragen Sie Traktion auf der distalen Seite des Schnittes nach distal mit einem Bulldog-Klemme (Abbildung 1 auf). Dadurch wird das Fenster nach Bedarf anpassen und helfen, das Paraffinöl (siehe 1.12) zu halten.</li>
	<li>Das Fettgewebe von der Bauchwand zu sezieren. Um Blutungen zu vermeiden, trennen Sie vorsichtig die Fettpolster aus der Wand statt sezieren direkt über das Pad. Sanfte Traktion auf die Fettpolster in distale Richtung erleichtert den Prozess (Abbildung 1).</li>
	<li>Identifizieren der Femoral Arterie und folgen Sie ihm bis auf die ersten Hauptzweige (epigastrische Arterie und die Arterie Gracilis) (Abbildung 2). Die Gracilis-Arterie ist der erste großer Zweig der Femoral Arterie auf der Adduktor Magnus ausgeführt und läuft dann tief in den Muskel Gracilis. Die Gracilis Arterie wird für IVM verwendet werden.</li>
	<li>Identifizieren Sie die transparente tiefe Faszie für die Muskeln und Gefäße. Mit scharfen Pinzette, ziehen Sie die Faszie nach oben und schneiden Sie es mit einem Microscissor.</li>
	<li>Cover den freigelegten Muskel mit einem Tropfen (200 µL) von medizinischen Paraffinöl (Raumtemperatur, oder vorgewärmt auf 37 ° C) auf das vorbereitete Gewebe Austrocknen verhindert wird. Stellen Sie sicher, dass die Öltropfen entfernt nicht leckt. Passen Sie die Hautfalten des Schnittes mit der Bulldog-Klemme erstelle ich eine kleine Höhle um das Paraffinöl aufzunehmen, das die Schiffe badet.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger unter dem zuvor kalibrierten Mikroskop (16 X optische Vergrößerung) so, dass die Arterie Gracilis vertikal auf dem Bildschirm ist. Legen Sie das Mikroskop auf eine Kamera und Computer basierte Analysesystem, das die Gefäße Durchmesser aus dem Datensatz Bild extrahieren kann. Der Durchmesser beträgt der Abstand zwischen den beiden luminalen Seiten des Schiffes. Kontinuierliche Überwachung und Messung des Durchmessers Arterie ist wünschenswert.</li>
	<li>Legen Sie die Lichtquelle in ausreichendem Abstand (mindestens 20 cm) aus der Megalosauridae, Kopf Wärmeleitung vom Licht zu reduzieren.</li>
	<li>Die oberen kontralateralen Megalosauridae vorgewärmte Ultraschallgel Transduktion zuweisen. Legen Sie die Ultraschallsonde senkrecht zur Längsachse der Oberschenkelknochen.</li>
	<li>Stellen Sie vorsichtig den Winkel und Richtung von der Ultraschallsonde eine Querschnittsansicht des Arbeitskreises Adduktoren-Muskeln zu bekommen. Achten Sie darauf, um die Position von der Ultraschallsonde in Bezug auf die Maus, die gleichen Abbildungsebene für Basis- und Hyperinsulinemic Messungen zu halten stabil zu halten.</li>
	<li>Lassen Sie die Maus für 30 min zu stabilisieren. Der Durchmesser der Gracilis Arterie sollte vor dokumentieren die Grundlinie Durchmesser für 10 min stabil.</li>
</ol>2. Baseline und Hyperinsulinemic Messungen
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Grundlinie Gracilis Arterie Durchmesser durch das Computerprogramm für die IVM verwendet gespeichert wird.</li>
	<li>Bereiten Sie die Mikrobläschen im Voraus als beschrieben35 und zählen mit Coulter Counter zu einer Konzentration von 2,5 x 109 Bläschen/mL kurz vor dem Experiment.</li>
	<li>
Da die Mikrobläschen nur im Kontrast-Modus der Maschine Ultraschall angesehen werden können, Steuern die Parameter, die Einfluss auf das Bild Kontrast erhobenen Daten (beschrieben in 2.3.1) und Nutzung konsequent während der Akquisition.
	<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden Einstellungen auf das Ultraschallgerät: Kontrast-Verstärkung am 35 Dezibel; der Zeitgewinn Entschädigung auf OFF; Liniendichte zu hoch; Anzahl der fokalen Zonen zu breit; Sendeleistung auf 4 %; Strahlbreite Standard zu übertragen; SV-Tor zum 4; Empfindlichkeit auf 1; Beharrlichkeit auf OFF. Ebene die Position des Focal Zonen zum Zentrum der Region von Interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Speichern Sie eine kurze (5 s) Clip. Hiermit wird das Hintergrundsignal zu berechnen.</li>
	<li>Schütteln Sie das Fläschchen mit der Mikroblasen von hand, um eine homogene Suspension zu haben. Starten Sie den Microbubbles mit der Rute Vene Kanüle mit einer 5 µL/min Rate Infusion. Legen Sie die Aufguss-Rohr auf einer vibrierenden Vortex (200 X / min.) um eine homogene Suspension von Mikroblasen zu erhalten.</li>
	<li>5 min Dauerinfusion von Mikroblasen zu ermöglichen, so dass ein Steady State erreicht wird. Fahren Sie mit der Erlangung der Zeit-Intensität-Kurven der Bläschen mit der Mikroblasen Destruct Funktion (MBD) auf das Ultraschallgerät bei 5 min und 10 min nach Beginn der Infusion Mikrobläschen (Abb. 3A). Nehmen Sie die durchschnittliche Signal dieser beiden Messungen zu den Basisdaten der Perfusion.</li>
	<li>
Beginnen Sie nach Erhalt der Baseline-Daten die Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klammer als beschrieben34. Verwenden Sie die Rute Kanüle (platziert in 1.3), die Insulin und Glukose (und Anästhesie) zu verwalten.
	<ol>
<li>Kurzum, induzieren einem Hyperinsulinemic Zustand durch die Einführung eines 200 mU/kg Insulin-Bolus gefolgt durch kontinuierliche Insulin-Infusion (7,5 mU/kg/min) für 60 min. verwenden eine Variable Infusion von 20 % D-Glucose, Euglycemia beizubehalten.</li>
		<li>Glukose im Blut aus der Vene Rute alle 5 min. mit einem Glukose-Monitoring-Gerät zu beurteilen und pflegen bei 5 mM durch die Variable Glukose-Infusionsrate anpassen. Insulin-Empfindlichkeit durch Mittelung der Infusionsrate bedeuten Glukose während der letzten 30 min zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Durchmesser der Arterie Gracilis auf die gewünschten Zeiträume (z. B. bei 10, 30 und 60 min) des Beginns der Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klammer mit dem Computerprogramm dokumentiert ist.</li>
	<li>Starten Sie nach 25 min/55 min der Insulin-Klammer, oder die zweite (Hyperinsulinemic) CEUS Messung um die MBV bei 30 bzw. 60 min, bzw. zu dokumentieren. Die gleichen Schritte in 2.4 und 2.5 beschrieben. Lösen Sie und verwenden Sie den Anästhesie-Anschluss der 4-fach-Steckverbindung, die Mikrobläschen einzuflößen. Befestigen Sie das Anästhesie-Rohr nach dem Ende der Mikroblasen-Infusion.</li>
	<li>Nach Abschluss der IVM und die CEUS Messungen 60 min nach dem Start der Insulin-Infusion Blut entziehen der Maus durch ein Herz durchbohren Verfahren zur späteren Analyse. Dies wird auch die Maus einschläfern. Sorgfältig sezieren Gracilis und Femoral Arterien und für weitere gewünschte Experimente zu speichern ( z.B.Western Blot, Immunohistochemistry, ex Vivo Druck Myographie experimentiert36,37, 38).</li>
</ol>(3) offline-Analyse

Hinweis: Die Analysen der IVM und CEUS Messungen sollte durch eine verblindete Ermittler offline durchgeführt werden. CEUS bietet die Möglichkeit, die Mikrozirkulation von größeren Schiffen zu unterscheiden durch die Mikrobläschen von hoher Intensität Ultraschall-Wellen mit der MBD-Funktion vorübergehend zu zerstören. Das Signal (gemessen in beliebigen Einheiten (a.u)) in größeren Gefäßen ist schneller als in der Mikrozirkulation wegen der Mikroblasen-Geschwindigkeit in die entsprechenden Gefäße wiederhergestellt.
<ol><li>Verwenden Sie eine offline-Workstation oder die Software auf das Ultraschallgerät Analysen zu tun.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Region von Interessen (ROI), die Mikrozirkulation aufzunehmen. Zeichnen Sie einen separaten ROI um die größeren femoralen Gefäße (Abbildung 3A) erweitert.</li>
	<li>Duplizieren Sie die Mikrozirkulation und größere Schiffe ROIs für den Hintergrund, Grundlinie und Hyperinsulinemic Messungen mithilfe von ROI-Copy-Funktion in die Software eingebaut.</li>
	<li>Subtrahieren Sie die Intensität Signal Hintergrundmessung von der Grundlinie und der Hyperinsulinemic Messungen.</li>
	<li>Teilen Sie die Intensität Signal der Mikrozirkulation durch die Intensität Signal der femoralen Gefäße. Baseline und Hyperinsulinemic MBVs können nun verglichen werden.</li>
</ol>

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</ol>

Visuelle Sonics Inc. bedeckt die open-Access-Gebühren, während die Struktur und den Inhalt des Artikels die volle Verantwortung der Autoren blieben.

Wir entwickelten eine Technik, um gleichzeitig Insulin vaskuläre Aktionen auf die größeren Arterien (mit IVM) und die Skelettmuskulatur Mikrozirkulation (mit CEUS) schätzen. Die entscheidenden Schritte für erfolgreiche und zuverlässige Messungen sind: 1) richtig aussetzen der Gracilis Arterie ohne Blutungen; (2) verhindert Auslaufen von Baden die Arterie Paraffinöl; (3), die einen patent venösen Zugang (Tail Vene Kanüle) für die Infusion von vasoaktive Substanzen (Insulin) und Kontrastmittel (Microbubbles).
Die Studie der mikrovaskulären Dysfunktion im Muskel gewinnt Aufmerksamkeit im Zusammenhang mit Übergewicht und Insulin Resistenz14,25,39,40. Die negative Auswirkungen von Übergewicht und Insulinresistenz auf Gefäßfunktion manifestiert sich auf verschiedenen Ebenen der vaskuläre Struktur. Von nun an müssen verschiedene Ansätze, diese Änderungen zu beurteilen. Die kombinierte Verwendung der IVM und CEUS Techniken in der gleichen Maus ist ein leistungsstarkes Tool zur Quantifizierung der Insulin Wirkung auf verschiedenen Ebenen des Gefäßsystems. IVM ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantitative Analyse der Widerstand Arterie und CEUS ermöglicht eine Beurteilung der Insulin-induzierte Veränderungen im Muskel-Durchblutung.
Das Adduktoren-Muskeln Fach zu studieren, hat mehrere Vorteile. Die Arterien sind leicht zugänglich und die oberflächliche Art des Schnittes macht es möglich, der Hautschnitt mit 5.0 sterile resorbierbare Naht zu schließen, nachdem das Experiment beendet ist. Die Tiere waren subkutan injiziert mit Buprenorphin nach den Experimenten als Analgetikum bei einer Dosis von 0,1 mg/kg und durfte in einer warmen Umgebung zu erholen. Die Mäuse das Verfahren sehr gut vertragen und wir erlebten kein Verlust von Tieren noch Infektionen die Megalosauridae in mehr als 35 Tiere untersucht. Dies macht es möglich, Follow-up oder die Tiere in einer longitudinal Mode zu studieren. In diesen Experimenten verwendeten Tiere wurden jedoch betäubt mit 1,8 % inhaliert Isofluran ausgewogen mit Sauerstoff fließt bei 0,4 L/min aber eine Anästhesie-Maske. Im Gegensatz zu Isoflurane Narkose41,42stört die FMA Anästhesie nicht periphere Insulinsensitivität. Ein Plan für die Zukunft ist zu studieren, wie gut die Mäuse von FMA Narkose zu erholen.
Das Adduktoren-Muskeln Fach ist auch nützlich, da verschiedene vasoaktive Substanzen, die Vermittlung von lokalen und nachgelagerte vaskuläre Effekte können ausgewertet werden. Beispielsweise ist die topische Anwendung dieser Verbindungen auf das Zielgewebe machbar mit superfusion Techniken28 oder chirurgische Manipulation und Implantation von medikamentenfreisetzenden Bündchen rund um die Schiffe43. Darüber hinaus kann die Gracilis Arterie isoliert und studierte in der Druck-Myograph. Unsere Fraktion und andere sammelten sich erhebliche experimentelle Beweise mit der Druck-Myograph dokumentieren die Auswirkungen von Insulin und andere vasoaktive Substanzen auf diese Arterie ex Vivo36,37,38.
Eine Einschränkung, die die Verwendung der IVM-Technik ist die chirurgische Exposition des Muskels und Anwendung von Paraffinöl, die Gefäße zu stabilisieren. Es ist nicht klar, ob diese Aktionen die native Umgebung der Arterie auswirken. Abbildung 3A zeigt jedoch, dass die Grundlinie Durchmesser der Gracilis Arterie in Paraffinöl gebadet nicht wesentlich ändert. Es hat auch gezeigt, dass Mineralöl erfolgreich die Diffusion von Sauerstoff, schützt das Gewebe vor Hyperoxic Bedingungen44hemmt. Darüber hinaus hilft das Öl, um die Variation in der Baseline-Durchmesser der Arterien zu reduzieren. Deshalb befürworten wir Paraffin-Öl zu verwenden und die Vorbereitung mindestens 30 min. ruhen lassen. Der Hinweis führte die Verwendung von gepufferten Kochsalzlösung statt Öl – oder kein Öl überhaupt – in sehr Variablen Durchmessern und Verengung des Gefäßes (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus am Ende des Experiments, wir isoliert Gracilis Arterien - gebadet in Paraffin-Öl - und ihre Reaktivität in der Druck-Myograph getestet ex Vivo. Paraffin Öl gebadet Arterien reagierte ähnlich zur Steuerung der Arterien, wenn Sie mit Insulin und Acetylcholin (ein Vasodilatator) angeregt (Daten nicht gezeigt). Die konsequente Insulin-induzierte Vasodilatation zeigt deutlich, dass die IVM-Protokoll in dieser Studie beschriebenen zuverlässige Ergebnisse liefert.
Der Vorteil der Anwendung beider Techniken in der gleichen Maus überwindet einige der immanente Grenzen einer Technik von den anderen: CEUS schätzt MBV in ungestörten Muskel in-vivo, aber einzelne Schiffe nicht zu sehen; IVM macht es möglich, einzelne Schiffe zu sehen, wenn auch es nicht, MBV abschätzen kann. Ein Plan für die Zukunft ist IVM Mikroskopie des Cremaster-Muskel in Kombination mit CEUS Adduktor auf der kontralateralen Seite nutzen. Diese Änderung kann eine Schätzung der MBV (mit CEUS) und einen direkten optischen Zugang zu den Kapillaren (mit IVM) bereitstellen. Das Protokoll kann weiter geändert werden; der 4-Wege-Connector für die Heck-Kanüle verwendet umschaltbar auf einen 5-Wege-Connector. Dadurch können wir vermeiden, trennen die Anästhesie-Röhre während der Durchführung der zweiten CEUS-Messung (beschrieben unter Punkt 2.9). Nach unserer Erfahrung vertragen die Mäuse das aktuelle Protokoll gut. Eine weitere Modifikation, die dieses Protokoll vorgenommen werden kann, ist die Insulin Klemme verwendet. Wir verwendeten 7,5 mU/kg/min Klammer-Rate die supra-physiologischen betrachtet wird. Je nach Studie kann eine niedrigere Insulin Klemme Rate (z. B. 3 mU/kg/min) verwendet werden.
Während wir die beschriebene Protokoll zuverlässig gefunden haben, gibt es bestimmte Einschränkungen, die Aufmerksamkeit erfordern. Es gibt Situationen, wenn die Messung des arteriellen Durchmessers nicht optimal ist. Durchführung der vorbereitenden Maßnahmen erfordert einige Erfahrung mit dem Modell. Es ist wichtig, dass das Paraffinöl aus der Umgebung des Schiffes nicht leckt, stören das Schiff wird mit neuem Öl ergänzen und ändern Sie den Durchmesser, so dass es nötig ist, dass die Arterie ein weiteres 30 min ruhen lassen. Darüber hinaus war die Reflexion des Lichts auf der Oberfläche des Paraffin-Öl (beschrieben im Schritt 1.14 des Protokolls) manchmal zu hell, macht es schwierig, die Arterie anzeigen. Dies kann durch die Leitung der Lichtquelle, so dass das Licht in einem Winkel zu Paraffinöl Oberfläche und parallel zur Arterie fällt entgegengewirkt werden.
Die Kombination von IVM und CEUS Techniken, die in dieser Studie beschriebenen abschließend ermöglicht es, unterschiedliche Wirkung von Insulin auf verschiedenen Ebenen des Gefäßsystems zu quantifizieren. IVM der Gracilis Arterie gibt Einblick in die vorgelagerten Gefäßveränderungen zur nachgelagerten mikrovaskulären Perfusion mit CEUS gemessen. Wir setzen uns für die Kombination von mehreren experimentellen Techniken in der gleichen Maus besser beurteilen die Gefäßfunktion.

In Reaktion auf einen Anstieg des Blutzuckerspiegels sondert die Bauchspeicheldrüse Insulin in die Blutbahn, wo es schnell an seine Zielgewebe wie Skelettmuskel, über Widerstand Arterien und Kapillaren verteilt wird. Skelettmuskulatur ist verantwortlich für ~ 80 % der postprandialen Glukose Aufnahme1. Die Lieferung von Insulin an der Skelettmuskulatur Interstitium hat sich gezeigt, zu einer Rate, die Begrenzung der Schritt für die metabolische Aktionen von Insulin, die Glukose zur Verfügung2,3,4zu fördern. Innerhalb von 10-15 min erhöht Insulin Kapillare Blutvolumen (mikrovaskuläre Rekrutierung), ein Effekt, der Auftritt vor insgesamt Blutfluss5,6 erhöht. Mikrovaskuläre Rekrutierung erweitert die endotheliale Oberfläche für Austausch von Nährstoffen (und Insulin)7,8verfügbar. Insulin-vermittelte mikrovaskuläre Rekrutierung vorausgeht und ist unabhängig von Änderungen im skelettartigen Muskel Glukose Aufnahme8,9zugeordnet. Die Wirkung des Insulins auf das Gefäßsystem hat "vaskuläre Insulin Sensitivity" bezeichnet worden.
Es hat sich gezeigt, dass die Insulin-vermittelte mikrovaskuläre Rekrutierung und Insulin-induzierte Vasodilatation bei adipösen Zucker Ratten10,11beeinträchtigt sind. Darüber hinaus anzeigen schlanke Mäuse mit reduzierte Kapillardichte Muskel Insulin Resistenz12 In ihrer einflussreichen Arbeit zeigten Kubota Et Al. , dass beeinträchtigte Insulin Signalisierung in Endothelzellen in Insulin-induzierte mikrovaskuläre Rekrutierung, bedingt die Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur durch ca. 40 %13reduziert. Diese Anomalien in mikrovaskuläre Funktion auftreten nicht nur Muskeln, sondern auch in mehreren anderen Geweben und Organen wie Herz, Netzhaut und Niere14,15,16. Diese Beispiele und andere Studien17,18,19,20 legen nahe, dass vaskuläre Wirkung von Insulin ein wichtiges Instrument in der (Patho) Physiologie der Insulin-Resistenz sind und seine Komplikationen.
Zwar gibt es deutliche Hinweise, dass Insulin erhöht die mikrovaskuläre Blutvolumen (MBV) im Skelettmuskel5,6, sind die Mechanismen, mit denen dies geschieht, nicht vollständig verstanden9. Endothel-abhängige Vasodilatation ist in vielen Aspekten der vaskulären Insulin Empfindlichkeit21,22,23 auf verschiedenen Ebenen des Gefäßsystems unerlässlich. Vaskuläre Insulin-Empfindlichkeit kann manifestiert durch Insulin-induzierte Relaxation des Widerstand Arterien und durch Lockerung der Pre-Kapillare Arteriolen perfundierten mikrovaskuläre Austausch Fläche7,24zu erhöhen, 25.
Intravitalen Mikroskopie (IVM) hat in einer Vielzahl von Gewebe Vorbereitungen einschließlich Hautfalte Kammern der Maus Dorsum26, Mesenterium der Maus und Ratte27, Modelle der Extremität Ischämie in der Maus-28 und der Hamster Wange Beutel verwendet worden 29. Kontrast-verstärkte Sonographie (CEUS) ist ein weiteres bildgebendes Verfahren, die Beurteilung der Mikrozirkulation in kardialen30 sowie Skelettmuskulatur31ermöglicht. Es nutzt Inertgas gefüllten Mikrobläschen Verhalten rheologisch als rote Blutkörperchen und bleiben vollständig innerhalb der vaskulären Lumen. Diese Mikrobläschen sind intravenös infundiert mit einer konstanten Rate, einen stabilen Zustand zu erreichen. Eine hochenergetische Ultraschallwelle kann dann verwendet werden, die Mikrobläschen zu zerstören. Die Mikrobläschen Nachschub Geschwindigkeit in der Region of Interest (ROI) stellt Strömungsgeschwindigkeit (MFV). Die gesamte Signalintensität kontrastreiches Bild repräsentiert die MBV. CEUS wiederholt (auch beim Menschen) durchgeführt werden kann und es hat das Verständnis der vaskuläre Dysfunktion, das auftritt, in Insulin-beständigen Staaten (in Barrett Et Al. diskutiert fortgeschrittene ( 32).
In der aktuellen Studie beschreiben wir eine neue Technik zur Regulierung der Muskel Perfusion durch gleichzeitige Nutzung von IVM und CEUS zu studieren. Hier konzentrieren wir uns auf Insulin vaskuläre Aktionen im Fach der Maus Megalosauridae Adduktoren. Dieses Fach ist einer der größten skelettartiger Muskel-Gruppen in der Maus, Studien der lokalen Glukoseaufnahme in einem repräsentativen Muskel. Dieses Fach ist ideal für IVM, da die Herstellung und Visualisierung der Arterien leicht zugänglich durch eine standardisierte Operationsverfahren28 sind. Darüber hinaus haben unsere eigene Gruppe und andere gezeigt, dass CEUS in diesem Fach33,34verwendet werden kann.
Ein Vorteil der kombinierten IVM und CEUS-Technik ist die Möglichkeit, Insulin Wirkung auf der Ebene der größeren Arteriolen (Feed oder Widerstand Arterien) und die Mikrozirkulation (Kapillare Betten) in den gleichen Muskel-Gruppe. Darüber hinaus bietet die gleichzeitige Anwendung der beiden Methoden einen Einblick in die zeitliche Wirkung des Insulins auf den Ebenen der Widerstand Arterien und Mikrozirkulation. Dies kombiniert IVM und CEUS Technik kann auch in anderen Bereichen vaskuläre Biologie umgesetzt werden. Beispielsweise kann die Rolle von verschiedenen Proteinen und bestimmten pathophysiologischen Bedingungen beeinflussen das Endothel mit Ko-Modelle untersucht werden. Darüber hinaus können beide Techniken in einer Maus zu mehreren Zeitpunkten reduzieren den Zeit- und Kostenaufwand der Forschung verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Charles River</td><td></td><td>Die verwendeten Mäuse wurden mit dem hauseigenen hochauflösenden</td></tr><tr><td>Ultraschallsystem Vevo 2100</td><td>von VisualSonics inc. gezüchtet.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 nichtlinearer Wandler</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Software</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgel (Aquasonic 100, farblos)</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009</td><td>Ultraschallgel zur Übertragung der Ultraschallwellen</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR international</td><td>58815-234</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen&nbsp;</td><td>Pantlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Precision Xceed&nbsp;</td><td>Abbott</td><td></td><td>Zur Messung des Blutzuckerspiegels während der hyperinsulinämisch-euglykämischen Klemme</td></tr><tr><td>Insulin Novorapid</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukosemonohydrat&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>1083421000</td><td></td></tr><tr><td>Gepufferte Kochsalzlösung</td><td>B. Braun</td><td>152118062</td><td></td></tr><tr><td>PE-20 medizinischer Schlauch</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427405</td><td></td></tr><tr><td>Nadel, 27 Gauge&nbsp;</td><td>Becton-Dickinson & Co</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Medizinisches Klebeband</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallsondenhalter</td><td></td><td></td><td>Eingebaute hauseigene</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td></td><td></td><td>Mehrere gleichwertige</td></tr><tr><td>Creme-Enthaarer</td><td></td><td></td><td>Mehrere gleichwertige</td></tr><tr><td>Gel-Gewebekleber</td><td>Derma+flex</td><td>GA30005-2222</td><td></td></tr><tr><td>Infusionspumpe</td><td>Harvard Apparatur</td><td>Harvard Apparatus PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Kleine feine gerade Schere</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Basler</td><td>scA1390-17gc</td><td></td></tr><tr><td>Image Grabber Programm</td><td>Eingebautes hauseigenes</td><td></td><td>Bilderfassungssystem</td></tr><tr><td>Timer VWR</td><td></td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen, 1 mL</td><td>Fisher</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Lichtquelle, faseroptisch</td><td>Schott</td><td>KL1500</td><td>Idealerweise mit verstellbaren Armen</td></tr><tr><td>Paraffinöl</td><td></td><td></td><td>Mehrfach gleichwertig</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td><>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Mikroblasen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365C</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylenstearat&nbsp;</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>p3440</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorbutangas</td><td>F2 Chemikalien</td><td>C4F10(g)</td><td></td></tr><tr><td>Decon FS200 Ultraschallbad&nbsp;</td><td>Decon Ultrasonics Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix&nbsp;</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515370-0810</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Scharzähler</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kombiniert intravitalen mikroskopie und kontrast-verstärkte sonographie der maus megalosauridae insulin-induzierte vasodilatation und muskel-durchblutung zu untersuchen

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Es wurde nachgewiesen, dass Insulin die vaskuläre Aktionen zur Regulierung von Insulin-Empfindlichkeit beitragen. Insulin Auswirkungen auf die Durchblutung der Muskulatur regulieren postprandialen Lieferung von Nährstoffen und Hormonen zu Insulin-empfindlichen Geweben. Hier beschreiben wir eine Technik zur intravitalen Mikroskopie (IVM) und Kontrast-verstärkte Sonographie (CEUS) der Adduktoren Abteil des Maus Megalosauridae gleichzeitig Muskel Widerstand Arterien zu visualisieren und Durchblutung des kombiniert die Mikrozirkulation in-vivo. Gleichzeitig bewerten Insulin Wirkung auf mehreren Ebenen der vaskuläre Struktur ist wichtig, Beziehungen zwischen Insulin mehrere vasoaktive Effekte und Muskel-Durchblutung zu studieren. Versuche in dieser Studie wurden an Mäusen durchgeführt. Erstens ist die Rute Vene Kanüle zur Infusion von Anästhesie, vasoaktive Substanzen und Ultraschall-Kontrastmittel (Lipid-gekapselte Mikrobläschen) eingeführt. Zweitens wird ein kleiner Einschnitt in der Leistengegend gemacht, den arteriellen Baum des Fachs Adduktoren-Muskeln aussetzen. Die Ultraschallsonde wird dann am kontralateralen oberen Megalosauridae die Muskeln im Querschnitt anzeigen positioniert. Um grundlegende Parameter zu bewerten, bemisst sich des arteriellen Durchmessers und Mikrobläschen werden anschließend mit einer konstanten Rate abzuschätzen Muskeldurchblutung und mikrovaskuläre Blutvolumen (MBV) infundiert. Wenn vor und während einer Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klemme angewendet, können kombinierte IVM und CEUS Bewertung der Insulin-induzierte Veränderungen des arteriellen Durchmesser, mikrovaskuläre Muskel Perfusion und Ganzkörper-Insulin-Empfindlichkeit. Darüber hinaus kann die zeitliche Beziehung zwischen Antworten der Mikrozirkulation und der Widerstand Arterien auf Insulin quantifiziert werden. Es ist auch möglich, Follow-up der Mäuse längs in der Zeit, so dass es ein wertvolles Instrument, um Veränderungen in der Gefäß- und Ganzkörper-Insulinempfindlichkeit zu studieren.

Glukose-Infusionsrate während der Hyperinsulinemic-Euglycemic-Klemme (Insulin-Empfindlichkeit) war 180.21 ± 19,81 µmol/kg/min. lokale Anwendung von Paraffinöl auf das Adduktoren-Muskeln Fach, das Schiff zu stabilisieren änderte nichts an den durchschnittlichen Baseline-Durchmesser der Arterien (73,6 ± 29,0 µm vs. 68,8 ± 17,9 µm; p = 0,58) aber ermöglichte eine Reduzierung der Variation der Tiere untersucht (Abb. 4A). Insulin erhöht konsequent Gracilis Arterie Durchmesser (von 14,58 ± 6,2 % bei 60 min; N = 9) die war signifikant unterschiedlich (p &lt; 0,0001) aus dem Durchmesser Wechsel verursacht durch Kochsalzlösung Infusion (-6,3 ± 4,9 %; N = 6). Insulin-induzierte Vasodilatation war spürbar nach 10 min (10,09 ± 5,1 %; p = 0,002) und etwa 95 % seiner maximalen dilatorisch Kapazität nach 30 min zu erreichen.
Verwendung von CEUS, Insulin konsequent erhöhte Muskelmasse MBV (Abb. 5A) von 33,5 % (± 31.04 %, N = 7; p = 0,0009) im Vergleich zu Kochsalzlösung Infusion (-10.63 ± 27,87 %, N = 6) (Abb. 5 b). Die vorgelegten Daten sind die Signalintensitäten des Muskels MBV geteilt durch, die in der femoralen Gefäße. Dies reduziert die experimentelle Variation zwischen verschiedenen Messungen und zwischen verschiedenen Mäusen (Daten nicht gezeigt). Die Signalintensität in der femoralen Gefäße entspricht linear mit der Konzentration von Mikroblasen in der Zirkulation (Abbildung 3). Korrektur der femoralen Gefäße Signal theoretisch korrigiert für Konzentrationsunterschieden von Mikroblasen verwendet (Abbildung 3D). Daten werden in diesem Abschnitt als ± Standardabweichung bedeuten dargestellt.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig1.jpg"> Abbildung 1: Chirurgische Exposition der Adduktoren Abteil des der Megalosauridae. (A) ein Einschnitt erfolgt an der Leiste, parallel zur Richtung inguinalen Ligament. (B) sanfte Traktion auf die Fettpolster in den distalen Richtungen (schwarze Pfeile) präsentieren das Bindegewebe (*) zwischen der Fettpolster und der Bauchwand. (C) die Haut Falten des Schnittes können eingestellt werden, mit der Bulldog-Klemme erstelle ich eine kleine Höhle um das Paraffinöl aufzunehmen, das die Schiffe badet. (D) die Ultraschall-Sonde befindet sich auf der kontralateralen oberen Megalosauridae, nachdem die vorbereitete Gracilis Arterie mit einem kalibrierten Mikroskop betrachtet wird. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig2.jpg"> Abbildung 2: Intravitalen Mikroskopie der Maus Megalosauridae. Die Femoral Arterie (A) ergibt sich die epigastrischen Arterie (B) und der Gracilis Arterie (C) verläuft über den Adduktoren-Muskel-Gruppe (D). Die Gracilis Arterie dient der IVM mit einem kalibrierten Mikroskop. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig3.jpg"> Abbildung 3: Signal Intensität der Kontrast verbessert Ultraschall in Blood mikrovaskuläre Muskelvolumen und femoralen Gefäße. (A) Blick auf die nichtlinearen Kontrast imaging-Modus der digital imaging Plattform während der Mikroblasen konstante Infusion in einer männlichen Maus obere Megalosauridae. Rechts: zwei ROIs werden gezeichnet, um den Muskel MBV und femoralen Gefäße darzustellen. Nur die oberflächliche Teil des Adduktoren-Muskeln Fach enthalten ist in der ROI als Signal Intensität nimmt mit Tiefe. Links: Zeit-Intensitätskurve aus dem Muskel MBV ROI. Vertikale Linien repräsentieren die Zerstörung von Mikroblasen (MBD) mit hohen Energiewellen. Unmittelbar nach der MBD ist kein Kontrastmittel in der Abbildungsebene beginnt die schrittweise mit Mikroblasen zu füllen. Nach 10-15 s wurde der Höhepunkt der Kontrastverstärkung erreicht. (B-D) Nachdem ein stationäres Signal erreicht wurde, verdoppelte sich die Infusionsrate von 2,5 x 109 Bläschen/mL (5, 10 oder 20 µL/min). Signalintensität von muscle MBV (B) und femoralen Gefäße (C) parallel die Verdoppelung der Mikroblasen Konzentration in den Blutkreislauf. (D) Korrektur Muskel MBV für femoralen Gefäße Signal die Variabilität Signalintensität, verursacht durch verschiedene Mikroblasen Konzentrationen entfernt (N = 9;-Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig4.jpg"> Abbildung 4: Intravitalen Mikroskopie Messungen der Gracilis Arterie. (A) Paraffinöl verringert die Variante der Gracilis Arterien von verschiedenen Tieren (die 29,0 µm ohne Paraffin Vs 17,9 µm ist nach dem Auftragen des Öls) unter Beibehaltung des durchschnittlichen Ausgangswert Durchmessers stabil (73,6 µm vs. 68,8 µm; p = 0,58). (B) arterielle Durchmesser bei Studienbeginn und nach 60 min. von Insulin oder Kochsalzlösung Infusionen. Insulin nach 60 min Infusion konsequent die Gracilis Arterie geweitet (p &lt; 0,0001) im Vergleich zu Kochsalzlösung Infusion. (C) Insulin-induzierte Vasodilatation tritt bei 10 min nach Beginn der Infusion (p = 0,002) und erreicht 95 % der maximal bei 30 min. Fehlerbalken repräsentieren Standardabweichung; ungepaarte Student T-Test wird für Statistiken verwendet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig5.jpg"> Abbildung 5: Mikrovaskuläre Blut-Volumen-Messungen mit Kontrast-verstärkte Sonographie von Adduktoren-Muskeln Abteil des Maus Megalosauridae. (A) Insulin führte eine konsequente Erhöhung der MBV 30 min nach dem Start der Insulin-Infusion. (B) die Differenz zwischen der Hyperinsulinemic und der Baseline-Messungen (MBV ändern) wird als die Insulin-vermittelte mikrovaskuläre Rekrutierung bezeichnet. Insulin induziert eine 33,5 % (± 31.04 %, p = 0,016; N = 7) mikrovaskuläre Einstellung gegenüber Kochsalzlösung Infusion (-10.63 ± 27,87 %, N = 6). Fehler-Balken stehen für Standardabweichung; ungepaarte Student T-Test wird für Statistiken verwendet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Insulin-induzierte Vasodilatation regelt die Durchblutung der Muskeln und erhöht die mikrovaskuläre Fläche (mikrovaskuläre Rekrutierung) verfügbar für gelöste Austausch zwischen Blut und Gewebe Interstitium. Kombinierte intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie wird präsentiert, um gleichzeitig Insulinwirkung auf größere Schiffe und die Mikrozirkulation bewerten in-vivo.

Kombiniert intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie der Maus Megalosauridae Insulin-induzierte Vasodilatation und Muskel-Durchblutung zu untersuchen

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Das übergeordnete Ziel dieser kombinierten kontrastmittelverstärkten Sonographie- und Intravitalmikroskopietechnik ist es, gleichzeitig muskelresistente Arterien sichtbar zu machen und die Mikrozirkulationsperfusion der Skelettmuskulatur in vivo zu untersuchen. Diese Methode hilft bei der Beantwortung zentraler Fragen in den Bereichen Typ-2-Diabetes und Adipositas zur Regulation der Insulinsensitivität und des Organblutflusses. Rüsten Sie am Tag des Eingriffs nach der Desinfektion des Operationsbereichs und der Ausrüstung mit einer Lösung auf Alkoholbasis ein 10 Zentimeter langes Stück PE20-Schlauch mit einer 27-Gauge-Nadel aus und befestigen Sie den Schlauch an einem Vier-Wege-Anschluss.Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene einer 20 bis 25 Gramm schweren, in anästhesierten CD57 BL6 männlichen Maus ein. Und verwenden Sie Gewebehaftgel, um die Nadel am Hautgewebe zu befestigen. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage und fixieren Sie die Füße mit thermostabilem Klebeband, wodurch der Bereich des Oberschenkels freigelegt wird.Mit einer leichten Exo-Rotation des Hüftgelenks zeigen Sie die Pfoten der hinteren Gliedmaßen nach oben, wobei die Knie in einem Winkel von 40 bis 60 Grad stehen, um die Dehnung des Muskels am Adduktorenkompartiment des Oberschenkels zu standardisieren. Verwende eine Enthaarungscreme, um die Haare in der Leistengegend und im oberen Oberschenkelbereich beidseitig zu entfernen, und sammle alle losen Haare mit einem feuchten Wattestäbchen. Platzieren Sie dann die Maus unter einem Stereomikroskop mit einer 10- bis 16-fachen Vergrößerung und machen Sie einen zwei Zentimeter langen Schnitt parallel zum Leistenband, direkt lateral zur Bauchkrümmung.Es ist wichtig, die Platzierung des Hautschnitts zu üben, der klein genug geschnitten werden sollte, damit die perifemorale Substanz nicht austritt, aber groß genug, dass das Gefäßsystem sichtbar ist. Üben Sie mit einer Bulldoggenklemme eine Traktion auf die distale Seite des Schnitts aus, präparieren Sie dann das Fettgewebe von der Bauchdecke weg, indem Sie das Fettpolster vorsichtig in distaler Richtung von der Wand trennen, anstatt direkt durch das Polster zu präparieren, um Blutungen zu vermeiden. Identifizieren Sie die Oberschenkelarterie, indem Sie dem Gefäß bis zu den Arteria epigastrica und gracilis und der transparenten tiefen Faszie folgen, die die Muskeln und Gefäße bedeckt.Ziehen Sie die Faszie mit einer scharfen Pinzette nach oben und schneiden Sie das Gewebe mit einer Mikroschere ab. Bedecken Sie dann den freiliegenden Muskel mit einem 200-Mikroliter-Tropfen Paraffinöl, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern, und ordnen Sie mit der Bulldoggenklemme die Hautfalten des Schnitts so an, dass ein kleiner Hohlraum für das Halten des Öls entsteht, das die Gefäße badet. Stellen Sie nun die Maus so ein, dass die Arteria gracilis mit einer 16-fachen Vergrößerung senkrecht auf dem Computerbildschirm steht, und platzieren Sie eine Lichtquelle in einem Abstand von mindestens 20 Zentimetern zur hinteren Extremität, um die Wärmeleitung des Lichts zu reduzieren.Tragen Sie vorgewärmtes Ultraschalltransduktionsgel auf die obere kontralaterale Hintergliedmaße auf und platzieren Sie die Ultraschallsonde senkrecht zur Längsachse des Oberschenkelknochens. Passen Sie den Winkel und die Richtung der Ultraschallsonde sorgfältig an, um einen Querschnitt durch die Adduktorenmuskelgruppe zu erhalten, und achten Sie darauf, die Position der Sonde stabil zu halten, um die gleiche Bildgebungsebene für die Basislinien- und hyperinsulinämischen Messungen beizubehalten. Die Platzierung der Ultraschallsonde sollte so standardisiert werden, dass bei allen Mäusen derselbe Teil der oberen Hintergliedmaße untersucht wird, wobei sich die Sonde für die basale und hyperinsulinämische Messung in der gleichen Position befindet.Nachdem Sie die Ultraschallsonde richtig platziert und die Arteria gracilis erfolgreich für die Messungen vorbereitet haben, lassen Sie die Mäuse 30 Minuten lang stabilisieren. Fahren Sie nach einer 30-minütigen Stabilisierungsphase mit den Basismessungen fort. Messen und speichern Sie den Basisdurchmesser der Arteria gracilis.Da die Mikrobläschen nur im Kontrastmodus des Ultraschallgeräts betrachtet werden können, stellen Sie die entsprechenden Parameter am Bildgebungssystem für die Beurteilung der Mikrobläschen ein. Richten Sie die Position der Fokuszonen auf die Mitte des interessierenden Bereichs aus und speichern Sie einen Fünf-Sekunden-Clip für die Berechnung des Hintergrundsignals. Richten Sie die Mikrobläschen auf eine 2,5 mal 10 bis 9 Blasen pro Milliliter ein und schütteln Sie das Fläschchen mit den Mikrobläschen manuell, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten.Beginnen Sie mit der Infusion der Mikrobläschen über die Schwanzvenenkanüle mit einer Geschwindigkeit von fünf Mikrolitern pro Minute und halten Sie den Infusionsschlauch auf einem vibrierenden Wirbel, um eine gleichmäßige Suspension der Mikrobläschen aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie nach fünf Minuten kontinuierlicher Infusion die Mikrobläschen-Zerstörungsfunktion, um Zeitintensitätskurven der Blasen nach fünf und 10 Minuten zu Beginn der Mikroblaseninfusion zu erstellen. Bestimmen Sie alle fünf Minuten den Blutzucker aus der Schwanzvene.Nachdem Sie die Ausgangsdaten erhalten haben, beginnen Sie mit der hyperinsulinämisch-euglykämischen Klemme mit der Schwanzkanüle, um 200 Millieinheiten pro Kilogramm Insulinbolus zu verabreichen. Halten Sie eine kontinuierliche Insulininfusion von 7,5 Millieinheiten pro Kilogramm pro Minute für 60 Minuten aufrecht. Die serielle Überwachung des Blutzuckerspiegels sollte in Blutstropfen durchgeführt werden, die aus der Schwanzspitze entnommen werden, wie oben gezeigt.Verwenden Sie eine variable Infusion von 20%DE Glukose, um die Euglykämie aufrechtzuerhalten. Messen Sie mit der Bildgebungssoftware den Durchmesser der Arteria gracilis zu den gewünschten Zeitpunkten nach Beginn der hyperinsulinämischen euglykämischen Klemme. Nach 25 und/oder 55 Minuten beginnen Sie mit der zweiten hyperinsulinämischen kontrastverstärkenden Sonographiemessung, um das mikrovaskuläre Blutvolumen nach 30 bzw. 60 Minuten zu überwachen, wie gerade unter Verwendung des Anästhesieports zur Infusion der Mikrobläschen gezeigt.Wie diese Daten zeigen, stabilisiert die lokale Anwendung von Paraffinöl auf das Adduktorenmuskelkompartiment das Gefäß, ohne den durchschnittlichen Ausgangsdurchmesser der Arterien zu verändern, und trägt dazu bei, die Variation zwischen den getesteten Tieren zu reduzieren. Die Insulininfusion erhöht den Durchmesser der Arteria gracilis im Vergleich zu den durch die Kochsalzinfusion induzierten Durchmesseränderungen, wobei eine insulininduzierte Vasodilatation nach 10 Minuten und eine maximale Dilatationskapazität von etwa 95 % nach 30 Minuten erkennbar ist. Mit der kontrastmittelverstärkten Sonographie erhöht Insulin im Vergleich zur Kochsalzinfusion auch konsequent das mikrovaskuläre Blutvolumen der Muskeln.Die Signalintensität in den Femurgefäßen entspricht linear der Konzentration der Mikrobläschen im Blutkreislauf, mit Anpassungen im Oberschenkelgefäßsignal, die theoretisch Unterschiede in der Konzentration der verwendeten Mikrobläschen korrigieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, frisch zubereitete Reagenzien und Mikrobläschen zu verwenden und die Maus 30 Minuten lang unter kontinuierlicher Anästhesie stabilisieren zu lassen, bevor die experimentellen Messungen durchgeführt werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können neue Medikamente getestet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Wirkung eine neue vasoaktive Komponente auf das Gefäßsystem hat. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Wissenschaftler auf dem Gebiet der Gefäßbiologie geebnet, um die Auswirkungen neuer Behandlungen und die Veränderung des Interesses an Norco-Mäusen zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie gleichzeitig den Durchmesser muskelresistenter Arterien untersuchen und die Durchblutung der Hintergliedmaßen der Maus in vivo beurteilen können, indem Sie Intravitalmikroskopie und kontrastmittelverstärkte Sonographie verwenden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine neue vielseitige Methode zur Beobachtung der Mikrozirkulation wird vorgestellt. Es gilt als geeignet für eine langfristige Beobachtung und für die Kombination mit pharmacophysiological oder molekularbiologische Eingriffe.

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

Das chirurgische Verfahren zur Induktion einer einseitigen Hinterlauf Ischämie nachgewiesen wird, mit der Bestätigung der Ischämie durch Laser-Doppler-Perfusion.

Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie

In diesem Video beschreiben wir die intravitale Bildgebung einer Bauchspeicheldrüse einer Maus durch ein stabilisiertes Fenster zur Langzeitvisualisierung der zellulären Dynamik.

Intravitale Bildgebung: Eine Methode zur Beobachtung der Bauchspeicheldrüse der Maus auf zellulärer Ebene durch ein stabilisiertes Bildgebungsfenster

Wir beschreiben die Methode der Programmierung Stammzellen zu therapeutischen Angiogenese-Faktoren für Überexpression mit biologisch abbaubaren polymeren Nanopartikel. Beschriebenen Verfahren umfassen die Polymersynthese, die Transfektion von Fettgewebe abgeleitete Stammzellen in vitro, und die Validierung der Wirksamkeit der programmierten Stammzellen Angiogenese in einem Maushinterlauf-Ischämie-Modell zu fördern.

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Die chirurgische Induktion der Ischämie der Hintergliedmaßen bei der Maus ist nützlich, um die Angiogenese zu untersuchen, jedoch ist dies bei bestimmten Inzucht-Mausstämmen, die eine ausgeprägte Ischämie-induzierte Gewebenekrose aufweisen, beeinträchtigt. Es werden Methoden zur Induktion einer subakuten Ischämie der Gliedmaßen unter Verwendung von Ameroid-Konstriktoren beschrieben, um dieses Problem durch die Induktion eines allmählichen arteriellen Verschlusses zu umgehen.

Methoden für die akute und subakute Murine hindlimb Ischemia

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode mit einem röntgendichten bleihaltigen Silikon-Kautschuk zu das murine Gefäßsystem zur Quantifizierung der Aorta Durchmesser in einem Mausmodell der Aortenaneurysma und Dissektion durchspülen.

Quantitative Micro-CT-Analyse der Aortopathy in einem Mausmodell der β-Aminopropionitrile-induzierte Aortenaneurysma und Dissektion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Technik und die notwendigen Kontrollen für die Laser Doppler-Perfusionsbildgebung demonstriert, um den Blutfluss im Maushinterglied zu messen.

Laser Doppler Perfusion Imaging in der Maus Hindlimb

In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Hier geben wir Details zur Durchführung der glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) durch Perfusion durch das Gefäßsystem von Mäusen mit intakter Bauchspeicheldrüse als zusätzliche Technik zur Beurteilung der endokrinen Pankreasfunktion mit Reduktion möglicher Störfaktoren.

Glukosestimulierte Insulinsekretion über Perfusion durch das Gefäßsystem der Maus mit intakter Bauchspeicheldrüse

Lernen Sie eine kombinierte Methode aus kontrastverstärkter Sonographie und intravitaler Mikroskopie zur Untersuchung insulininduzierter Vasodilatation und Muskel-Durchblutung bei CD57 BL6 Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Analyse mikrovaskulärer Dynamiken und trägt zum Verständnis von Insulinresistenz bei.

Kombiniert intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie der Maus Megalosauridae Insulin-induzierte Vasodilatation und Muskel-Durchblutung zu untersuchen (Video) | JoVE Journal

Kombiniert intravitalen Mikroskopie und Kontrast-verstärkte Sonographie der Maus Megalosauridae Insulin-induzierte Vasodilatation und Muskel-Durchblutung zu untersuchen

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