Name: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung adulter neuraler Stammzellen aus der subcallosalen Zone der Maus. Diese präzise Methode ermöglicht die Expansion in nichtadhärenten und adhärenten Kultursystemen für neurologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Brain Research Program durch die National Research Foundation (NRF), finanziert vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (Zuschüsse NRF-2015M3C7A1028790); und durch einen Zuschuss aus dem Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziert vom Ministerium für Gesundheit und Soziales, Republik Korea (HI14C3347).

1. Herstellung von Materialien und Kulturmedium <ol><li> Für die Präparation und Dissoziation des SCZ, wickeln Sie das Gehirn Matrix, zweischneidigen Rasierklinge und Zange mit Aluminiumfolie, und sie dann im Autoklaven sterilisiert werden. </li><li> Vorbereitung 50 ml kaltem PBS-Puffer das gesamte Gehirn der Maus zu waschen. </li><li> Legen Sie ein Präpariermikroskop und bereiten die chirurgischen Instrumente für die Präparation des Gehirns erforderlich (autoklaviert Schere und Pinzette) und die Isolierung des SCZ (1 ml Spritze, 30 G-Nadel, Gehirn-Matrix und einer feinen Pinzette). </li><li> Herstellung von N2 Medium: <ol><li> Bereiten F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + Natriumbicarbonat) -Medium mit 2% B27, 1% N2 Ergänzungsmittel, und 1% Penicillin-Streptomycin. Hinweis: Das Wachstumsmedium besteht aus N2-Medium und Wachstumsfaktoren (20 ng / ml gereinigten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF2)). </li></ol></li><li> Bereiten Sie einen Verdauungspuffer (40 Einheiten / ml Papain, 2,4 Einheiten / ml DISPASII e und 2% Penicillin-Streptomycin in PBS) für eine Gewebe Verdauung. </li><li> Herstellung von Beschichtungs Plate und Deckglas: <ol><li> Bereiten poly-L-Ornithin (PLO; 0,01%) und Laminin (10 ug / ml , gelöst in dH &amp; sub2 ; O). Zur Beschichtung von Platten mit 6 Vertiefungen für die Aufrechterhaltung der SCZ-aNSCs als Einschicht- oder 18 mm-Deckgläschen für die Immunfärbung, inkubieren mit PLO über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O Lassen Sie die Platten und Deckgläser nach der letzten Wäsche zu trocknen. </li><li> Als nächstes brüten die Platten mit Laminin über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O. Achtung: Die Laminin nicht trocken, was die Zellbindung beeinflussen. Anmerkung: Die Beschichtungslösungen können 3-mal wiederverwendet werden. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung und des Zerfalls des Adult SCZ <ol><li> Vor der Kultur Vorbereitung, legen Sie die Gehirn-Matrix und zweischneidiges Rasiermesser auf dem Eis. Hinweis: Das Gehirn Matrix nicht einfrieren, weil der brain könnte daran zu binden. </li><li> Opfere eine Maus (8 Wochen alt) von CO 2 Ersticken oder Genickbruch. <ol><li> Schneiden Sie den Kopf mit einer scharfen Schere nach dem Spritzen 70% Ethanol aus. Um den Kopf zu immobilisieren, halten fest an beiden Seiten des Kopfes. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere an der Mittellinie in einer Schwanz-rostralen Richtung. Dies fördert die vollständige Entfernung der Haut von dem Schädel. </li><li> Entfernen Sie den kaudalen Teil des Schädels (posterior lambda) zuerst, und dann legen Sie die Zange zwischen dem Schädel und das Gehirn an der dorsalen Mittellinie Position. Besorgen Sie sich die links (oder rechts) Scheitelbein und vorsichtig abziehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Entfernung des anderen Scheitelbein. Hinweis: Wegnahme der Sehnerv und die Entfernung der Hirnhäute aus dem Gehirn machen es leichter, das Gehirn aus dem Schädel zu lösen. </li><li> Übertragen Sie das Gehirn zu kaltem PBS-Puffer (25 ml) und spülen Sie ihn zweimal überschüssiges Blut zu entfernen. </li></ol></li><li> Legen Sie das Gehirn in das Gehirn Matrix auf Eis und make koronale Schnitte 1 mm dicke Scheiben zu erhalten. Übertragen Sie die Gehirnscheiben (1 mm), um die SCZ Regionen enthalten, die im hinteren Teil des Gehirns zu einer kalten PBS in einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff befinden. Achtung: Um eine parallele Ebene von koronalen Abschnitte zu erhalten, stellen Sie sicher, dass das Gehirn Riss in der Mittellinie des Gehirns Matrix angeordnet ist; es ist wichtig, unnötige Schwankungen in den Abschnitten zu vermeiden. Hinweis: Erhalten Gehirnscheiben bei 2-3 mm hinter Bregma; Dies ermöglicht die Trennung des SCZ vom SVZ. </li><li> Unter dem Binokular mit geringer Vergrößerung, Mikro-sezieren die SCZ aus der weißen Substanz Bereich des Cortex und Hippocampus mit einer gebogenen Nadel 30G 6,9. Dann entfernen Sie die Rinde Regionen über dem SCZ. Platzieren Sie den sezierten SCZ Region von den Scheiben in eine 35 mm Petrischale aus Kunststoff auf Eis ohne kaltem PBS. Hinweis: Die Kontamination von zusätzlichen Regionen reifen Neuronen, welche die Lebensfähigkeit von aNSCs und Neurosphere Bildung b beeinflussen könnteneil sie unterliegen in aNSZ nach folgenden Kriterien Kulturbedingungen Zelltod. </li><li> Mit einer gebogenen 30 G-Nadel, sofort hacken die sezierten Gewebe in kleine Stücke. Hinweis: Wenn eine längere Zeit zum Präparieren des SCZ Gewebe erforderlich ist, bevor Zerkleinern der sezierten Gewebe in kaltem PBS tauchen. </li><li> Re-suspendieren des zerkleinerten Gewebe mit 1 ml Verdauungspuffer, zu übertragen, das Gewebe zu einem 15 ml-Röhrchen mit 2 ml Verdauungspuffer, und inkubiere für 30 min in einem Wasserbad 37 ° C. Hinweis: Das Röhrchen wird alle 10 Minuten gut zu mischen. </li></ol> 3. subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellkultur <ol><li> Tippen Sie auf das Rohr leicht das verdaute Gewebe zu trennen, und dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Überstand verwerfen, erneut suspendiert, um die verdaute Gewebe mit 1 ml vorgewärmtes N2 Medium, um die Verdauung Puffer zu waschen und sanft die Probenlösung maximal 5 mal pipettieren eine P1000 Pipette. Hinweis: Über Verreiben mit einem schmalenPipettenspitze kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Nach Verwerfen des Überstandes, resuspendieren in 1 ml Medium N2 des Zellpellets. </li><li> Vorbereitung 1 ml N2-Medium in einer nicht-beschichteten 6-Well-Platte und 1 ml der suspendierten Zellen auf ein Endvolumen von 2 ml zu machen. </li><li> In EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) in jede Vertiefung. Schütteln Sie die 6-Well-Kulturschale mit der Hand mit den plattierten Zellen die zusätzlichen Wachstumsfaktoren zu mischen. Halten Sie die 6-Well - Platte in einem 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Hinzufügen, EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) zu jedem Well täglich für 8 Tage. Jeden dritten Tag, 200 &amp; mgr; l N2 Medien die ungefähre 2 ml Volumen des Mediums aufrechtzuerhalten. </li></ol> 4. Passagierung von NSCs als Neurosphären und Monolayer-Kulturen <ol><li> Sammeln Sie die Neurosphären und sie auf einem neuen 15 ml konischen Röhrchen. Hinweis: Die Anzahl der Neurosphären (&gt; 50 &amp; mgr; m Durchmesser) per gut von der SCZ einer einzelnen Maus Gehirn war 64,3 ± 7,31, die als die des SVZ weniger war (190,5 ± 6,33) 9. </li><li> Inkubieren der Neurosphären mit 0,5 ml Dissoziationspuffer für 5 min in einem Wasserbad 37 ° C, um die Neurosphären in einzelne Zellen dissoziiert. Primäre Neurosphären können in einzelne Zellen und gepflegt über mehrere Passagen als Neurosphere oder Monolayer-Kulturen voneinander zu trennen sind. Hinweis: Der Ausbau SCZ-aNSCs als Monoschicht auf Neurosphären überlegen ist, weil SCZ-aNSCs kann&gt; 10-mal in einer Monokultur-Format agiert werden, aber &lt;5 mal in einem Neurosphere Kultur Format. Achtung: SCZ-aNSCs zeigen eine starke Aggregation, und es ist schwierig, sie in einzelne Zellen zu distanzieren. Somit wird der Neurosphärenkultur Format nicht für Routinezellexpansion empfohlen. </li><li> Pipettieren vorsichtig die Probenlösung nach oben und unten mit einer P1000 Pipette weniger als 5-mal und Zentrifuge das Rohr bei 145 g für 5 min. Überstand verwerfen und neu sudie Neurosphären mit 1 ml Medium N2 verbringen. Hinweis: Über eine schmale Pipettenspitze Verreiben kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern. </li><li> Um die Zellen zu zählen, machen Sie eine 1: 1-Gemisch aus der Zellsuspension (10 ul) und der 0,4% Trypanblau-Lösung und dann die Anzahl der lebenden Zellen auf einer Zählkammer zählen. Nach der Beschichtung / Laminin eine 6-Well - Platte mit der PLO, die Platte , die Zellen bei 2,5 x 10 5 Zellen / ml mit 2 ml N2 - Medium für jede Vertiefung. Hinweis: Änderungen in der Zelldichte ihren Zustand und Differenzierungspotenzial beeinflussen können. </li><li> Pflegen die SCZ-aNSCs mit einer täglichen Behandlung von Wachstumsfaktoren (2 ml, 20 ng / ml) für 5 Tage, und diese Passage ihnen. </li></ol> 5. Differenzierung von subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellen <ol><li> Platte aNSCs auf eine PLO / Laminin-beschichtete 18 mm Deckglas mit 1 x 10 5 Zellen / ml in 1 ml N2 mit Wachstumsfaktoren (20 ng / ml) für die Differenzierung der SCZ-aNSCs. </li><li> Am nächsten Tag,Wenn die Zellen fest an dem Deckglas angebracht ist, das Wachstumsmedium mit N2 tauschen die Wachstumsfaktoren zu entfernen. </li><li> Nach 6 Tagen, wasche die differenzierten Zellen mit 1 ml PBS Zelltrümmer zu entfernen und sie für die Immunfärbung fixieren. Hinweis: BrdU in die neu synthetisierte DNA der proliferierenden Zellen eingebaut werden. Daher kann, falls gewünscht, BrdU (10 &amp; mgr; g / ml) zugegeben werden, um Zellen zu leben vor der Fixierung der Zellen. </li></ol> 6. Immunostaining adulten neuralen Stammzellen und Differentiated Vorläufern <ol><li> Für die Immunfärbung, waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur. Achtung: PFA ist sehr giftig; Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. </li><li> Entfernen Sie die 4% PFA, spülen Sie die fixierten Zellen mit PBS 3 mal, und dann bei 4 ° Cuntil sie für die Immunfärbung benötigt werden. </li><li> Inkubieren der Zellen auf dem Deckglas mit Blockierungslösung (3% Rinderserumalbumin und 0,1% Triton X-100 in 1 × Pmindestens 30 min bei Raumtemperatur BS) für. </li><li> Bereiten Sie die primären Antikörper in frischen Blockierungslösung und die Proben unter über Nacht bei 4 ° C. <ol><li> Immunostaining die aNSCs <ol><li> Beflecken die aNSCs mit Anti-Nestin und Anti-BrdU-Antikörper. Vor der Fixierung hinzufügen 20 ug BrdU in die aNSCs und brüten sie für 2 h. Führen der Denaturierungsschritt unter Verwendung von 2 N HCl für 20 min bei 37 ° Cbefore den Blockierungsschritt durchzuführen. </li></ol></li><li> Immunostaining die differenzierten Vorläufern: <ol><li> Verwenden anti-O4, anti-Tubulin-bIII und Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) -Antikörper die differenzierten Vorläufern zu etikettieren. </li></ol></li></ol></li><li> Waschen der Proben mit 3 mal PBS und Inkubieren sie mit sekundären Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert Antikörper (1: 500) in Blocking-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS. Hinweis: Verwenden Sie sekundäre Antikörper, die die Gastgeber des primären entsprechenAntikörper. Hoechest33343 (1: 2000) wird für die Kernfärbung verwendet. </li><li> In einem Glasobjektträger Montagelösung und fahren Sie mit Montage. Beobachten und Bild der Probe auf einem konfokalen Mikroskop bei mehreren Wellenlängen: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) und Hoechest33343 (405 nm). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieses Dokument beschreibt ein detailliertes Protokoll NSC von der adulten Maus SCZ zu erzeugen und sie für verschiedene Anwendungen zu erhalten. Es gibt drei wichtige Schritte zur Ermittlung der In - vitro - Kultursystem erforderlich zu reinigen und SCZ-NSCs erweitern. Erstens ist es wichtig, sicherzustellen , dass die SCZ Region genau von anderen potentiellen neurogener Bereiche (1B) präpariert wird. Dick und präzise Abschnitte der SCZ Regionen enthielten , wurden mit einem 1 mm Abst...

NSCs haben Merkmale der Selbsterneuerung und der Differenzierung mehrerer Abstammungslinien. Um diese Eigenschaften zu bestätigen, wurde häufig ein Neurosphären-Kultursystem verwendet. Das Neurosphären-Kultursystem wurde Anfang der 1990er Jahre entwickelt und diente als Standard-Stammzellkultursystem1. Abhängig von der Selbsterneuerungspotenz vermehren sich NSCs kontinuierlich und erzeugen in einer Suspensionskultur eine Zellmasse. Es wird davon ausgegangen, dass die Anzahl der Zellen und die Größe der Neurosphäre eng mit den Proliferationseigenschaften der NSCs verbunden sind. Monolayer-Kulturen werden auch häufig für die Erhaltung und Differenzierung von NSCs verwendet. Im Vergleich zur Neurosphärenkultur bietet das Monolayer-Kultursystem eine bessere homogene Erhaltung und Expansion von NSCs2. Diese beiden gut entwickelten Kultursysteme haben zur Charakterisierung von aNSCs in vitro beigetragen. 
NSCs befinden sich in verschiedenen Hirnregionen, wie der subventrikulären Zone (SVZ) des lateralen Ventrikels und der subgranularen Zone (SGZ) des Hippocampus3-5. Die subkallosale Zone (SCZ) der kaudalen subkortikalen weißen Substanz wird als neue neurogene Region6-8 erkannt. Kürzlich wurde berichtet, dass die SCZ-aNSCs therapeutisches Potenzial bei traumatischen Hirnverletzungen haben9. Im Vergleich zu anderen neurogenen Regionen befindet sich die SCZ entlang der subkortikalen weißen Substanz. Im menschlichen Gehirn nimmt die subkortikale weiße Substanz eine größere Region ein als im Gehirn der Maus10. Daher ist ein Verständnis der Eigenschaften von SCZ-aNSCs unter Verwendung eines in vitro Kultursystems wichtig, um den potenziellen Einsatz dieser Zellen für die neuronale Regeneration zu fördern. Eine genaue Dissektion der gewünschten Hirnregion ist erforderlich, um eine mögliche Kontamination durch unerwünschte Regionen, die aktive oder ruhende NSCs enthalten, auszuschließen. So können beispielsweise aNSCs in nicht-neurogenen Regionen aktiviert werden und neue Nervenzellen in verletzten Gehirnen oder während der In-vitro-Kultivierung produzieren11. Um NSCs aus der SCZ zu gewinnen, wurden Zellen aus Hirnschnitten entnommen, die die SCZ enthielten. Anschließend wurde eine vorsichtige Mikrodissektion der SCZ-Region mit einer feinen Nadel durchgeführt. Um die Neurosphäre aus der SCZ zu erzeugen, wurden mikropräparierte SCZ-Gewebestücke in einzelne Zellen dissoziiert und dann als Suspension in Gegenwart des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) kultiviert. Nachdem SCZ-aNSCs Neurosphären gebildet haben, können sie auch als Neurosphären oder Monoschichten zur Expansion beibehalten werden. Dieses Verfahren demonstriert auch Immunfärbeprozesse mit verschiedenen Markern für den Nachweis von NSCs und deren Nachkommen nach deren Expansion und Differenzierung in einer Monolayer-Kultur. Hier wird ein visuelles Protokoll des SCZ-aNSC-Kultursystems vorgestellt. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für die Mikrodissektion der SCZ-Region sowie für die Wartung und Passage der Zellen.

<table><tbody><tr><td><stark>Mittlere Bauteile</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>+L-Glutamin, +Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td>1x Verdünnung</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dissoziationspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feinzange</td><td>WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Storz</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>Gehirnmatrix (1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Zweischneidiger Rasierer</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>30 G Nadel</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td>Materialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schale</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Petrischale</td></tr><tr><td>100 mm Schale</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>Petrischale</td></tr><tr><td>Deckglas (18 mm)</td><td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Schale</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>nicht beschichtet</td></tr><tr><td>6-Well-Schale</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>non-coating</td></tr><tr><td>Beschichtungsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>0,01%</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td><stark>Primäre Antikörper&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>Maus (1:1.000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>Kaninchen (1:1.000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>Ziege (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>Kaninchen (1:2.000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>Ratte (1:1.000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Maus (1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Ratte (1:500)</td></tr><tr><td><stark>Sekundäre Antikörper</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-Maus cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen 488</td><td>Alexa</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen cy3</td><td>Jackson</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen 647</td><td>Jackson</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen 488</td><td>Alexa</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen cy3</td><td>Jackson</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratte 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratte cy3</td><td>Jackson</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratte 647</td><td>Jackson</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>Immunfärbematerialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>3% BSA mit 0,1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>usb</td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Life Technology</td><td>H3570</td><td>Farbstoff zum Färben von Zellkernen</td></tr></tbody></table>

isolierung und kultur von adulten neuralen stammzellen aus der maus subcallosa zone

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adulte neurale Stammzellen (aNSCs) können zur Regeneration von geschädigtem Hirngewebe verwendet werden. NSCs haben das Potenzial zur Differenzierung und Proliferation in drei Arten von Zellen: Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Identifizierung von aNSC-abgeleiteten Regionen und die Charakterisierung der aNSC-Eigenschaften sind entscheidend für den potenziellen Einsatz von aNSCs und für die Aufklärung ihrer Rolle bei der neuronalen Regeneration. In der subkallosalen Zone (SCZ), die sich zwischen der weißen Substanz und dem Hippocampus befindet, wurde kürzlich berichtet, dass sie aNSCs enthält und kontinuierlich Neuroblasten hervorbringt. Ein geringer Prozentsatz der aNSCs aus der SCZ ist in Neuronen differenziert; Die meisten Zellen werden in Gliazellen wie Oligodendrozyten und Astrozyten differenziert. Es wird vermutet, dass diese Zellen ein therapeutisches Potenzial für traumatische kortikale Verletzungen haben. Dieses Protokoll beschreibt detailliert den Prozess zur Erzeugung von SCZ-aNSCs aus einem adulten Mausgehirn. Eine Hirnmatrix mit Abständen von 1 mm wird verwendet, um die SCZ-haltigen Koronalschnitte zu erhalten und die SCZ aus dem gesamten Gehirn präzise zu präparieren. Die SCZ-Sektionen sind zunächst einer Neurosphärenkultur unterworfen. Ein gut entwickeltes Kultursystem ermöglicht die Überprüfung ihrer Eigenschaften und kann die Forschung an NSCs fördern. Ein Neurosphärenkultursystem bietet ein nützliches Werkzeug zur Bestimmung der Proliferation und zur Sammlung der echten NSCs. Eine Monolayer-Kultur ist auch ein In-vitro-System zur Untersuchung von Proliferation und Differenzierung. Bezeichnenderweise bietet dieses Kultursystem eine homogenere Umgebung für NSCs als das Neurosphären-Kultursystem. Unter Verwendung einer diskreten Hirnregion werden diese Kultursysteme daher hilfreich sein, um unser Wissen über aNSCs und ihre Anwendungen für therapeutische Zwecke zu erweitern.

Definition des Kultursystems für aNSCs aus dem unbekannten neurogene Region ist von wesentlicher Bedeutung für diese Zellen zu verstehen und für ihre mögliche Verwendung in Gehirn Reparatur 12 zu entwickeln. Es ist bekannt , dass NSC in verschiedenen Entwicklungsstadien oder in unterschiedlichen Bereichen unterschiedlich 3,4 verhalten. Vor kurzem wurde berichtet , dass SCZ-abgeleiteten Zellen Differentialpotentiale für die neuronale Differenzierung in vivo ...

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Kulturverfahrens für adulte Nervenzellen besteht darin, adulte neuronale Stammzellen aus der subkallosalen Zone zu isolieren und die Zellen in nichtadhärenten und adhärenten Kultursystemen zu vermehren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der adulten neuronalen Stammzellen zu beantworten, beispielsweise die Isolierung und Kultivierung neuronaler Stammzellen aus kleinen Hirnarealen wie der subkallosalen Zone. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Isolierung adulter neuronaler Stammzellen aus der subkallosalen Zone.Es ist einfach, aber präzise. Um dieses Verfahren zu beginnen, autoklavieren Sie die Gehirnmatrix, eine Rasierklinge mit doppelter Schneide und eine Pinzette. Bereiten Sie anschließend 50 Milliliter kalte PBS zum Waschen des Mausgehirns vor.Danach ein Stereomikroskop aufbauen und die chirurgischen Instrumente vorbereiten, die für die Gehirndissektion und die SCZ-Isolierung erforderlich sind. F-12 DMEM-Medium mit 2 % B-27 und 1 % N-2-Zusätzen sowie 1 % Penicillin-Streptomycin vorbereiten. Danach den Verdauungspuffer für die Gewebeverdauung vorbereiten.Danach 0,01 % Poly-L-Ornithin und Laminin herstellen. Anschließend sechs kleine Platten zur Kultivierung von adulten SCZ-Neuralstammzellen als Monolayer oder 18 mm große Deckgläser für die Immunfärbung beschichten. Danach mit Poly-L-Ornithin über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Anschließend waschen Sie sie dreimal mit DH2O und lassen sie nach der letzten Wäsche trocknen. Danach inkubieren Sie die Platten über Nacht bei vier Grad Celsius mit Laminin. Sobald das Gehirn entnommen ist, überführen Sie das Mausgehirn in kalte PBS-Pufferlösung und spülen es zweimal aus, um überschüssiges Blut zu entfernen.Als Nächstes wird das Gehirn auf Eis in die Gehirnmatrix gegeben und koronare Schnitte angefertigt, um Schnitte mit einer Dicke von einem Millimeter zu erhalten. Anschließend werden die hinteren Gehirnschnitte, die SCZ-Gebiete enthalten, in kalte PBS überführt. Unter einem Stereomikroskop mit niedriger Vergrößerung wird die SCZ mithilfe einer gebogenen Nadel mit 30 Gauge aus dem weißen Bereich der Großhirnrinde und des Hippocampus feingehäutet.Entfernen Sie anschließend die kortikalen Regionen oberhalb der SCZ und geben Sie die präparierte SCZ in kalte PBS-Lösung in eine 35-Millimeter-Petrischale auf Eis. Die Region der subkallosalen Zone kann mithilfe von Gehirnmaßen und einer gebogenen 30-Gauge-Nadel präzise aus dem gesamten Gewebe isoliert werden. Danach entfernen Sie die PBS-Lösung und zerkleinern das präparierte Gewebe unverzüglich in kleine Stücke.Suspendieren Sie sie mit einem Milliliter Digestionspuffer. Danach überführen Sie die Probe in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das zwei Milliliter Digestionspuffer enthält. Anschließend inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.In diesem Schritt leicht auf das Röhrchen klopfen, um das digestierte Gewebe zu lösen. Anschließend das Röhrchen bei 145 x g für fünf Minuten zentrifugieren. Nach fünf Minuten das Überstand entfernen, das digestierte Gewebe mit 1 Milliliter vorgewärmtem N-2-Medium resuspendieren, um den Verdauungspuffer auszuwaschen, und die Probenlösung vorsichtig maximal fünfmal pipettieren.Als Nächstes zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 145 × g für fünf Minuten. Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter N-2-Medium. Geben Sie ein Milliliter N-2-Medium in eine nicht beschichtete 6-Loch-Platte.Und geben Sie ein Milliliter der suspendierten Zellen hinzu, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erhalten. Als Nächstes geben Sie 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 20 Nanogramm pro Milliliter bFGF in jede Vertiefung. Schütteln Sie die 6-Loch-Kulturplatte vorsichtig von Hand, um die hinzugefügten Wachstumsfaktoren mit den angesiedelten Zellen zu vermischen.Dann die Sechs-Well-Platte in einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid umfassenden Inkubator aufbewahren. Täglich 20 Nanogramm pro Milliliter EGF und 20 Nanogramm pro Milliliter bFGF zu jedem Well hinzufügen, über einen Zeitraum von acht Tagen. Alle drei Tage 200 Mikroliter N-2-Medien hinzufügen, um etwa zwei Milliliter des Mediums aufrechtzuerhalten.Hier ist ein Bild der Neurosphären nach acht Tagen. Sammeln Sie in diesem Verfahren die Neurosphären und überführen Sie sie in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 145 × g für fünf Minuten.Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Neurosphären in 0,5 Milliliter Dissoziationspuffer. Inkubieren Sie sie für fünf Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius mit 0,5 Milliliter Dissoziationspuffer, um die Neurosphären in Einzelzellen zu dissoziieren. Primäre Neurosphären können in Einzelzellen dissoziiert und über mehrere Passagen als Neurosphärenkultur oder als Monolayerkultur erhalten werden.Pipettieren Sie die Probelösung vorsichtig weniger als fünfmal auf und ab und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 145 × g für fünf Minuten. Entsorgen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Neurosphären mit einem Milliliter N-2-Medium. Um die Zellen zu zählen, stellen Sie eine Mischung aus 10 Mikrolitern Zellsuspension und 0,4 %iger Trypanblaulösung her und zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Hämozytometer.Nach Beschichtung einer 6-Loch-Platte mit PLO/Laminin die Zellen mit 2,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in zwei Milliliter N-2-Medium pro Loch ansäen. Die SCZ adulten neuronalen Stammzellen fünf Tage lang durch tägliche Zugabe von Wachstumsfaktoren kultivieren, bevor sie weitergegeben werden. Zur Differenzierung der SCZ adulten neuronalen Stammzellen werden adulte neuronale Stammzellen auf mit PLO/Laminin beschichtete 18-Millimeter-Deckgläser mit 20 Nanogramm pro Milliliter Wachstumsfaktoren ansäen.Am nächsten Tag, wenn die Zellen fest an den Deckgläsern angeheftet sind, ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch N-2, um die Wachstumsfaktoren zu entfernen. Nach sechs Tagen waschen Sie die differenzierten Zellen mit einem Milliliter PBS, um Zelltrümmer zu entfernen, und fixieren sie für die Immunfärbung. Gezeigt sind hier repräsentative Bilder von SCZ-adulten neuronalen Stammzellen im Einschicht-Kultursystem, die die Zunahme der Anzahl von SCZ-adulten neuronalen Stammzellen nach drei Tagen in vitro veranschaulichen.Hier sind repräsentative Bilder der Proliferation von adulten neuralen Stammzellen aus der SCZ mithilfe des BrdU-Assays. Die in einem einlagigen Kultursystem gehaltenen Zellen wurden nicht mit Markern für die Typ-C-transienten amplifizierenden Zellen und Typ-A-Neuroblasten gefärbt. Um die Differenzierungsfähigkeit der adulten neuralen Stammzellen aus der SCZ zu bestätigen, wurden Wachstumsfaktoren aus dem Kulturmedium entfernt.Nach sechs Tagen wurden die Zellen mit Markern für Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten immungefärbt. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung in 1,5 Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das dissezierte Gewebe auf Eis zu lagern und das Verfahren präzise durchzuführen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Wirkungsanalysen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die Untersuchung der intrinsischen Eigenschaften von aus der subkallosalen Zone stammenden adulten neuronalen Stammzellen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet anderer neuronaler Stammzellen den Weg, um deren Regenerationspotenzial bei Hirnschäden zu erforschen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man andere neuronale Stammzellen präzise aus der subkallosalen Zone kultiviert und sie in vitro erhält.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Dieses Video-Protokoll zeigt die Neurosphäre Assay-Methode zu generieren und zu erweitern neurale Stammzellen aus dem erwachsenen Maus periventrikulären Region und erbringt technische Erkenntnisse, um sicherzustellen, kann man reproduzierbare Neurosphäre Kulturen zu erreichen.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus der subkallosalen Zone des Mäusegehirns. Dabei geht es um das Präparieren von Gewebe, die enzymatische Dissoziation und die Kultivierung mit Differenzierungsfaktoren, um sich zu reifen Nervenzellen zu entwickeln.

Isolierung und Kultivierung adulter neuraler Stammzellen aus der subkallosalen Zone der Maus

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und zur Differenzierung in Nervenzellen. Stammzellen aus der isolierten Zellsuspension werden mit Antikörper-beschichteten Magnetbeads aufgereinigt und zu Neurosphären kultiviert. Die Neurosphären werden dann in einem Differenzierungsmedium gehalten, um Nervenzellen zu erzeugen.

Isolierung von Stammzellen aus dem postnatalen Kleinhirn der Maus und Differenzierung in Nervenzellen

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Wir berichten über eine auf Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) basierende Methode, um neurale Stammzellen (NSCs) und ihre Nachkommen aus der subventrikulären Zone (SVZ) des adulten Mäusegehirns zu isolieren. Angewendet auf FUCCI-transgene Mäuse (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) ermöglicht es die Untersuchung des Zellzyklusverlaufs durch Live-Bildgebung.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Hier beschreiben wir ein Nukleofektionssystem, das die Effizienz der Genübertragung in expandierten neuralen Stammzellen (NSCs) verbessern soll, die aus der adulten subventrikulären Zone von Mäusen isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die Genstörung in NSCs signifikant verbessert, die Wirksamkeit traditioneller Transfektionsprotokolle übertrifft und die Überlebensrate der Zellen erhöht.

Isolierung, Expansion und Nukleofektion von neuralen Stammzellen aus der adulten subventrikulären Zone der Maus

Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung adulter neuraler Stammzellen aus der subcallosalen Zone der Maus. Diese präzise Methode ermöglicht die Expansion in nichtadhärenten und adhärenten Kultursystemen für neurologische Forschung.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

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