Name: Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie die ortsspezifische Antikörpermarkierung durch genetische Einbettung azidhaltiger Aminosäuren und SPAAC-Reaktion. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinmodifikationen für die chemische Biologie.

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1. Plasmidkonstruktion <ol><li> Konstruieren eines Expressionsplasmids (pBAD-HerFab-L177TAG) , die das Ziel - Antikörper - Gen (pBAD-HerFab-WT) mit einem His 6 -tag zum Ausdruck bringen würde, und ersetzen Sie das Codon für Leucin-177 mit dem Amber - Codon (TAG) 27, unter Verwendung von herkömmliche ortsspezifische Mutagenese-Technik. Siehe Tabelle der Materialien. </li><li> Konstruieren Sie ein anderes Expressionsplasmid (pEVOL-AFRS) , um die Gene für die entwickelte tRNA Tyr und Aminoacyl-tRNA - Synthetase (aaRS) Paar enthält. Verwenden Sie die speziell entwickelten Plasmidvektor, pEVOL, für einen effizienten Einbau von UAAs. Die detaillierten Informationen Plasmid und das Klonen Protokolle werden im vorherigen Bericht beschrieben. 28 </li><li> Erhalten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA durch kommerziell erhältliche Plasmid Vorbereitungs-Kits verwenden. Das 260/280 Verhältnis von ~ 1,8 ist optimal für die gereinigte DNA. Bei Bedarf durchführen 1% Agarose-Gelelektrophorese, die Reinheit der DNA zu überprüfen. </li></ol><ol><li> Elektroporation <ol><li> Fügen Sie jede 1 &amp; mgr; l DNA von pEVOL-AFRS 28 und pBAD-HerFab-L177TAG bis 20 &amp; mgr; l Escherichia coli DH10β Stamm. Vorsichtig mischen, mit einer Pipette. Die Plasmide können zusammen oder in unabhängigen Reaktionen umgewandelt werden. </li><li> Für 0,1 cm Küvetten, stellen Sie die Elektroporation Einstellungen bis 25 uF und 2,5 kV. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Folie von der schockierenden Kammer. Schieben Sie den Schlitten in die Kammer, bis die Küvette einen festen Kontakt mit den Kammerelektroden macht. </li><li> Pulse einmal durch den Puls-Taste, bis die Elektroporation Gerät einen Signalton drücken. </li><li> 1 ml SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium , enthaltend 2% (w / v) Trypton, 0,5% (w / v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und 20 mM Glucose in die Küvette um die Mischung in ein Reagenzglas schnell und übertragen. Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37 ° C unter Schütteln.</li><li> Spread transformierte E. coli - Zellen auf LB-Medium (LB) Agarplatten , die entsprechenden Antibiotika (35 ug / ml Chloramphenicol und 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion pEVOL-AFRS und pBAD-HerFab-L177TAG, respectively). Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 12 h. </li></ol></li><li> Kultur Vorbereitung <ol><li> Impfen eine einzelne transformierte Kolonie in 5 ml LB-Medium mit Antibiotika. Inkubieren für 12 h bei 37 ° C unter Schütteln. </li></ol></li></ol> 3. Expression und Reinigung von HerFab-L177AF <ol><li> Die Expression von HerFab-L177AF <ol><li> Übertragung der Primärkultur (5 ml) in 200 ml LB-Medium, das Ampicillin (100 ug / ml) und AF (1 mM), gefolgt von Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln. HINWEIS: 100 mM AF-Stammlösung (10 ml) wurde durch Auflösen von 206 mg AF in 100 mM Salzsäure (10 ml, Endvolumen) hergestellt. </li><li> In 2 ml 1,6 M Arabinose (16mM Endkonzentration) , wenn die Kultur der log-Phase erreicht (OD 550 = 0,8, OD = optische Dichte). Inkubieren für 12 h bei 30 ° C unter Schütteln. </li><li> Ernte die Zellen durch Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen und gefrier das Pellet bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Zelllyse <ol><li> die Mischung 1 h bei 37 ° C Resuspendieren der Zellpellets in 20 ml Puffer periplasmatischen Lyse, enthaltend 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% Sucrose und 0,2 mg / ml Lysozym und inkubieren. </li><li> Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000 × g bei 4 ° C für 15 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen und verwerfen das Pellet. </li></ol></li><li> Ni-NTA - Affinitätschromatographie <ol><li> Hinzufügen Ni-NTA-Harz Suspension zu jedem Zentrifugenröhrchen (400 &amp; mgr; l Harz für eine 200 ml-Kultur) und vorsichtig mischen bei 4 ° C für 1 h. </li><li> Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und wäscht das Harz dreimal mit 5 ml Wasch buffer enthaltend 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 20 mM Imidazol und 300 mM NaCl. </li><li> Eluieren des Zielantikörpers mit 300 &amp; mgr; l Elutionspuffer, der 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 250 mM Imidazol und 300 mM NaCl. </li><li> Bestimmen Konzentration des mutierten Proteins durch Bradford-Test 29 oder durch die Absorption bei 280 nm gemessen wird . Berechnen Sie den Extinktionskoeffizienten (75.866 M -1 cm -1) für HerFab-L177AF bei 280 nm durch Protein - Extinktionskoeffizient Rechner unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten (2471 M -1 cm -1) für AF. HINWEIS: Die Aminosäuresequenz von HerFab kann in der NCBI-Website (: 783.282.791 und GI: 783282792 GI) zu finden. </li></ol></li></ol> 4. Konjugation von Purified HerFab-L177AF mit Alkin-Sonden mit Dehnungs geförderten Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC) <ol><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) in H 2 O (20081; M Endkonzentration) wurde zu einer Lösung von 10 &amp; mgr; l-HerFab L177AF (10 uM Endkonzentration) in Phosphatpuffer 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) und 100 mM NaCl enthält. HINWEIS: Als Alternativen difluoriert Cyclooctin (DIFO) und Bicyclo [6.1.0] Nonin (BCN) Derivate sind für die gleiche Anwendung ebenfalls zur Verfügung. </li><li> Lassen Sie die dehnungs gefördert Cycloadditionsreaktion für 6 h bei 37 ° C fortzufahren. Wenn eine lichtempfindliche Sonde (zB Cy5.5) verwendet wird, umfassen das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie. </li><li> Man reinige den markierten HerFab gemäß Schritt 5. </li></ol> 5. Reinigung von Beschriftete HerFab <ol><li> Fügen 500 ul Probe einem Zentrifugalfilter Spinsäule. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 14.000 × g bei 4 ° C für 15 min. </li><li> Durchfluss verwerfen und Transferprobe aus dem Spin-Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gereinigt. </li><li> Als Alternative 5.1- 5.3 zu Schritt, führen Purification durch Dialyse gegen den gleichen Puffer. </li><li> Lagern Sie die gereinigte markierte HerFab bei 4 ° C. </li></ol> 6. SDS-PAGE-Analyse von Beschriftete HerFab <ol><li> Werden 5 &amp; mgr; l LDS Proteinprobenpuffer mit 106 mM Tris · HCl, 141 mM Tris-Base (pH 8,5), 2% LDS, 10% Glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blau G250 und 0,175 mM Phenolrot bis 13 &amp; mgr; l (-) von 2 &amp; mgr; l Dithiothreitol (DTT, 100 mM Endkonzentration) HerFab (7,8 uM bzw. 0,38 mg / ml) in Gegenwart (+) oder Abwesenheit markierter gereinigt. Inkubieren der Mischung bei 95 ° C für 10 min. </li><li> Bringen Sie die 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE-Gel-Kassette in die Elektrophorese-Zelle und fügen Puffer läuft. Laden Sie die konjugierte Proteinproben und die vorgefärbten Molekulargewichtsmarker. Führen Gelelektrophorese für 35 min bei 200 V. Hinweis: Halten Sie die Elektrophorese-Zelle im Dunkeln während des gesamten Zeitraums Photobleaching des Fluorophors zu minimieren. </li><li> Nach der Elektrophorese übertragendas Gel mit einem Fluoreszenz-Gel-Scanners und Scannen für die Fluoreszenzemission bei der entsprechenden Wellenlänge. Für Cy5.5, verwenden Sie die Cy5-Modus in der Scanner-Software. </li><li> Beflecken das Gel mit einem handelsüblichen Proteinfleck. </li></ol>

<ol><li>Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).</li>
<li>Wu, X., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+at+the+interface+of+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis at the interface of chemistry and biology.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+the+keto+functional+groupto+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli.</a> proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Deiters, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+incorporation+of+an+alkyne+into+proteins+in+Esshcerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+transcyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).</li>
<li>Lee, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+acrylamide+fuctionality%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded acrylamide fuctionality.</a> ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+norbornene+directs+site-specific+cellular+protein+labelling+via+a+rapid+bioorthogonal+raction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction.</a> Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Cu-free+click+chemistry+with+readily+synthesized+biarylazacyclooctynones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azadibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283+%2B+2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition.</a> Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanism+to+mouse%3A+a+tale+of+two+bioorthogonal+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+with+strained+alkenes+and+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation with strained alkenes and alkynes.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).</li>
<li>Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne%E2%88%92azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).</li>
<li>Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+using+catalyst-free+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).</li>
<li>Yao, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+targeting+to+cellular+proteins+via+enzymemediated+azide+ligation+and+strain-promoted+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).</li>
<li>Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+bioorthogonal+functionalities+into+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).</li>
<li>Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue+choice+defines+efficiency+and+influence+of+bioorthogonal+protein+modification+via+genetically+encoded+strain+promoted+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry.</a> Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+concept+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).</li>
<li>Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staudinger+modification+of+proteins+containing+p-Azidophenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine.</a> ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).</li>
<li>Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+and+efficient+method+for+the+site-specific+dual-labeling+of+proteins+for+single+molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+strategies+for+single-molecule+protein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Click strategies for single-molecule protein fluorescence.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Kazane, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+antibody+multimers+through+peptide+nucleic+acid+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).</li>
<li>Ko, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+site-specific+antibody+labeling+by+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cho, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+extracellular+region+of+HER2+alone+and+in+complex+with+the+Herceptin+Fab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab.</a> Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die genetische Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine ​​hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Proteinmodifikation verwendet. 1-3 Einer der wichtigen Vorteile ist die allgemeine Anwendbarkeit auf jede Art von Protein. Im Prinzip gibt es keine Begrenzung für ein Zielprotein und eine Zielstelle des Proteins in der Auswahl. Jedoch Ersetzen eines strukturell oder funktionell wichtigen Rückstand mit einem UAA resultieren, die die Struktur und Funktion des Zielproteins in verändern. Im Allgemein...

Da der genetische Einbau von p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli wurde berichtet, 1 mehr als 100 unnatürliche Aminosäuren (UAAs) wurden in verschiedene Proteine erfolgreich eingebaut. 1-3 Unter diesen UAAs die Aminosäuren bioorthogonale funktionellen Gruppen wurden intensiv untersucht und stellen den größten Anteil enthält. Die bioorthogonale funktionellen Gruppen in den UAAs verwendet werden , umfassen Ketone, 4 Azid, 5 Alkin, 6 Cyclooctin, 7 Tetrazin, 8 α, β-ungesättigten Amids, 9 Norbonen, 10 transcyclooctene, 11 und Bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Obwohl jede funktionelle Gruppe ihre Vor- und Nachteile hat, die azidhaltigen Aminosäuren am intensivsten wurden für die Protein Konjugation verwendet. p -Azidophenylalanine (AF), eine der Azido-enthaltenden Aminosäuren, ist leicht verfügbar, und ihre Inkorporation efficiency ist ausgezeichnet. Mutant Proteine ​​diese Aminosäure enthalten, können mit Alkinen durch Kupfer-katalysierte Cyclo oder mit Cyclooctenen von SPAAC umgesetzt werden. 12-20 In letzter Zeit wurden Biopharmazeutika große Aufmerksamkeit in der pharmazeutischen Industrie zu gewinnen. Der Antikörper-Arzneimittel - Konjugat (ADC) ist eine Klasse von therapeutischen Antikörpern , die aufgrund ihrer Fähigkeit zur gezielten Therapie für die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen 21 vorteilhaft sind und anderen Krankheiten. Mehr als 50 ADCs sind derzeit in klinischen Studien, und die Zahl steigt schnell. In Entwicklung von ADCs, müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit zu maximieren und die Nebenwirkungen zu minimieren. Unter diesen Faktoren eine effiziente und stellenspezifische Konjugationsreaktion zu einer kovalenten Bindung zwischen einem Antikörper bilden, und ein Medikament ist kritisch. Die gewünschte Effizienz und Spezifität in der Konjugationsreaktion kann in eine durch Konjugation mit einem bioorthogonale funktionelle Gruppe erreicht werden,unnatürliche Aminosäure, die in einem Antikörper, der spezifisch eingeschlossen ist. Hier 22-26 berichten wir über ein Protokoll zur ortsspezifisch integrieren AF in einem Antikörper-Fragment und konjugieren das mutierte Antikörperfragment mit einer biochemischen Sonde.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Plasmid Construction</td></tr><tr><td>plasmid pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>Optional das gelbe Stoppcodon (TAG) an einer gewünschten Position enthalten. Ko, W. et al. Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plasmid pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. und Schultz, P. G. Ein verbessertes System für die Mutagenese unnatürlicher Aminosäuren in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression</td></tr><tr><td>Host Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nukleogen</td><td>5112</td><td>200/Packung</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron Biotechnologie</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4">2. Kulturvorbereitung</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Elektroporation</td></tr><tr><td>Mikropulser</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Mikropulser Küvette</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm Elektrodenabstand, pkg. von 50</td></tr><tr><td>Ampicillin Natrium</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. Expression und Reinigung von HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Expression von Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-phenylalanine (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Salzsäure, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3.2 Zelllyse</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalzdihydrat, 99,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">3.3 Ni-NTA Affinitätschromatographie</stark></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Harz</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Polypropylen-Säule</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/Packung, 1 ml Kapazität</td></tr><tr><td>Imidazol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>4. Konjugation von gereinigtem HerFab-L177AF mit Alkinsonden unter Verwendung von Strain-promoted Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC)</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">5. Reinigung von markierten HerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfiltern</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/Packung, 500 &#956; L capacity</td></tr><tr><td colspan="4">6. SDS-PAGE Analyse von markiertem HerFab und Fluoreszenzgel Scanning</td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES Laufpuffer</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE Gele</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12-well</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 variabler Imager</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente und ortsspezifische antikörpermarkierung von dehnungs gefördert azid-alkin-cyclo

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Derzeit gibt es viele chemische Werkzeuge zur Verfügung, chemische Sonden in Proteine ​​einzuführen ihrer Struktur und Funktion zu untersuchen. Ein geeignetes Verfahren ist Proteinkonjugation durch genetisch eine unnatürliche Aminosäure Einführen einer bioorthogonale funktionelle Gruppe enthalten. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Protokoll für die ortsspezifische Antikörper-Konjugation. Das Protokoll umfasst die experimentelle Details für die genetische Einbau eines azidhaltigen Aminosäure und die Konjugationsreaktion durch dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC). Dieser Stamm-vermittelte Reaktion verläuft durch einfaches Mischen der reagierenden Moleküle bei physiologischem pH-Wert und Temperatur, und erfordert keine zusätzlichen Reagenzien wie Kupfer (I) -Ionen und Kupfer-Chelat-Liganden. Daher würde diese Methode für die allgemeine Proteinkonjugation und Entwicklung von Antikörper-Arzneimittel-Konjugate (ADCs) nützlich sein.

In dieser Studie wurde ein Antikörperfragment ortsspezifisch mit einem Fluorophor konjugiert durch ein Azid enthaltenden Aminosäure in dem Fragment enthält , und das mutante Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctin Umsetzung von (Abbildung 1). HerFab wurde als Zielantikörperfragment ausgewählt ist, in die AF als Azid-enthaltende Aminosäure eingebaut wurde. Zu dem Rückstand in HerFab für den Ersatz mit AF, die Röntgenkristallstruktur von HerFab wählen, wurde ana...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur ortsspezifischen Einführung chemischer Sonden in ein Antikörperfragment, indem eine azidhaltige Aminosäure genetisch eingebaut und anschließend das Azid mit einer chemischen Sonde durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) gekoppelt wird.

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, chemische Sonden gezielt in ein Antikörperfragment einzubauen, indem ein azidhaltiges Aminosäurederivat genetisch integriert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Chemischen Biologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Proteinmodifikation, des Protein-Engineerings und der Konjugation. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die gewünschte Sonde oder Substanz durch einfaches Mischen gezielt in Proteine oder Antikörper eingefügt werden kann.Nach der Konstruktion der Plasmide jeweils ein Mikroliter zu 20 Mikrolitern E. coli-Stamm DH10-beta mit einer Konzentration von zwei mal 10 hoch acht Zellen pro Mikroliter in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Die Lösung vorsichtig mit einer Pipette mischen. Anschließend 20 Mikroliter der gemischten Lösung in eine saubere Küvette geben.Stellen Sie das Elektroporationsgerät auf 25 Mikrofarad und 2,5 Kilovolt ein. Setzen Sie dann die Küvette in die Schiene der Schockkammer ein. Schieben Sie die Schiene in die Kammer, bis die Küvette festen Kontakt mit den Elektroden der Kammer herstellt.Drücken Sie einmal den Pulsknopf, bis das Elektropora

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker...

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

DNA und Proteine ​​sequenzspezifisch mit Affinität oder fluoreszierenden Reportergruppen mit DNA- oder Protein-Methyltransferasen und synthetischen Cofaktor-Analoga bezeichnet. Abhängig von der Cofaktor-Spezifität der Enzyme, Aziridin- oder doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden für ein- oder zweistufige Kennzeichnung verwendet.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

Photostabile Cyaninfarbstoffe werden an Oligonukleotide gebunden, um die Hybridisierung durch Energietransfer zu überwachen.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Ein detailliertes Verfahren für die Synthese eines 125 I-markierten Azid und die radioaktiven Markierung von dibenzocyclooctyne (DBCO) -Gruppe-konjugierten, 13 nm große Goldnanopartikel einen kupferfreien Klick - Reaktion beschrieben.

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von<sup&gt; 125</sup&gt; I-markiertem Azide prosthetische Gruppe

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Einbeziehung einer Cyclopropen-Derivat von Lysin in Antikörper ermöglicht die ortsspezifische, schnelle und effiziente Verknüpfung von kurz-tragenden Moleküle, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate zu generieren.

Durch eine schnelle Bioorthogonal Reaktion Konjugate genetischen Codierung einer nicht-kanonische Aminosäure für die Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff

In diesem Protokoll wird die Synthese von Hülsen, ein Phenyoxadiazolyl Methyl Sulfon-basierte Reagenz für die Website-selektive Befestigung der Ladungen an die Thiole von Biomolekülen, insbesondere Antikörper beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir die Synthese und Charakterisierung von eine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelator und die Konjugation zu einem Modell-Antikörper.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Fluoreszierend getaggte Antibiotika sind leistungsstarke Werkzeuge, die verwendet werden können, um mehrere Aspekte der antibiotika-resistenz zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von fluoreszierend markierten Antibiotika und ihre Anwendung auf die Untersuchung von Antibiotikaresistenzen bei Bakterien. Sonden können verwendet werden, um Mechanismen der bakteriellen Resistenz (z. B. Efflux) durch Spektrophotometrie, Durchflusszytometrie und Mikroskopie zu untersuchen.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Erfahren Sie die ortsspezifische Antikörpermarkierung durch genetische Einbettung azidhaltiger Aminosäuren und SPAAC-Reaktion. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinmodifikationen für die chemische Biologie.

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

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