Name: Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Glykolyse und mitochondriale Atmung in Maus-Lymphozyten mittels Extracellular Flux Assay analysieren. Diese optimierte Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen für die Immunmetabolismus-Forschung.

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Die Autoren danken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) für die Unterstützung und Diskussion, Frau Ann Kim für die Optimierung des B-Zell-Isolierungsprotokolls, Dr. Joseph Brzostowski für seine Hilfe bei der Mikroskopie und Frau Mirna Peña für die Pflege der verwendeten Tiere. Diese Studie wurde von den Intramural Research Programs der National Institutes of Health, des National Institute of Allergy and Infectious Diseases und des National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Die Open-Access-Gebühren für diesen Artikel wurden von Agilent Technologies zur Verfügung gestellt.

Das Protokoll, entwickelten wir für die effiziente Isolierung von reinem und tragfähige Lymphozytensubpopulationen erlaubt, die anschließend bei verschiedenen Konzentrationen in extrazellulären Flussanalyse wurden verwendet, um die Unterschiede in der Glykolyse und der mitochondrialen Atmungsleistung zu bewerten. Dieses Protokoll ist speziell für Lymphozyten und adressiert die spezielle Überlegungen zu dieser Zelltypen im Zusammenhang, wie niedrige basale metabolische Aktivität, Zerbrechlichkeit, niedrige Frequenz, und ihre Unfähigkeit zu Testplatten haften. Daher kann im Vergleich zu bisher veröffentlichten Protokolle 11,12 unsere Methode bietet eine bequemere und besser optimierte Führung für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie arbeiten. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, einschließlich der immer rein und lebensfähige Zellpopulationen, die Plattierung der Zellen bei optimalen Zusammen und Standardisierung der extrazellulären Flusstestmessungen an die Proteinkonzentration in jeder Vertiefung. Das initial Anzahl von Zellen plattiert konnte sowohl durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden und auch Proteinkonzentration Messungen quantifiziert werden. Die lineare Korrelation zwischen der Zellzahl und die Proteinkonzentration bestätigt, dass die Proteinkonzentration in der Tat als ein Weg verwendet werden kann, um die Auswirkungen von Veränderungen in der Zellzahlen zwischen verschiedenen Vertiefungen zu standardisieren. Durch die Standardisierung der ECAR und OCR - Ergebnisse zu den Proteinkonzentrationen, haben wir gezeigt , dass trotz geringerer Zellkonfluenz, so wenig wie 2,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in den meisten Assays verwendet werden, um die Qualität der Daten , ohne Kompromisse. Jedoch ist die untere Grenze von Zellen, die zwischen den Zelltypen und Assays verwendet werden, können variiert werden. Zum Beispiel, während so wenig wie 1,25 x 10 5 Zellen für die B - Zell - OCR - Messungen verwendet werden könnten, auch 2,5 x 10 5 Zellen / waren nicht gut genug , um die glykolytischen Leistung des gleichen Zelltyps zu bewerten. Daher, solange die Zellzahl ist kein begrenzender Faktor, Plattieren bei über90% Konfluenz, was etwa 5 entspricht x 10 5 Lymphozyten / Napf, bevorzugt. Eine weitere Optimierung kann erforderlich werden, wenn die Zellen in verschiedenen Größen-wie zuvor aktivierte und teilweise differenzierten Lymphozyten-Einsatz. Zusätzlich kann, wenn zuvor kultivierten primären Lymphozyten verwendet, könnte es eine Variation in der Zelllebensfähigkeit zwischen den verschiedenen Behandlungsbedingungen sein, was die Zuverlässigkeit der Proteinkonzentration als Maß für die Zellzahl seit toten oder sterbenden Zellen auf die gemessenen Proteinspiegel kann auch dazu beitragen, verringern würde . In solchen Fällen kann es hilfreich sein, lebende Zellen durch die Strömung zu sortieren Zytometrie, bevor die extrazellulären Fluss-Assays durchgeführt wird. In unseren Tests frisch isolierten und stark tragfähige Lymphozyten-Populationen verwenden, erhalten wir eine zuverlässige Funktionsdaten für beide OCR und ECAR Messungen. Während alle Zelltypen in ähnlicher Weise in der mitochondrialen Stresstest verhalten haben, ergaben sich deutliche Unterschiede zwischen Zelltypenin der Glykolyse Stresstest beobachtet. Zum Beispiel war die Glykolyse-Leistung von naiven T-Zellen gering im Vergleich zu Splenozyten oder B-Zellen, und es hat nicht mit dem Zusatz von Oligomycin ändern. Diese Beobachtung steht im Einklang mit den zuvor veröffentlichten Studien 7,30, die Gültigkeit unseres Protokolls bestätigt. Abschließend unser Verfahren bietet eine effiziente und bequeme Weise die Stoffwechselaktivität der Lymphozyten von Testen eines extrazellulären Fluss Analysator verwenden, und es kann in einem breiten Spektrum von immunologischen Studien Erforschung der metabolischen Veränderungen in Immunzellen bei Aktivierung, Zelldifferenzierung oder durch nützlich sein, zu Krankheitsphänotypen wie Infektionen, Autoimmun- und malignen hämatologischen Erkrankungen.

Die Immunantwort gegen Antigene ist ein streng reguliert Gleichgewicht zwischen Immunaktivierung und Immununterdrückung. Immunaktivierung treibt schnelle Zellproliferation und Migration sowie Produktion von Zytokinen, Antikörper Sekretion und erhöhte Phagocytose in Reaktion auf das Stimulans, während Immunsuppression einfach diese Ereignisse hemmt und daher ist wichtig in 1-6 unnötige Immunreaktionen zu verhindern. Jüngste Studien haben gezeigt , dass eine direkte Verbindung zwischen dem Aktivierungsstatus von Immunzellen und die Aktivität verschiedener Stoffwechselwege 7 existiert. Immunzellen können durch Umschalten Energie erzeugenden Wege ein- und ausgeschaltet zwischen ruhenden und aktivierten Zustände verschieben. Weiterhin wurde beobachtet, dass verschiedene Immunzelltypen verschiedene Stoffwechselstrategien verwenden kann ihre erhöhte Energiebedarf während der Aktivierung Kraftstoff. Während zum Beispiel die Aktivierung von T - Lymphozyten richtet Zellen in einem fast vollständig glykolytischen Zustand 8 </sup&gt;, aktivierte B - Lymphozyten verwenden , um ein Gleichgewicht der Glykolyse und oxidative Phosphorylierung 9,10. Diese Studien weisen darauf hin, wie wichtig die Auswirkungen der Immunzellaktivierung auf den Zellstoffwechsel zu untersuchen. Echtzeit, gleichzeitige Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR), als Indikatoren für oxidativen Phosphorylierung und der Glycolyse, ist eine gemeinsame Strategie , um die Zustände der Energieerzeugungspfade 11-13 zu adressieren. Um diese 96, eine extrazelluläre Fluss-Analysator, wie beispielsweise die Seahorse XF zu erreichen, wird routinemäßig eingesetzt. Ein solches Instrument kann Veränderungen in der OCR und ECAR über Zelltypen oder auf verschiedenen Stimulationsbedingungen schnell zu vergleichen. Bisher sind verschiedene Zelltypen, einschließlich Immunzellen wurden unter Verwendung dieser Vorrichtungen untersucht. Jedoch speziell ein optimiertes Protokoll für Immunzellen ausgelegt ist nicht verfügbar. Immunzellen, insbesondere von Lymphozyten, unterscheiden sich von otihre Zelltypen in mehrere kritische Weise. Lymphozyten sind fragile Zellen , die 14 bis 16 für längere Zeit in ex vivo Bedingungen nicht überleben. Dies ist ein noch größeres Problem, wenn sie kultiviert werden in suboptimalen Wachstumsmedien essentielle Nährstoffe fehlen, wie sie in der extrazellulären Flussanalyse verwendet. Im Gegensatz zu vielen Makrophagen und Zelllinien, Lymphozyten haften nicht an Kunststoffoberflächen; Daher ist es wichtig, sie auf die Analyseplatte zu befestigen, ohne Stress zu erzeugen. Schließlich können einige Lymphozytensubpopulationen extrem selten sein und sie bei den erforderlichen, optimalen Mengen Ernte könnte eine Herausforderung sein 17-19. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll, das speziell für Lymphozyten entwickelt wird. Mit Splenozyten, B - Lymphozyten und naive CD4 + T - Lymphozyten isoliert aus Maus - Milz und Lymphknoten 20 zeigen wir die Eigenschaften ihrer Ruhezustand Glykolyse und oxidative Phosphorylierung an different Zelldichten. Daten wurden normalisiert für die Unterschiede in der anfänglichen Zellzahlen zu berücksichtigen und für jeden durch das Ende Assay Zellysat-Protein-Konzentrationen, die zu den Zellzahlen direkt proportional waren. Unser Protokoll bietet nicht nur Richtlinien für die schnelle Isolierung von lebensfähigen Lymphozyten für extrazellulären Fluss-Assays, sondern erlaubt es auch für bei suboptimalen Zellkonzentrationen arbeiten, ohne dass die Datenqualität zu beeinträchtigen.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7,2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>Zur Herstellung von MACS-Puffer</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>Zur Herstellung von MACS-Puffer</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8</td><td>Qualität Biologisch</td><td>10128-446</td><td>Zur Herstellung von MACS-Puffer</td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Anstelle von PBS + EDTA zur Herstellung von MS-Puffer. Wird auch in autoMACS Pro Separator verwendet.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Enthält Phenolrot und L-Glutamin</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>Zur Hitzeinaktivierung die gefrorene Brühflasche in einem 37 μg auftauen; C Wasserbad und dann bei 56 ° C inaktivieren; C für 30 Min. Aliquotes hitzeinaktiviertes Serum zur Lagerung (z. B. , in konischen 50-ml-Röhrchen) und Einfrieren bei -20 μg; C bis zur Bedarf.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptomycin)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Kombinieren Sie Pen Strep mit L-Glut 1:1 (bei Herstellung von 500 ml Medien insgesamt 12 ml Pen Strepto/L-Glut); halten Sie die Aliquots bei -20 & Grad; C bis zur Herstellung des Mediums.</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Bestandteil von RF10 und Stresstestmedien</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Bestandteil von RF10 und Stresstestmedien</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Bestandteil von RF10</td></tr><tr><td>MEM Lösung (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Komponente aus RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Komponente aus RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu; m Zell-Sieb</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Zur Verwendung bei der Zellisolierung</td></tr><tr><td>Monoject 3 ml Spritze, Luer-Lock-Spitze</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Zur Zellisolierung</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Konische Zentrifugenröhrchen &nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Wird in der Zellisolierung</td></tr> verwendet <tr><td>Falcon 50 ml konische Zentrifugenröhrchen &nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Wird in der Zellisolierung</td></tr><tr><td>verwendet ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E Wird</td><td>in der Zellisolierung verwendet</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &mu; M-Zellfilter, steril, einzeln verpackt</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Zur Verwendung bei der Zellisolierung</td></tr><tr><td>B-Zell-Isolationskit, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Zur Verwendung bei der Zellisolierung</td></tr><tr><td>Na&iuml; ve CD4+ T-Zell-Isolationskit, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Wird in der Zellisolierung</td></tr><tr><td>verwendet LS-Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Wird in der Zellisolierung</td></tr><tr><td>verwendet MidiMACS-Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Magnet für die Trennung</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Halterung für Magnete</td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung</td><td></td><td>130-091-222</td><td>Spüllösung für autoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Zellkleber. Achten Sie auf die Konzentration, da jede Charge anders ist (Packung ist 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteasehemmer Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Lieferung als 100x Cocktail, kombinieren Sie es mit RIPA zu einer 1x Lösung für die Lyse.</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Enthält Assay-Platten, Kartuschen, Ladeanleitungen zum Übertragen von Verbindungen auf die Assay-Kartusche und Kalibrierlösung.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Basismedium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Wird zur Vorbereitung von Stresstestmedien</td></tr><tr><td>verwendet Seahorse XFe96 Extrazellulärer Flussanalysator</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sterile Vakuumfiltereinheiten, 0,22 &mu; m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Wird zur Sterilisierung von Filtermedien verwendet.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>auf 0,1 M aufgelöst und zur Verdünnung von Cell-Tak verwendet.</td></tr></tbody></table>

ein optimiertes protokoll glykolyse und die mitochondriale atmung in lymphozyten zu analysieren

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Lymphocyten reagieren auf eine Vielzahl von Stimuli durch intrazelluläre Signalwege zu aktivieren, was zur schnellen Zellproliferation, Migration und Differenzierung wiederum führt und Zytokinproduktion. Alle diese Ereignisse sind eng mit dem Energiestatus der Zelle verbunden sind, und daher Hinweise auf die gesamte Funktionalität dieser Zellen geben kann, die Energie erzeugenden Wege zu studieren. Die extrazelluläre Flußmittel Analysator ist eine häufig verwendete Vorrichtung die Leistung der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in vielen Zelltypen zur Auswertung. Dieses System verwendet worden ist Immunzellen in einigen veröffentlichten Berichten zu studieren, noch ein umfassendes Protokoll optimiert besonders für Lymphozyten fehlt. Lymphozyten sind fragile Zellen , die schlecht in ex - vivo - Bedingungen zu überleben. Oft Lymphozytensubpopulationen sind selten, und die Arbeit mit niedrigen Zellzahlen ist unvermeidlich. Somit wird eine experimentelle Strategie, die diese Schwierigkeiten Adressen erforderlich. Hier bieten wir ein Protokolldass ermöglicht eine schnelle Isolation von lebensfähigen Lymphozyten aus lymphoiden Geweben und für die Analyse ihrer Stoffwechselzustände in den extrazellulären Flußmittel Analysators. Darüber hinaus stellen wir die Ergebnisse von Experimenten, in denen die Stoffwechselaktivitäten von mehreren Lymphozyten-Subtypen bei verschiedenen Zelldichten verglichen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass unser Protokoll verwendet werden kann, konsistente und gut standardisierten Ergebnisse auch bei niedrigen Zellkonzentrationen zu erreichen, und somit kann sie haben breite Anwendungen in zukünftigen Studien zur Charakterisierung der metabolischen Ereignissen in Immunzellen konzentriert.

Eukaryotische Zellen verwenden, um ein integriertes Netzwerk von Glykolyse, die Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus, und die oxidative Phosphorylierung zu treffen, um die Mehrheit ihrer Energiebedarf und Zwischenprodukte für das Zellwachstum und die Proliferation erforderlich ist. Diese Wege beginnen mit dem intrazellulären Einfangen von freier Glucose in Form von Glucose-6-phosphat, die anschließend in Pyruvat verarbeitet wird. Pyruvat wird entweder reduziert zu Lactat oder in die Mitochondrien transportiert, wo es Acetyl-Coenzym A (CoA) bildet. Acetyl-CoA tritt dann in den TCA-Zyklus. Hochenergetische Zwischenprodukte des Citratzyklus die Bewegung von Elektronen in der Elektronentransportkette (ETC) antreiben, die wiederum H + aus der mitochondrialen Matrix ausstößt einen H + -Gradienten über die innere Mitochondrienmembran zu erzeugen. Sauerstoff wirkt als die endgültige Elektronenakzeptor und H + wieder zurück in die mitochondriale Matrix durch die F O / F &lt;sub&gt; 1 - Komplex, wo ihre potentielle Energie verwendet wird ATP (1A) zu erzeugen. Das Arbeitsprinzip der extrazellulären Fluss Assay hängt mit der Glykolyse und oxidative Phosphorylierung an spezifischen Punkten auf störende und Bewertung der daraus resultierenden Effekte. Zu diesem Zweck verwendeten wir Glucose Glykolyse in ausgehungert Zellen zu vermehren, und 2-Desoxyglucose (2-DG), die auf 2-Desoxyglucose-6-phosphat, einem kompetitiven Inhibitor von Phosphoglucoisomerase umgewandelt 23, Hexokinase, um zu blockieren , Glykolyse. Rotenon (komplexe I-spezifischer Inhibitor des ETC), Antimycin A (komplexe III-spezifischen Inhibitor des ETC), Oligomycin (Inhibitor der ATP - Synthase 24) und die Entkopplungsmittel 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 waren In den elektronen~~POS=TRUNC, Protonengradienten und ATP - Synthese (1A) im Zusammenhang verwendet , um spezifische Ereignisse zu intervenieren. Anstelle von 2,4-DNP, Carbonyl cyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) kann auch verwendet werden, aber eine weitere Optimierung erforderlich. In jedem Fall ist die optimale Konzentration erforderlich, um zu bestimmen Entkuppler sollte immer vor der Verwendung für einen bestimmten Zelltyp titriert werden. Die Glykolyse Stresstest (Abbildung 1B) beginnt mit einer Baseline - Messung der extrazellulären Ansäuerung Rate (ECAR) in den zuvor ausgehungert Zellen. Da diese Zellen in ihrem basalen minimal sind, und kann daher praktisch als nicht glykolytischen betrachtet werden, die ECAR an dieser Stelle gemessen wird, als nicht-glykolytischen Ansäuerung bezeichnet. Diese Ansäuerung entspricht wahrscheinlich die Atmungs CO 2 in dem TCA - Zyklus erzeugt HCO umgewandelt wird 3 - und H +. Dies wird durch die Injektion von Glucose, gefolgt Glykolyse zu aktivieren, die als eine Zunahme in der extrazellulären Ansäuerung stellt aufgrund der Bildung von Lactat.Dieser Anstieg stellt die normale Rate der Glykolyse. blockier die Erzeugung von ATP durch oxidative Phosphorylierung Die Zellen werden dann mit der Injektion von Oligomycin, in Frage gestellt. Zellen reagieren auf diese dramatische Abnahme der ATP-Produktion durch Glykolyse auf seinen maximalen Pegel zu aktivieren, und das führt zu einer sekundären Erhöhung der ECAR Ebene (Glykolyse-Reserve). Der Test wird durch vollständige Hemmung der Glykolyse mit dem Glukose analogen 2-DG, beendet die die ECAR in seinen nicht glycolytic Niveau zurückkehrt. Interessanterweise ist vorgeschlagen worden , dass im Gegensatz zu den Empfehlungen des Herstellers wird maximal Glycolyse nicht notwendigerweise durch die Injektion von Oligomycin 26 erreicht. In Zellen mit einer hohen glykolytischen Kapazität, wenn kein signifikanter Anstieg in ATP Nachfrage ist, kann Glykolyse durchaus in der Lage sein, mit dem Verlust des mitochondrialen ATP zu bewältigen, ohne sie benötigen hochreguliert zu sein. Die Glykolyse-Rate mit Oligomycin konnte durch Zugabe von Atmungshemmer übertroffen werdenWie Rotenon und Myxothiazol, die einige Vorteile gegenüber Oligomycin bieten: 1) Sie erhöhen die ATP Nachfrage, da sie die Umkehrung der ATP - Synthase, mit der ATP - Hydrolyse verursachen, Protonen in einem Versuch zu pumpen das mitochondriale Membranpotential 26 zu erholen; 2) Sie verhindern, dass Atem Ansäuerung des Mediums, das die ECAR Ergebnisse durcheinander bringen können (siehe unten). Andere Wege ATP Nachfrage zu erhöhen , umfassen die Zugabe von Verbindungen, die die Hydrolyse von ATP durch die Plasmamembran ATPasen 26 stimulieren. All dies sollte sorgfältig von den Forschern in Betracht gezogen werden, wenn ein Glykolyse Stresstest zu planen. Die mitochondrialen Stresstest (1C) beginnt mit einer Baseline - Messung des Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in nicht ausgehungert Zellen. Dies wird durch die Injektion von Oligomycin gefolgt, die die Rückkehr der Protonen durch die F O / F 1 - Komplex hemmt und somit schnell hyperpolarizes die Membran der Mitochondrien. Hyperpolarisation verhindert ein weiteres Proton durch Atmungskomplexe Pumpen, und die Atemfrequenz nimmt ab. Die verbleibende Atmung Protonenleck bezeichnet, die den Fluss der Protonen durch Lipide oder andere Kanäle darstellt. Diese hyperpolarisierten Zustand wird durch die Zugabe des Entkopplungsmittel 2,4-DNP, die als Protonen Ionophor wirkt schnell umgekehrt. Als Reaktion darauf versuchen Zellen das Membranpotential in einem vergeblichen Versuch, sich zu erholen, indem die Elektronentransportrate zu seiner maximalen Erhöhung und dies wiederum erhöht die OCR. Schließlich mit dem Zusatz von zwei ETC-Inhibitoren (Antimycin A und Rotenon) vollständig mitochondriale Atmung stoppt und OCR sinkt auf sein niedrigstes Niveau. Auf dieser Ebene ist der Sauerstoffverbrauch aufgrund mitochondriale Aktivität (nicht-mitochondriale). Der Unterschied in der durch diese Inhibitoren erzeugten OCR wird die maximale mitochondrialen Atmung, genannt, die die Summe der Basislinie der Atmung und der Reservekapazität. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; B und T - Zell - Isolationen Ausbeute sehr tragfähige reine Lymphozyten - Populationen. B - Zellen und naiven CD4 + T - Zellen wurden wie in Abschnitt 4 des Protokolls skizziert isoliert und Splenozyten wurden einfach durch Lysieren der roten Blutkörperchen erhalten , wie in Abschnitt 3.3 beschrieben. Die Empfindlichkeit der Zelltyp-spezifischen metabolischen Assays hängt von der Lebensfähigkeit und der Reinheit der Ausgangszellpopulation. Daher ist , um die Lebensfähigkeit der isolierten Maus - T - Zellen zu überprüfen, Splenozyten und B - Zellen, und die Reinheit von T- und B - Zellen, kleine Aliquots der Zellen wurden für die durchflusszytometrische Analyse (Abbildung 2) gefärbt. In der Vorwärtsstreuung-Bereich vs. Seitenstreubereich (FSC-A vs. SSC-A) Plot wurden Lymphozyten gated, und innerhalb dieses Tor, die Bevölkerung entlang der Diagonale in der Vorwärtsstreuung-height (FSC-H) gegen FSC-A-Grundstück wurden als Singuletts bestimmt. Innerhalb der Singulettpopulation wurde Lebensfähigkeit gemessen , indem die Zellen Gating, die für die Live / Dead - Marker (2A) negativ gefärbt; T-Zell-Lebensfähigkeit betrug 97,9%, Splenozyten- Lebensfähigkeit betrug 92%, und B die Lebensfähigkeit der Zellen betrug 94%. B - Zell - Reinheit, gemessen durch den B220 + CD19 + -Population 26, betrug 99%, während die CD4 + T - Zell - Reinheit, wie durch das CD44 gemessen - CD4 + -Population 27, betrug 98,3% (2B). Die Proteinkonzentration des Zelllysats kann als direkter Indikator für plattierte Zellzahl verwendet werden. Isolierte Lymphozyten und Splenozyten wurden bei 5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in einem Klebstoff beschichteten 96-Well - Assayplatte plattiert, 2,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung, 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung und 0,625 x 10 <sup&gt; 5 Zellen / Vertiefung. Der Zusammenfluss an jeder Plattierungsdichte der drei Zelltypen wurde unter dem Lichtmikroskop (3A) sichtbar gemacht . Wie erwartet, Einmündung in den anfänglichen Plattierung Dichten korreliert. Nach Abschluss der extrazellulären Fluss Assay wurden plattierten Zellen lysiert und deren Proteinkonzentrationen wurden mit dem BCA Assay quantifiziert. Für alle Zelltypen wurden Lysat Proteinkonzentrationen gezeigt linear mit der anfänglichen Beschichtungsdichten (3B) korreliert werden, die die Konzentrationen Lysat - Protein bestätigt , kann als ein genaues Maß für die Normalisierung der Zellzahlen verwendet werden , wenn die extrazellulären Flussdaten zu interpretieren. Die Beschichtungsdichten in diesem Experiment verwendet wurden naive, unstimulierte Lymphozyten optimiert. Wenn stimuliert oder zuvor kultivierten Zellen verwendet werden sollen, kann eine weitere Optimierung erforderlich. Mitochondriale und glycolytic stress-Assays sind abhängig von plattierten Zellzahl. Die OCR wurde für jeden Zelltyp und Plattierungsdichte in der extrazellulären Flußmittel gemessen. Wie erwartet, haben höhere Zellzahlen eine höhere Mess OCR sowie dramatischer Reaktionen auf Oligomycin, 2,4-DNP und Antimycin A / Rotenon (4A). OCR Standardisieren Messungen an einzelnen Proteinkonzentration der Probe zeigt, dass in der Regel eine größere Anzahl von Zellen führen zu genaueren OCR-Messungen. Plattierung bei 5 und 2,5 x 10 5 Zellen / resultierte auch in ähnlicher normalisierten OCR Messungen in den T - Zellen und Milzzellen und 5 und 1,25 x 10 5 Zellen / resultierte auch ähnliche normalisierten OCR Messungen in B - Zellen (4B). Die geringen Unterschiede in der normalisierten B - Zell - OCR Messungen könnte ein indirektes Anzeichen dafür sein , dass B - Zellen mit 2,5 × 10 5 Zellen bessere Leistung / well im Vergleich zu anderen Zelldichten. Mit allen Maßnahmen, 0,625 x 10 5 Zellen / Vertiefung gab suboptimalen Ergebnissen, die zeigen , dass diese Plattierungsdichte unzureichend ist. Baseline - Atmungs, Protonenleck, maximale mitochondrialen Atmung, nicht-mitochondrialen Atmung und ATP Produktion linear mit der Beschichtungsdichten für alle Zelltypen (4C) korreliert. Zusätzlich wird der größte Teil der Basislinie Atmung verwendet ATP zur Synthese, wie durch die geringe Protonenleck in den drei Zelltypen angegeben. Während der primäre Fokus des Experiments mitochondrialen Stress Veränderungen in OCR zu messen, ist die ECAR nützlich noch aufzuzeichnen, daß der Test, um sicherzustellen, wurde erfolgreich durchgeführt. Ähnlich wie bei der OCR, die beiden höheren Plattierung Dichten führte zu höheren ECAR und dramatischer Reaktionen auf Oligomycin, 2,4-DNP und Antimycin A / Rotenon (4D). Die dramatischen Veränderungen in ECAR bei der Zugabe von 2,4-DNP und Antimycin A / Rotenon kann bei der Atmung zusätzlich zu den Änderungen in g aufgrund von Änderungen seinlycolysis, da CO 2 in dem TCA - Zyklus erzeugt wird, HCO 3 umgewandelt - und H +. Dieses Problem wurde vor kurzem angesprochen, und es gibt eine einfache Methode für die gesamte extrazelluläre Ansäuerung Signal unter Verwendung von Sauerstoffverbrauchsdaten zu korrigieren, die reale glykolytischen Rate 12,29 zu erhalten. Die Glykolyse Stress - Test war am erfolgreichsten bei der höchsten Plattierungsdichte (5A, B). In allen Zelltypen, die 5 x 10 5 Zellen / well Proben hatten die größten Veränderungen in ECAR nach der Zugabe von Glucose, Oligomycin und 2-DG (5B). Darüber hinaus zeigte die Proteinkonzentration zu normalisieren , dass für alle Zelltypen, die 5 x 10 5 Zellen / Well Proben optimale Ergebnisse erzielt, während niedrigere Konzentrationen-insbesondere 0,625 x 10 5 Zellen / gut nicht eine robuste glycolytic Reservekapazität anzuzeigen. Nicht glycolytic Versauerung, Glykolyse, und die scheinbare glycolytic Kapazität linear mit Überzug Dichten für alle Zelltypen (5C) korreliert. Für die Glykolyse Stress Experiment zeigt die OCR Diagramm, das Glucose stimuliert leicht mitochondrialen Atmung, die dann durch Oligomycin Behandlung inhibiert wird; die Zugabe von 2-DG hatte keinen Einfluss auf die OCR (5D). Die OCR-Grafik kann als weiterer Indikator verwendet werden, dass die Glykolyse Stress Experiment erfolgreich durchgeführt wurde. Auch kann die OCR Graph verwendet werden , um die ECAR Graph zu korrigieren, falls erforderlich, wie oben im Falle des mitochondrialen Belastungstest 12,29 erläutert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" /> Abb . 1: Übersicht über die extrazellulären Fluss - Assays (A) Abbildung der Glykolyse (links) und die oxidative Phosphorylierung (rechts) zeigt die Wirkung desmetabolische Medikamente in den extrazellulären Flussassays verwendet. (B) Schematische Darstellung der extrazellulären Ansäuerung Rate (ECAR) Graph; Schema des Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) Diagramm (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" /> . Abbildung 2: Stepwise Gating von T - Zellen, B - Zellen und Splenozyten Lebensfähigkeit und Reinheit zu bestimmen Durchflusszytometrie Plots der Lebensfähigkeit von T - Zellen, Splenozyten und B - Zellen (A) zeigt; und Reinheit von T- und B - Zellen (B). Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen th</a>Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" /> Fig . 3: Die Zellkonfluenz korreliert mit dem Lysat Proteinkonzentrationen einer jeden Zelltyps bei verschiedenen plating Dichten (A) Lichtmikroskopische Aufnahmen von Zellen in Assayplatte Vertiefungen bei plating Dichten im Bereich von 5 x 10 5 Zellen / well bis 0,625 x 10 5 Zellen / Gut. Maßstabsbalken bezeichnen 50 &amp; mgr; m. (B) Lysate Proteinkonzentrationen bei verschiedenen Beschichtungsdichten, wie durch den BCA - Assay gemessen. Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" /> Abbildung 4:<html> Mitochondriale Stress - Test. Raw (A) und standardisiert (B) OCR für jeden Zelltyp und Plattierungsdichte gezeigt. (C) Zellzahl abhängige Änderungen in der Höhe der Grundlinie, die maximale mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Atmung, sowie die Sauerstoffverbräuche verbunden Protonenleck oder ATP - Produktion, werden für jede Zelltypen gezeigt. (D) Raw ECAR Werte aus den mitochondrialen Stresstests erhalten werden gezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 7-8 Vertiefungen mit Standardabweichung. Markierten Pfeile bezeichnen Injektionen von Oligomycin (O), 2,4-DNP (D) und Rotenon / Antimycin A (R / A). Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> _upload / 54918 / 54918fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5:. Glykolytische Stress - Test Raw (A) und standardisiert (B) ECAR für jeden Zelltyp und Plattierungsdichte gezeigt. (C) Zellzahl abhängige Änderungen in ECAR für nicht glykolytischen Ansäuerung, Glucose-induzierte Glykolyse und die Gesamtkapazität glykolytischen gezeigt. (D) Raw OCR - Werte aus den Glykolyse - Stresstests erhalten werden gezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 7-8 Vertiefungen mit Standardabweichung. Markierten Pfeile bezeichnen Injektionen von Glucose (G), Oligomycin (O) und 2-Desoxyglucose (2-DG). Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Erforschung des Stoffwechsels wird für die immunologische Forschung immer relevanter. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in Maus-Splenozyten sowie T- und B-Lymphozyten vor.

Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Glykolyse und mitochondriale Atmung in Lymphozyten mithilfe eines extrazellulären Fluss-Assays genau zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunometabolismus zu beantworten, beispielsweise welche Stoffwechselveränderungen in Immunzellen nach Aktivierung, Differenzierung oder während einer Erkrankung auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die effiziente und Echtzeitanalyse der Stoffwechselprofile von über 90 Proben gleichzeitig ermöglicht.Obwohl diese Methode Einblicke in den Lymphozytenmetabolismus ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Zellen anwendbar, einschließlich nicht-ankernder Zellen, die eine Plattenzugabe erfordern, mit minimaler Beeinträchtigung ihrer Funktionalität. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da Lymphozyten empfindlich sind und schonend behandelt werden müssen, um ihre Funktionalität und Vitalität aufrechtzuerhalten. Am Tag vor dem Experiment heben Sie die Sensorpatrone des extrazellulären Fluss-Analysators an und füllen jedes Loch der Hilfsplatte mit 200 Mikrolitern Kalibrierlösung.Senken Sie als Nächstes die Kartusche auf die Platte ab, tauchen Sie die Sensoren in die Kalibrierlösung ein und inkubieren Sie die Kartusche über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid oder Stickstoff. Am nächsten Morgen beschichten Sie jede Vertiefung einer 96-Loch-Assayplatte mit 25 Mikrolitern Adhäsionslösung und inkubieren die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie am Ende der Inkubation die Adhäsionslösung ab und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit jeweils 200 Mikrolitern steriler Wasser. Während die Platte an der Luft trocknet, stellen Sie einen 70-Mikron-Zellsieb über ein 50-Milliliter-Konischrohr und überführen Sie die gewonnenen Organe auf den Sieb. Zerreiben Sie das Gewebe unter Verwendung des Kolbens einer sterilen 3-Milliliter-Spritze durch den Sieb, wobei Sie den Filter und die Organe während des gesamten Mazerationsschritts durch Zugabe von MS-Puffer nach Bedarf feucht halten. Spülen Sie anschließend den Sieb mit fünf bis 10 Milliliter MS-Puffer aus und zentrifugieren Sie die resultierende Zellsuspension.Suspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter ACK-Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen. Nach fünf Minuten auf Eis die Viskosität durch Zugabe von 10 bis 20 Milliliter MS-Puffer wiederherstellen und die Zellen erneut zentrifugieren. Am Ende der Zentrifugation ein 30-Mikron-Zellsieb auf ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen stellen und das Sieb mit einem Milliliter MS-Puffer vorbenetzen.Suspendieren Sie die Zellen in fünf Milliliter frischem MS-Puffer und filtrieren Sie die Zellsuspension durch den Filter, um die lysierten roten Blutkörperchen-Aggregate zu entfernen. Geben Sie vier Milliliter frischen MS-Puffer hinzu, um das leere Lysetröhrchen auszuwaschen, und lassen Sie die Waschflüssigkeit durch den Filter laufen. Zählen Sie die Zellen und portionieren Sie eine geeignete Anzahl von Splenocyten für den extrazellulären Fluss-Assay. Sedimentieren Sie anschließend beide Zellproben und resuspendieren Sie die Splenocytenprobe für den extrazellulären Fluss-Assay in fünf Milliliter RF-10-Medium auf Eis. Resuspendieren Sie die Zellen für die Bead-Isolierung in den entsprechenden Volumina Biotin-Antikörper-Cocktail, Anti-Biotin-Mikroperlen und MS-Puffer für die angegebenen Inkubationszeiten bei zwei bis acht Grad Celsius. Am Ende der zweiten Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren das Pellet in 500 Mikroliter frischem MS-Puffer pro 1 × 10⁸ Zellen.Bringen Sie als Nächstes die geeignete Säule auf dem Trennmagneten an und präparieren Sie die Säule mit drei Milliliter MS-Puffer, wobei der Durchlauf verworfen wird. Stellen Sie ein steriles 15-Milliliter-Kegelrohr unter die Säule und geben Sie das gesamte Zellproben-Volumen auf die Säule. Spülen Sie anschließend das Zellinkubationsrohr mit drei Milliliter frischem MS-Puffer und sammeln Sie die Waschflüssigkeit im Kegelrohr.Nachdem der letzte Eluat gesammelt wurde, füllen Sie das Röhrchen mit MS-Puffer auf ein Endvolumen von 15 Milliliter auf und zentrifugieren Sie die negativ isolierten Zellen. Suspendieren Sie das Pellet anschließend in fünf Milliliter frischem RF-10-Medium auf Eis. Nicht mehr als drei Stunden nach der Isolierung zentrifugieren Sie alle Zellproben und resuspendieren die Pellets in fünf Milliliter des jeweils geeigneten Assay-Mediums für eine weitere Zentrifugation.Nach der zweiten Zentrifugation die Pellets in frischem Assay-Medium in der geeigneten experimentellen Konzentration resuspendieren, um ein Endvolumen von 180 Mikrolitern Zellen pro Vertiefung zu erreichen, und 180 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in die Platte geben. Die Zellen 25 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Platte zentrifugieren, um die Zellen fest am Boden der Vertiefungen anzubinden, und die Platte danach wieder in den Inkubator zurückstellen.Nach 30 Minuten frisch zubereitete 37 Grad Celsius warme Verbindungen mit einer Mikropipette in die entsprechenden Injektorbuchsen der Sensorpatrone des extrazellulären Flussanalysegeräts geben; Kontroll- und nicht experimentelle Buchsen mit Medium allein beladen. Die beladene Patrone zurück in den Inkubator stellen und das Programm für den extrazellulären Fluss-Assay einrichten. Anschließend die Patrone in das Gerät laden und das Programm starten; nach der Kalibrierung die Kalibrationsplatte wie angefordert durch die Assayplatte ersetzen.Nach dem extrazellulären Fluss-Assay führen Sie die Proteinbestimmungsanalysen durch. Über 90 % aller Zellpopulationen sind vital, wobei eine Reinheit von 98 bis 99 % für die Lymphozyten beobachtet wird. Die Konfluenz jedes Zelltyps korreliert mit den anfänglichen Ansiededichten.Die Proteinkonzentrationen des Lysats korrelieren linear mit den Ansäte-Dichten, was bestätigt, dass Proteinkonzentrationen zur genauen Normierung von extrazellulären Flussdaten verwendet werden können. Höhere Zellzahlen korrelieren mit höheren gemessenen Sauerstoffverbrauchsraten sowie mit stärker ausgeprägten Reaktionen auf mitochondriale Inhibitoren. Höhere Ansäte-Dichten führen bei T-Zellen und Milzzellen zu ähnlichen normierten Sauerstoffverbrauchsraten, während fünf- und 1,25-mal 10 hoch fünf Zellen pro Mulde bei B-Zellen zu ähnlichen normierten Sauerstoffverbrauchsraten führen.Die Parameter der mitochondrialen Atmung korrelieren ebenfalls linear mit den Ansiedlungsdichten. Zudem weist der geringe Protonenleck darauf hin, dass der größte Teil der Grundatmung für die ATP-Synthese genutzt wird. Höhere Ansiedlungsdichten führen zu höheren Raten der extrazellulären Versauerung und stärkeren Reaktionen auf mitochondriale Inhibitoren.Die Parameter der Glykolyse korrelieren linear mit den Zellansaatdichten, wobei die hohe Ansattdichte als am besten geeignet für einen erfolgreichen Glykolyse-Stress-Test ermittelt wurde. Glukose stimuliert die mitochondriale Atmung leicht, die durch Oligomycin gehemmt wird, während 2-DG den Sauerstoffverbrauch nicht signifikant beeinflusst. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in sechs bis acht Stunden abgeschlossen werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen vor der extrazellulären Flussanalyse auf Eis zu halten und die Zellen genau zu zählen und zu plattieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Messung des mitochondrialen Potentials und der Glukoseaufnahme durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Stoffwechselzustand der Zellen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lymphozyten isoliert und einen extrazellulären Fluss-Assay durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Messung der Glykolyse und mitochondrialen Atmung in primären menschlichen natürlichen Killerzellen (NK), die aus peripherem Blut isoliert sind, im Ruhezustand oder nach IL15-induzierter Aktivierung. Das beschriebene Protokoll könnte leicht auf primäre menschliche NK-Zellen ausgedehnt werden, die durch andere Zytokine oder lösliche Reize aktiviert werden.

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Die metabolische Anpassung ist für T-Zellen von grundlegender Bedeutung, da sie Differenzierung, Persistenz und Zytotoxizität bestimmt. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der mitochondrialen Atmung in ex vivo Zytokin-differenzierten humanen primären T-Zellen vorgestellt.

Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in zytokindifferenzierten humanen primären T-Zellen

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Die Bioenergetik der CD8-T-Zellen kann mit dem Mito Stresstest abgefragt werden. Diese Methodik kann verwendet werden, um die akute und chronische metabolische Programmierung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Untersuchung der Beziehungen zwischen der Biologie von T-Zell-Rezeptoren und der bioenergetischen Analyse.

Messung der mitochondrialen Funktion von naiven und Effektor-CD8-T-Zellen

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Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.

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Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

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Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

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