Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Glykolyse und mitochondriale Atmung in Lymphozyten mithilfe eines extrazellulären Fluss-Assays genau zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunometabolismus zu beantworten, beispielsweise welche Stoffwechselveränderungen in Immunzellen nach Aktivierung, Differenzierung oder während einer Erkrankung auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die effiziente und Echtzeitanalyse der Stoffwechselprofile von über 90 Proben gleichzeitig ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in den Lymphozytenmetabolismus ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Zellen anwendbar, einschließlich nicht-ankernder Zellen, die eine Plattenzugabe erfordern, mit minimaler Beeinträchtigung ihrer Funktionalität. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da Lymphozyten empfindlich sind und schonend behandelt werden müssen, um ihre Funktionalität und Vitalität aufrechtzuerhalten. Am Tag vor dem Experiment heben Sie die Sensorpatrone des extrazellulären Fluss-Analysators an und füllen jedes Loch der Hilfsplatte mit 200 Mikrolitern Kalibrierlösung.

Senken Sie als Nächstes die Kartusche auf die Platte ab, tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrierlösung ein und inkubieren Sie die Kartusche über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid oder Stickstoff. Am nächsten Morgen beschichten Sie jede Vertiefung einer 96-Loch-Assayplatte mit 25 Mikrolitern Adhäsionslösung und inkubieren die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie am Ende der Inkubation die Adhäsionslösung ab und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern steriler Wasser.

Während die Platte an der Luft trocknet, stellen Sie einen 70-Mikron-Zellsieb über ein 50-Milliliter-Konischrohr und überführen Sie die gewonnenen Organe auf den Sieb. Zerreiben Sie das Gewebe unter Verwendung des Kolbens einer sterilen 3-Milliliter-Spritze durch den Sieb, wobei Sie den Filter und die Organe während des gesamten Mazerationsschritts durch Zugabe von MS-Puffer nach Bedarf feucht halten. Spülen Sie anschließend den Sieb mit fünf bis 10 Milliliter MS-Puffer aus und zentrifugieren Sie die resultierende Zellsuspension.

Suspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter ACK-Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen. Nach fünf Minuten auf Eis die Viskosität durch Zugabe von 10 bis 20 Milliliter MS-Puffer wiederherstellen und die Zellen erneut zentrifugieren. Am Ende der Zentrifugation ein 30-Mikron-Zellsieb auf ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen stellen und das Sieb mit einem Milliliter MS-Puffer vorbenetzen.

Suspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter frischem MS-Puffer und filtrieren Sie die Zellsuspension durch den Filter, um die lysierten roten Blutkörperchen-Aggregate zu entfernen. Geben Sie vier Milliliter frischen MS-Puffer hinzu, um das leere Lysetröhrchen auszuwaschen, und lassen Sie die Waschflüssigkeit durch den Filter laufen. Zählen Sie die Zellen und portionieren Sie eine geeignete Anzahl von Splenocyten für den extrazellulären Fluss-Assay.

Sedimentieren Sie anschließend beide Zellproben und resuspendieren Sie die Splenocytenprobe für den extrazellulären Fluss-Assay in fünf Milliliter RF-10-Medium auf Eis. Resuspendieren Sie die Zellen für die Bead-Isolierung in den entsprechenden Volumina Biotin-Antikörper-Cocktail, Anti-Biotin-Mikroperlen und MS-Puffer für die angegebenen Inkubationszeiten bei zwei bis acht Grad Celsius. Am Ende der zweiten Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet in 500 Mikroliter frischem MS-Puffer pro 1 × 10⁸ Zellen.

Bringen Sie als Nächstes die geeignete Säule auf dem Trennmagneten an und präparieren Sie die Säule mit drei Milliliter MS-Puffer, wobei der Durchlauf verworfen wird. Stellen Sie ein steriles 15-Milliliter-Kegelrohr unter die Säule und geben Sie das gesamte Zellproben-Volumen auf die Säule. Spülen Sie anschließend das Zellinkubationsrohr mit drei Milliliter frischem MS-Puffer und sammeln Sie die Waschflüssigkeit im Kegelrohr.

Nachdem der letzte Eluat gesammelt wurde, füllen Sie das Röhrchen mit MS-Puffer auf ein Endvolumen von 15 Milliliter auf und zentrifugieren Sie die negativ isolierten Zellen. Suspendieren Sie das Pellet anschließend in fünf Milliliter frischem RF-10-Medium auf Eis. Nicht mehr als drei Stunden nach der Isolierung zentrifugieren Sie alle Zellproben und resuspendieren die Pellets in fünf Milliliter des jeweils geeigneten Assay-Mediums für eine weitere Zentrifugation.

Nach der zweiten Zentrifugation die Pellets in frischem Assay-Medium in der geeigneten experimentellen Konzentration resuspendieren, um ein Endvolumen von 180 Mikrolitern Zellen pro Vertiefung zu erreichen, und 180 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in die Platte geben. Die Zellen 25 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Platte zentrifugieren, um die Zellen fest am Boden der Vertiefungen anzubinden, und die Platte danach wieder in den Inkubator zurückstellen.

Nach 30 Minuten frisch zubereitete 37 Grad Celsius warme Verbindungen mit einer Mikropipette in die entsprechenden Injektorbuchsen der Sensorpatrone des extrazellulären Flussanalysegeräts geben; Kontroll- und nicht experimentelle Buchsen mit Medium allein beladen. Die beladene Patrone zurück in den Inkubator stellen und das Programm für den extrazellulären Fluss-Assay einrichten. Anschließend die Patrone in das Gerät laden und das Programm starten; nach der Kalibrierung die Kalibrationsplatte wie angefordert durch die Assayplatte ersetzen.

Nach dem extrazellulären Fluss-Assay führen Sie die Proteinbestimmungsanalysen durch. Über 90 % aller Zellpopulationen sind vital, wobei eine Reinheit von 98 bis 99 % für die Lymphozyten beobachtet wird. Die Konfluenz jedes Zelltyps korreliert mit den anfänglichen Ansiededichten.

Die Proteinkonzentrationen des Lysats korrelieren linear mit den Ansäte-Dichten, was bestätigt, dass Proteinkonzentrationen zur genauen Normierung von extrazellulären Flussdaten verwendet werden können. Höhere Zellzahlen korrelieren mit höheren gemessenen Sauerstoffverbrauchsraten sowie mit stärker ausgeprägten Reaktionen auf mitochondriale Inhibitoren. Höhere Ansäte-Dichten führen bei T-Zellen und Milzzellen zu ähnlichen normierten Sauerstoffverbrauchsraten, während fünf- und 1,25-mal 10 hoch fünf Zellen pro Mulde bei B-Zellen zu ähnlichen normierten Sauerstoffverbrauchsraten führen.

Die Parameter der mitochondrialen Atmung korrelieren ebenfalls linear mit den Ansiedlungsdichten. Zudem weist der geringe Protonenleck darauf hin, dass der größte Teil der Grundatmung für die ATP-Synthese genutzt wird. Höhere Ansiedlungsdichten führen zu höheren Raten der extrazellulären Versauerung und stärkeren Reaktionen auf mitochondriale Inhibitoren.

Die Parameter der Glykolyse korrelieren linear mit den Zellansaatdichten, wobei die hohe Ansattdichte als am besten geeignet für einen erfolgreichen Glykolyse-Stress-Test ermittelt wurde. Glukose stimuliert die mitochondriale Atmung leicht, die durch Oligomycin gehemmt wird, während 2-DG den Sauerstoffverbrauch nicht signifikant beeinflusst. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in sechs bis acht Stunden abgeschlossen werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen vor der extrazellulären Flussanalyse auf Eis zu halten und die Zellen genau zu zählen und zu plattieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Messung des mitochondrialen Potentials und der Glukoseaufnahme durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Stoffwechselzustand der Zellen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lymphozyten isoliert und einen extrazellulären Fluss-Assay durchführt.