Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, chemische Sonden durch genetischen Einbau einer azidhaltigen Aminosäure ortsspezifisch in ein Antikörperfragment einzubringen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der chemischen Biologie zu beantworten, z. B. bei der Proteinmodifikation, dem Engineering und der Konjugation. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Ihre Zielsonde oder Bouillon durch einfaches Mischen ortsspezifisch in Proteine oder Antikörper eingebracht werden kann.

Nach dem Aufbau der Plasmide wird jeweils ein Mikroliter zu 20 Mikrolitern E.Coli Stamm DH10-beta in einer Konzentration von zweimal 10 zu den acht Zellen pro Mikroliter in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen gegeben. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung vorsichtig zu mischen. Geben Sie dann 20 Mikroliter der gemischten Lösung in eine saubere Küvette.

Stellen Sie die Elektroporationsmaschine auf 25 Mikrofarad und 2,5 Kilovolt ein. Setzen Sie dann die Küvette in den Schieber der Schockkammer ein. Schieben Sie den Objektträger in die Kammer, bis die Küvette festen Kontakt mit den Kammerelektroden hat.

Drücken Sie die Impulstaste einmal, bis das Elektroporationsgerät piept. Geben Sie danach schnell einen Milliliter SOC-Medium in die Küvette. Gib die Mischung dann in ein Reagenzglas.

Eine Stunde lang unter Schütteln bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach Abschluss der Inkubation verteilen Sie die transformierten E.Coli-Zellen auf Lysogenie-Boule-Agarplatten, die geeignete Antibiotika enthalten. Inkubieren Sie die Platten 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Nach Abschluss der Platteninkubation wird eine einzelne transformierte Kolonie in fünf Milliliter LB-Medium inokuliert, das Antibiotika enthält. Inkubieren Sie unter Schütteln für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius. Dann überführen Sie die Primärkultur in 200 Milliliter LB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und einem Millimolaren Vorhofflimmern. Inkubieren Sie unter Schütteln bei 37 Grad Celsius für mindestens drei Stunden.

Fügen Sie zwei Milliliter 1,6 molare Arabinose hinzu, wenn die Kultur eine optische Dichte von 0,8 bei 550 Nanometern erreicht. Dann unter Schütteln bei 30 Grad Celsius 12 Stunden lang inkubieren. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 11.000 g für fünf Minuten.

Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet bei minus 20 Grad Celsius ein. Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu lysieren, suspendieren Sie das Pellet in 20 Millilitern paraplasmatischem Lysepuffer in einem frischen Zentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 18.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Fügen Sie dann 400 Mikroliter einer Ni-NTA-Harzsuspension hinzu.

Bewegen Sie das Röhrchen mit einem Rotator eine Stunde lang bei vier Grad Celsius vorsichtig. Gießen Sie die Suspension nach Beendigung des Mischens in eine Polypropylensäule. Waschen Sie das Harz dreimal mit fünf Millilitern Waschpuffer.

Eluieren Sie den Zielantikörper mit 300 Mikrolitern Elutionspuffer. Bestimmen Sie danach die Konzentration des mutierten Proteins, wie im Textprotokoll beschrieben. Beginnen Sie mit der Zugabe von 10 Mikrolitern einer 10 mikromolaren Lösung von HerFab-L177AF in Phosphatpuffer, der 10 millimolare Natriumphosphat zweibasisch und 100 millimolare Natriumchlorid enthält, in ein frisches Zentrifugenröhrchen.

Fügen Sie dann 20 Mikroliter einer 200 mikromolaren Lösung von Cy 5,5 Azadibenzocyclooctyn in Wasser hinzu. Decken Sie danach das Reaktionsgefäß mit Alufolie ab. Lassen Sie die durch Färbung geförderte Cyclo-Edition-Reaktion sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius ablaufen.

Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, fügen Sie 30 Mikroliter Probe und 450 Mikroliter Phosphatpuffer hinzu, um den freien Farbstoff Cy 5,5 in einer Zentrifugalfilter-Spin-Säule zu waschen. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule bei 14.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Durchfluss und geben Sie die gereinigte Probe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Lagern Sie das gereinigte markierte HerFab bei vier Grad Celsius, es sei denn, es ist bereit für die Analyse. Beginnen Sie mit der Zugabe von 13 Mikrolitern 7,8 mikromolar gereinigtem HerFab in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie dann fünf Mikroliter LDS-Proteinprobenpuffer hinzu.

Inkubieren Sie die Mischung bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Befestigen Sie nach der Inkubation die vier bis 12%ige Bis-Tris SDS-PAGE Gelkassette an der Elektrophoresezelle. Fügen Sie einen laufenden Puffer hinzu.

Laden Sie anschließend die konjugierten Proteinproben in den vorgefärbten Molekulargewichtshersteller. Führen Sie eine Gelelektrophorese für 35 Minuten bei 200 Volt durch. Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist, übertragen Sie das Gel in ein Geldokumentations- und Analysesystem.

Scannen Sie nach Cy 5,5 und färben Sie das Gel dann mit einer handelsüblichen Proteinfärbung. In dieser Arbeit wird das Antikörperfragment Her-Fab ortsspezifisch mit einem konjugiert. Dies wird erreicht, indem eine azidhaltige Aminosäure in das Fragment eingebaut wird und dann das mutierte Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctyn reagiert wird. Die SDS-PAGE-Analyse wird für mutierte Proteine durchgeführt, die sowohl mit als auch ohne die azidhaltige Aminosäure exprimiert werden.

Wie zu sehen ist, wurde das Antikörperfragment in voller Länge nur in Gegenwart der Aminosäure erhalten. Der Antikörper, der die Aminosäure enthält, wird für die Konjugation durch Reaktion mit einem Cy 5,5-verknüpften Azadibenzocyclooctyn-Derivat Cy 5,5 evaluiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Die Fluoreszenzbilder zeigen eine Konjugation des mutierten Antikörperfragments mit Cy 5,5, während bei der Kontrolle keine Konjugation beobachtet wurde.

Sobald das Protein richtig exprimiert und mit Acetylphenylalanin gereinigt wurde, kann das Protein effizient mit einer Sonde mit dem Stamm markiert werden. Da für die Markierungsreaktion kein zusätzliches Reagenz erforderlich ist, können Sie die Sonde in Ihr Zielprotein einführen, indem Sie die Sonde einfach mit Ihrem Protein mischen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine chemische Sonde ortsspezifisch in ein Antikörperfragment einführen, indem Sie eine azidhaltige Aminosäure genetisch einbauen.