Name: Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie die ortsspezifische Antikörpermarkierung durch genetische Einbettung azidhaltiger Aminosäuren und SPAAC-Reaktion. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinmodifikationen für die chemische Biologie.

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1. Plasmidkonstruktion <ol><li> Konstruieren eines Expressionsplasmids (pBAD-HerFab-L177TAG) , die das Ziel - Antikörper - Gen (pBAD-HerFab-WT) mit einem His 6 -tag zum Ausdruck bringen würde, und ersetzen Sie das Codon für Leucin-177 mit dem Amber - Codon (TAG) 27, unter Verwendung von herkömmliche ortsspezifische Mutagenese-Technik. Siehe Tabelle der Materialien. </li><li> Konstruieren Sie ein anderes Expressionsplasmid (pEVOL-AFRS) , um die Gene für die entwickelte tRNA Tyr und Aminoacyl-tRNA - Synthetase (aaRS) Paar enthält. Verwenden Sie die speziell entwickelten Plasmidvektor, pEVOL, für einen effizienten Einbau von UAAs. Die detaillierten Informationen Plasmid und das Klonen Protokolle werden im vorherigen Bericht beschrieben. 28 </li><li> Erhalten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA durch kommerziell erhältliche Plasmid Vorbereitungs-Kits verwenden. Das 260/280 Verhältnis von ~ 1,8 ist optimal für die gereinigte DNA. Bei Bedarf durchführen 1% Agarose-Gelelektrophorese, die Reinheit der DNA zu überprüfen. </li></ol><ol><li> Elektroporation <ol><li> Fügen Sie jede 1 &amp; mgr; l DNA von pEVOL-AFRS 28 und pBAD-HerFab-L177TAG bis 20 &amp; mgr; l Escherichia coli DH10β Stamm. Vorsichtig mischen, mit einer Pipette. Die Plasmide können zusammen oder in unabhängigen Reaktionen umgewandelt werden. </li><li> Für 0,1 cm Küvetten, stellen Sie die Elektroporation Einstellungen bis 25 uF und 2,5 kV. </li><li> Setzen Sie die Küvette in die Folie von der schockierenden Kammer. Schieben Sie den Schlitten in die Kammer, bis die Küvette einen festen Kontakt mit den Kammerelektroden macht. </li><li> Pulse einmal durch den Puls-Taste, bis die Elektroporation Gerät einen Signalton drücken. </li><li> 1 ml SOB-Medium mit Katabolitrepression (SOC) Medium , enthaltend 2% (w / v) Trypton, 0,5% (w / v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und 20 mM Glucose in die Küvette um die Mischung in ein Reagenzglas schnell und übertragen. Inkubieren der Zellen für 1 h bei 37 ° C unter Schütteln.</li><li> Spread transformierte E. coli - Zellen auf LB-Medium (LB) Agarplatten , die entsprechenden Antibiotika (35 ug / ml Chloramphenicol und 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion pEVOL-AFRS und pBAD-HerFab-L177TAG, respectively). Inkubiere die Platten bei 37 ° C für 12 h. </li></ol></li><li> Kultur Vorbereitung <ol><li> Impfen eine einzelne transformierte Kolonie in 5 ml LB-Medium mit Antibiotika. Inkubieren für 12 h bei 37 ° C unter Schütteln. </li></ol></li></ol> 3. Expression und Reinigung von HerFab-L177AF <ol><li> Die Expression von HerFab-L177AF <ol><li> Übertragung der Primärkultur (5 ml) in 200 ml LB-Medium, das Ampicillin (100 ug / ml) und AF (1 mM), gefolgt von Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln. HINWEIS: 100 mM AF-Stammlösung (10 ml) wurde durch Auflösen von 206 mg AF in 100 mM Salzsäure (10 ml, Endvolumen) hergestellt. </li><li> In 2 ml 1,6 M Arabinose (16mM Endkonzentration) , wenn die Kultur der log-Phase erreicht (OD 550 = 0,8, OD = optische Dichte). Inkubieren für 12 h bei 30 ° C unter Schütteln. </li><li> Ernte die Zellen durch Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min. Überstand verwerfen und gefrier das Pellet bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Zelllyse <ol><li> die Mischung 1 h bei 37 ° C Resuspendieren der Zellpellets in 20 ml Puffer periplasmatischen Lyse, enthaltend 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% Sucrose und 0,2 mg / ml Lysozym und inkubieren. </li><li> Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000 × g bei 4 ° C für 15 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen und verwerfen das Pellet. </li></ol></li><li> Ni-NTA - Affinitätschromatographie <ol><li> Hinzufügen Ni-NTA-Harz Suspension zu jedem Zentrifugenröhrchen (400 &amp; mgr; l Harz für eine 200 ml-Kultur) und vorsichtig mischen bei 4 ° C für 1 h. </li><li> Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und wäscht das Harz dreimal mit 5 ml Wasch buffer enthaltend 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 20 mM Imidazol und 300 mM NaCl. </li><li> Eluieren des Zielantikörpers mit 300 &amp; mgr; l Elutionspuffer, der 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 250 mM Imidazol und 300 mM NaCl. </li><li> Bestimmen Konzentration des mutierten Proteins durch Bradford-Test 29 oder durch die Absorption bei 280 nm gemessen wird . Berechnen Sie den Extinktionskoeffizienten (75.866 M -1 cm -1) für HerFab-L177AF bei 280 nm durch Protein - Extinktionskoeffizient Rechner unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten (2471 M -1 cm -1) für AF. HINWEIS: Die Aminosäuresequenz von HerFab kann in der NCBI-Website (: 783.282.791 und GI: 783282792 GI) zu finden. </li></ol></li></ol> 4. Konjugation von Purified HerFab-L177AF mit Alkin-Sonden mit Dehnungs geförderten Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC) <ol><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) in H 2 O (20081; M Endkonzentration) wurde zu einer Lösung von 10 &amp; mgr; l-HerFab L177AF (10 uM Endkonzentration) in Phosphatpuffer 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) und 100 mM NaCl enthält. HINWEIS: Als Alternativen difluoriert Cyclooctin (DIFO) und Bicyclo [6.1.0] Nonin (BCN) Derivate sind für die gleiche Anwendung ebenfalls zur Verfügung. </li><li> Lassen Sie die dehnungs gefördert Cycloadditionsreaktion für 6 h bei 37 ° C fortzufahren. Wenn eine lichtempfindliche Sonde (zB Cy5.5) verwendet wird, umfassen das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie. </li><li> Man reinige den markierten HerFab gemäß Schritt 5. </li></ol> 5. Reinigung von Beschriftete HerFab <ol><li> Fügen 500 ul Probe einem Zentrifugalfilter Spinsäule. </li><li> Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 14.000 × g bei 4 ° C für 15 min. </li><li> Durchfluss verwerfen und Transferprobe aus dem Spin-Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gereinigt. </li><li> Als Alternative 5.1- 5.3 zu Schritt, führen Purification durch Dialyse gegen den gleichen Puffer. </li><li> Lagern Sie die gereinigte markierte HerFab bei 4 ° C. </li></ol> 6. SDS-PAGE-Analyse von Beschriftete HerFab <ol><li> Werden 5 &amp; mgr; l LDS Proteinprobenpuffer mit 106 mM Tris · HCl, 141 mM Tris-Base (pH 8,5), 2% LDS, 10% Glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blau G250 und 0,175 mM Phenolrot bis 13 &amp; mgr; l (-) von 2 &amp; mgr; l Dithiothreitol (DTT, 100 mM Endkonzentration) HerFab (7,8 uM bzw. 0,38 mg / ml) in Gegenwart (+) oder Abwesenheit markierter gereinigt. Inkubieren der Mischung bei 95 ° C für 10 min. </li><li> Bringen Sie die 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE-Gel-Kassette in die Elektrophorese-Zelle und fügen Puffer läuft. Laden Sie die konjugierte Proteinproben und die vorgefärbten Molekulargewichtsmarker. Führen Gelelektrophorese für 35 min bei 200 V. Hinweis: Halten Sie die Elektrophorese-Zelle im Dunkeln während des gesamten Zeitraums Photobleaching des Fluorophors zu minimieren. </li><li> Nach der Elektrophorese übertragendas Gel mit einem Fluoreszenz-Gel-Scanners und Scannen für die Fluoreszenzemission bei der entsprechenden Wellenlänge. Für Cy5.5, verwenden Sie die Cy5-Modus in der Scanner-Software. </li><li> Beflecken das Gel mit einem handelsüblichen Proteinfleck. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die genetische Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine ​​hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Proteinmodifikation verwendet. 1-3 Einer der wichtigen Vorteile ist die allgemeine Anwendbarkeit auf jede Art von Protein. Im Prinzip gibt es keine Begrenzung für ein Zielprotein und eine Zielstelle des Proteins in der Auswahl. Jedoch Ersetzen eines strukturell oder funktionell wichtigen Rückstand mit einem UAA resultieren, die die Struktur und Funktion des Zielproteins in verändern. Im Allgemein...

Da der genetische Einbau von p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli wurde berichtet, 1 mehr als 100 unnatürliche Aminosäuren (UAAs) wurden in verschiedene Proteine erfolgreich eingebaut. 1-3 Unter diesen UAAs die Aminosäuren bioorthogonale funktionellen Gruppen wurden intensiv untersucht und stellen den größten Anteil enthält. Die bioorthogonale funktionellen Gruppen in den UAAs verwendet werden , umfassen Ketone, 4 Azid, 5 Alkin, 6 Cyclooctin, 7 Tetrazin, 8 α, β-ungesättigten Amids, 9 Norbonen, 10 transcyclooctene, 11 und Bicyclo [6.1.0] -nonyne. 11 Obwohl jede funktionelle Gruppe ihre Vor- und Nachteile hat, die azidhaltigen Aminosäuren am intensivsten wurden für die Protein Konjugation verwendet. p -Azidophenylalanine (AF), eine der Azido-enthaltenden Aminosäuren, ist leicht verfügbar, und ihre Inkorporation efficiency ist ausgezeichnet. Mutant Proteine ​​diese Aminosäure enthalten, können mit Alkinen durch Kupfer-katalysierte Cyclo oder mit Cyclooctenen von SPAAC umgesetzt werden. 12-20 In letzter Zeit wurden Biopharmazeutika große Aufmerksamkeit in der pharmazeutischen Industrie zu gewinnen. Der Antikörper-Arzneimittel - Konjugat (ADC) ist eine Klasse von therapeutischen Antikörpern , die aufgrund ihrer Fähigkeit zur gezielten Therapie für die Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen 21 vorteilhaft sind und anderen Krankheiten. Mehr als 50 ADCs sind derzeit in klinischen Studien, und die Zahl steigt schnell. In Entwicklung von ADCs, müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit zu maximieren und die Nebenwirkungen zu minimieren. Unter diesen Faktoren eine effiziente und stellenspezifische Konjugationsreaktion zu einer kovalenten Bindung zwischen einem Antikörper bilden, und ein Medikament ist kritisch. Die gewünschte Effizienz und Spezifität in der Konjugationsreaktion kann in eine durch Konjugation mit einem bioorthogonale funktionelle Gruppe erreicht werden,unnatürliche Aminosäure, die in einem Antikörper, der spezifisch eingeschlossen ist. Hier 22-26 berichten wir über ein Protokoll zur ortsspezifisch integrieren AF in einem Antikörper-Fragment und konjugieren das mutierte Antikörperfragment mit einer biochemischen Sonde.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Plasmid Construction</td></tr><tr><td>plasmid pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>Optional das gelbe Stoppcodon (TAG) an einer gewünschten Position enthalten. Ko, W. et al. Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plasmid pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. und Schultz, P. G. Ein verbessertes System für die Mutagenese unnatürlicher Aminosäuren in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression</td></tr><tr><td>Host Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nukleogen</td><td>5112</td><td>200/Packung</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron Biotechnologie</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4">2. Kulturvorbereitung</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Elektroporation</td></tr><tr><td>Mikropulser</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Mikropulser Küvette</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm Elektrodenabstand, pkg. von 50</td></tr><tr><td>Ampicillin Natrium</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. Expression und Reinigung von HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Expression von Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-phenylalanine (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Salzsäure, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3.2 Zelllyse</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalzdihydrat, 99,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">3.3 Ni-NTA Affinitätschromatographie</stark></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Harz</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Polypropylen-Säule</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/Packung, 1 ml Kapazität</td></tr><tr><td>Imidazol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>4. Konjugation von gereinigtem HerFab-L177AF mit Alkinsonden unter Verwendung von Strain-promoted Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC)</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">5. Reinigung von markierten HerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfiltern</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/Packung, 500 &#956; L capacity</td></tr><tr><td colspan="4">6. SDS-PAGE Analyse von markiertem HerFab und Fluoreszenzgel Scanning</td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES Laufpuffer</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE Gele</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12-well</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 variabler Imager</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente und ortsspezifische antikörpermarkierung von dehnungs gefördert azid-alkin-cyclo

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Derzeit gibt es viele chemische Werkzeuge zur Verfügung, chemische Sonden in Proteine ​​einzuführen ihrer Struktur und Funktion zu untersuchen. Ein geeignetes Verfahren ist Proteinkonjugation durch genetisch eine unnatürliche Aminosäure Einführen einer bioorthogonale funktionelle Gruppe enthalten. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Protokoll für die ortsspezifische Antikörper-Konjugation. Das Protokoll umfasst die experimentelle Details für die genetische Einbau eines azidhaltigen Aminosäure und die Konjugationsreaktion durch dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC). Dieser Stamm-vermittelte Reaktion verläuft durch einfaches Mischen der reagierenden Moleküle bei physiologischem pH-Wert und Temperatur, und erfordert keine zusätzlichen Reagenzien wie Kupfer (I) -Ionen und Kupfer-Chelat-Liganden. Daher würde diese Methode für die allgemeine Proteinkonjugation und Entwicklung von Antikörper-Arzneimittel-Konjugate (ADCs) nützlich sein.

In dieser Studie wurde ein Antikörperfragment ortsspezifisch mit einem Fluorophor konjugiert durch ein Azid enthaltenden Aminosäure in dem Fragment enthält , und das mutante Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctin Umsetzung von (Abbildung 1). HerFab wurde als Zielantikörperfragment ausgewählt ist, in die AF als Azid-enthaltende Aminosäure eingebaut wurde. Zu dem Rückstand in HerFab für den Ersatz mit AF, die Röntgenkristallstruktur von HerFab wählen, wurde ana...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur ortsspezifischen Einführung chemischer Sonden in ein Antikörperfragment, indem eine azidhaltige Aminosäure genetisch eingebaut und anschließend das Azid mit einer chemischen Sonde durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) gekoppelt wird.

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, chemische Sonden durch genetischen Einbau einer azidhaltigen Aminosäure ortsspezifisch in ein Antikörperfragment einzubringen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der chemischen Biologie zu beantworten, z. B. bei der Proteinmodifikation, dem Engineering und der Konjugation. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Ihre Zielsonde oder Bouillon durch einfaches Mischen ortsspezifisch in Proteine oder Antikörper eingebracht werden kann.Nach dem Aufbau der Plasmide wird jeweils ein Mikroliter zu 20 Mikrolitern E.Coli Stamm DH10-beta in einer Konzentration von zweimal 10 zu den acht Zellen pro Mikroliter in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen gegeben. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung vorsichtig zu mischen. Geben Sie dann 20 Mikroliter der gemischten Lösung in eine saubere Küvette.Stellen Sie die Elektroporationsmaschine auf 25 Mikrofarad und 2,5 Kilovolt ein. Setzen Sie dann die Küvette in den Schieber der Schockkammer ein. Schieben Sie den Objektträger in die Kammer, bis die Küvette festen Kontakt mit den Kammerelektroden hat.Drücken Sie die Impulstaste einmal, bis das Elektroporationsgerät piept. Geben Sie danach schnell einen Milliliter SOC-Medium in die Küvette. Gib die Mischung dann in ein Reagenzglas.Eine Stunde lang unter Schütteln bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach Abschluss der Inkubation verteilen Sie die transformierten E.Coli-Zellen auf Lysogenie-Boule-Agarplatten, die geeignete Antibiotika enthalten. Inkubieren Sie die Platten 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Nach Abschluss der Platteninkubation wird eine einzelne transformierte Kolonie in fünf Milliliter LB-Medium inokuliert, das Antibiotika enthält. Inkubieren Sie unter Schütteln für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius. Dann überführen Sie die Primärkultur in 200 Milliliter LB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und einem Millimolaren Vorhofflimmern. Inkubieren Sie unter Schütteln bei 37 Grad Celsius für mindestens drei Stunden.Fügen Sie zwei Milliliter 1,6 molare Arabinose hinzu, wenn die Kultur eine optische Dichte von 0,8 bei 550 Nanometern erreicht. Dann unter Schütteln bei 30 Grad Celsius 12 Stunden lang inkubieren. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 11.000 g für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet bei minus 20 Grad Celsius ein. Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu lysieren, suspendieren Sie das Pellet in 20 Millilitern paraplasmatischem Lysepuffer in einem frischen Zentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Als nächstes zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Fügen Sie dann 400 Mikroliter einer Ni-NTA-Harzsuspension hinzu.Bewegen Sie das Röhrchen mit einem Rotator eine Stunde lang bei vier Grad Celsius vorsichtig. Gießen Sie die Suspension nach Beendigung des Mischens in eine Polypropylensäule. Waschen Sie das Harz dreimal mit fünf Millilitern Waschpuffer.Eluieren Sie den Zielantikörper mit 300 Mikrolitern Elutionspuffer. Bestimmen Sie danach die Konzentration des mutierten Proteins, wie im Textprotokoll beschrieben. Beginnen Sie mit der Zugabe von 10 Mikrolitern einer 10 mikromolaren Lösung von HerFab-L177AF in Phosphatpuffer, der 10 millimolare Natriumphosphat zweibasisch und 100 millimolare Natriumchlorid enthält, in ein frisches Zentrifugenröhrchen.Fügen Sie dann 20 Mikroliter einer 200 mikromolaren Lösung von Cy 5,5 Azadibenzocyclooctyn in Wasser hinzu. Decken Sie danach das Reaktionsgefäß mit Alufolie ab. Lassen Sie die durch Färbung geförderte Cyclo-Edition-Reaktion sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius ablaufen.Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, fügen Sie 30 Mikroliter Probe und 450 Mikroliter Phosphatpuffer hinzu, um den freien Farbstoff Cy 5,5 in einer Zentrifugalfilter-Spin-Säule zu waschen. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 14.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Durchfluss und geben Sie die gereinigte Probe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Lagern Sie das gereinigte markierte HerFab bei vier Grad Celsius, es sei denn, es ist bereit für die Analyse. Beginnen Sie mit der Zugabe von 13 Mikrolitern 7,8 mikromolar gereinigtem HerFab in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie dann fünf Mikroliter LDS-Proteinprobenpuffer hinzu.Inkubieren Sie die Mischung bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Befestigen Sie nach der Inkubation die vier bis 12%ige Bis-Tris SDS-PAGE Gelkassette an der Elektrophoresezelle. Fügen Sie einen laufenden Puffer hinzu.Laden Sie anschließend die konjugierten Proteinproben in den vorgefärbten Molekulargewichtshersteller. Führen Sie eine Gelelektrophorese für 35 Minuten bei 200 Volt durch. Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist, übertragen Sie das Gel in ein Geldokumentations- und Analysesystem.Scannen Sie nach Cy 5,5 und färben Sie das Gel dann mit einer handelsüblichen Proteinfärbung. In dieser Arbeit wird das Antikörperfragment Her-Fab ortsspezifisch mit einem konjugiert. Dies wird erreicht, indem eine azidhaltige Aminosäure in das Fragment eingebaut wird und dann das mutierte Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctyn reagiert wird. Die SDS-PAGE-Analyse wird für mutierte Proteine durchgeführt, die sowohl mit als auch ohne die azidhaltige Aminosäure exprimiert werden.Wie zu sehen ist, wurde das Antikörperfragment in voller Länge nur in Gegenwart der Aminosäure erhalten. Der Antikörper, der die Aminosäure enthält, wird für die Konjugation durch Reaktion mit einem Cy 5,5-verknüpften Azadibenzocyclooctyn-Derivat Cy 5,5 evaluiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Die Fluoreszenzbilder zeigen eine Konjugation des mutierten Antikörperfragments mit Cy 5,5, während bei der Kontrolle keine Konjugation beobachtet wurde.Sobald das Protein richtig exprimiert und mit Acetylphenylalanin gereinigt wurde, kann das Protein effizient mit einer Sonde mit dem Stamm markiert werden. Da für die Markierungsreaktion kein zusätzliches Reagenz erforderlich ist, können Sie die Sonde in Ihr Zielprotein einführen, indem Sie die Sonde einfach mit Ihrem Protein mischen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine chemische Sonde ortsspezifisch in ein Antikörperfragment einführen, indem Sie eine azidhaltige Aminosäure genetisch einbauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker...

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

Wir genetisch kodieren die unnatürliche Aminosäure, p-Azido-L-Phenylalanin in verschiedenen gezielten Positionen in GPCRs und zeigen die Vielseitigkeit der Azidogruppe in verschiedenen Anwendungen. Dazu gehören eine gezielte Photo Technologie, um Rückstände in der Ligandenbindungstasche eines GPCR identifizieren und ortsspezifische Modifikation von GPCRs bioorthogonale mit einem Peptid-Epitop-Tag oder fluoreszierende Sonde.

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

DNA und Proteine ​​sequenzspezifisch mit Affinität oder fluoreszierenden Reportergruppen mit DNA- oder Protein-Methyltransferasen und synthetischen Cofaktor-Analoga bezeichnet. Abhängig von der Cofaktor-Spezifität der Enzyme, Aziridin- oder doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden für ein- oder zweistufige Kennzeichnung verwendet.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

Photostabile Cyaninfarbstoffe werden an Oligonukleotide gebunden, um die Hybridisierung durch Energietransfer zu überwachen.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Ein detailliertes Verfahren für die Synthese eines 125 I-markierten Azid und die radioaktiven Markierung von dibenzocyclooctyne (DBCO) -Gruppe-konjugierten, 13 nm große Goldnanopartikel einen kupferfreien Klick - Reaktion beschrieben.

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von<sup&gt; 125</sup&gt; I-markiertem Azide prosthetische Gruppe

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Einbeziehung einer Cyclopropen-Derivat von Lysin in Antikörper ermöglicht die ortsspezifische, schnelle und effiziente Verknüpfung von kurz-tragenden Moleküle, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate zu generieren.

Durch eine schnelle Bioorthogonal Reaktion Konjugate genetischen Codierung einer nicht-kanonische Aminosäure für die Erzeugung von Antikörper-Wirkstoff

In diesem Protokoll wird die Synthese von Hülsen, ein Phenyoxadiazolyl Methyl Sulfon-basierte Reagenz für die Website-selektive Befestigung der Ladungen an die Thiole von Biomolekülen, insbesondere Antikörper beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir die Synthese und Charakterisierung von eine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelator und die Konjugation zu einem Modell-Antikörper.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Fluoreszierend getaggte Antibiotika sind leistungsstarke Werkzeuge, die verwendet werden können, um mehrere Aspekte der antibiotika-resistenz zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von fluoreszierend markierten Antibiotika und ihre Anwendung auf die Untersuchung von Antibiotikaresistenzen bei Bakterien. Sonden können verwendet werden, um Mechanismen der bakteriellen Resistenz (z. B. Efflux) durch Spektrophotometrie, Durchflusszytometrie und Mikroskopie zu untersuchen.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Erfahren Sie die ortsspezifische Antikörpermarkierung durch genetische Einbettung azidhaltiger Aminosäuren und SPAAC-Reaktion. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinmodifikationen für die chemische Biologie.

Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

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