Name: Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Erfahren Sie die chondrogene Differenzierung von fettgewebsgewonnenen Stammzellen durch Zentrifugalkraft. Diese zytokinfreie Methode aktiviert SOX9 und fördert die Knorpelregeneration effizient.

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Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, finanziert vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (Fördernummer: HI14C2116) und vom Forschungsfonds des Seoul St. Mary's Hospital, der Katholischen Universität von Korea.

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Katholischen Universität von Korea (KC16EAME0162) und führte nach NIH-Richtlinien zugelassen. Alle Gewebe wurden mit schriftliche Einverständniserklärung erhalten. 1. Kreisel Gravity Laden und Pelletkultur <ol><li> Zellkultur und Ernte <ol><li> Kultur ASCS (P2-P3, siehe Materialliste) in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium-Low Glucose (DMEM-LG), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, entsorgen Sie das Medium und die Zellen werden mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> 1 ml PBS , enthaltend 1 mM EDTA und Inkubation für 2 min bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Tippen Sie auf die Kulturplatte sanft, 4 ml frisches Medium, übertragen die Zellenin 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 2 min bei Raumtemperatur (RT). </li></ol></li><li> Kreisel Schwere Belastung <ol><li> Nach der Zentrifugation (Schritt 1.1.4), entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören und das Pellet in 10 ml DMEM-LG mit 10% FBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Für CG Beladung übertragen 2,5 × 10 5 Zellen in ein neues 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 2.400 × g für 15 min. </li></ol></li><li> Pelletkultur <ol><li> Unmittelbar nach der Zentrifugation der Überstand absaugen und füge 500 ul definiert chondrogenen Differenzierungsmedium (CDM, High-glucose DMEM mit 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM Dexamethason, 1x MEM nicht-essentielle Aminosäurelösung, 50 ug / ml L-Prolin und 1% Penicillin / Streptomycin). In 50 ug / ml frisch zubereitet L-Ascorbinsäure-2-phosphat bei jedem Mediumwechsel. Als positive Kontrolle, veran chondrogene differentiatiauf in nicht-zentrifugierten Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 ng / ml TGF-β1. </li><li> Platzieren Sie die lose verschlossen Rohre , die Pellets in einer stehenden Position enthält , und Inkubieren bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag für 3 Wochen. </li></ol></li><li> Micro Kultur <ol><li> Unmittelbar nach dem Zentrifugieren (Schritt 1.2.2; 2.400 × g für 15 min), der Überstand absaugen und das Pellet in 10 ul CDM resuspendieren. </li><li> Um einen Mikromasse bilden, legen Sie die resuspendierten Zellen in der Mitte eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> Nach 2 h fügt vorsichtig 1 ml CDM zum Brunnen, Pipettieren gegen die Wand der Platte Störung der Mikromasse zu vermeiden. eine Mikromassenkultur mit nicht-zentrifugierten Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 ng / ml TGF-β1 als Positivkontrolle, durchzuführen. </li><li> Inkubieren des Mikromasse bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie das Medium evEry anderen Tag für 3 Wochen. </li></ol></li></ol> 2. Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Transcriptional Upregulation von chondrogenen Differenzierungsmarker zu erkennen <ol><li> Am Tag 14 eine Pipette verwenden, um die Sphäroid-Pellets in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und waschen Sie sie in 1x PBS zu übertragen. </li><li> Extrahieren Sie die Gesamt - RNA aus den Pellets unter Verwendung des Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren 9. </li><li> Synthetisieren von cDNA aus 2 ug Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemß dem Protokoll des Herstellers (inkubieren bei 42 ° C für 1 h und dann Inaktivieren des Enzyms bei 70 ° C für 5 min). </li><li> Führen PCR mit Primern , die spezifisch für chondrogenen Differenzierungsmarker 10. </li></ol> 3. Die Färbung zu erkennen, die Überexpression von chondrogene Differenzierung Markerproteinen <ol><li> Paraffin-Einbettung Zellpellets <ol><li> Am Tag 21Verwenden einer Pipette die Sphäroid-Pellets und waschen Sie sie mit 1x PBS zu ernten. </li><li> Befestigen Sie die Sphäroid-Pellets durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd für 24 h. Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen, Haut oder Schleimhäute. Minimieren Sie Belichtung und vermeiden Einatmen während der Vorbereitung. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. </li><li> Entsorgen Sie die Fixiermittel und spülen Sie die Zellpellets mit VE-Wasser (DW). </li><li> Legen Sie eine Schicht aus Gaze auf die Kassette und übertragen Sie die feste Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet durch die Gaze Falten und schließen Sie den Kassettendeckel. </li><li> Entwässern der Pellets. <ol><li> Eintauchen der Pellets in 70% Ethanol (EtOH) 5 min bei RT. </li><li> Eintauchen der Pellets in 80% EtOH für 5 min bei RT. </li><li> Eintauchen der Pellets in 95% EtOH für 5 min bei RT. </li><li> Eintauchen der Pellets in 100% EtOH für 5 min bei RT. Zweimal wiederholen. </li><li> Eintauchen der Pellets in 100% Xylol 15 min bei RT. Wiederholen Sie twice. </li></ol></li><li> Einbetten der festen Zellpellets in Paraffin bei 56 ° C in einer Form; Die Pellets können in Paraffin mit speziellen automatisierten Gewebeverarbeitungssysteme eingebettet werden. </li><li> Schneiden Sie 5 um dicke Abschnitte aus dem Paraffin eingebetteten Zellpellet ein Rotationsmikrotom mit. </li><li> Schwimmer die Abschnitte in 50% EtOH und übertragen sie dann auf ein 50 ° C Wasserbad eine Folie verwendet wird. </li><li> Legen Sie die schwimmenden Abschnitte auf Objektträger. </li></ol></li><li> Safranin O und Alcianblaufärbung <ol><li> Rehydrieren die Paraffinschnitten. <ol><li> Tauchen Sie die Folien in Xylol für 15 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Tauchen Sie die Folien in 100% EtOH für 5 min. Zweimal wiederholen. </li><li> Tauchen Sie die Folien in 90% EtOH für 5 min. </li><li> Tauchen Sie die Folien in 80% EtOH für 5 min. </li><li> Tauchen Sie die Folien in 70% EtOH für 5 Minuten und dann waschen Sie sie in 1x PBS. </li></ol></li><li> Stain die rehydratisierten Abschnitte mit 1% Safranin O-Lösung und 3% Alcianblau für30 Minuten. </li><li> Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Abschnitte mit DW. </li><li> Beflecken die Abschnitte mit Hematoxylin / Eosin-Lösung (Gegenfärbemittel) für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Abschnitte mit DW. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas nach Restwasser zu entfernen. Legen Sie das Dia (Zellenseite nach unten) auf dem Deckglas des Montage Medium enthält. </li><li> Ermöglichen die Objektträger für 2-3 h bei RT trocknen. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem Hellfeld-Mikroskop (Automatisiertes aufrechten Mikroskop, 50X und 200X). </li></ol></li><li> Immunfluoreszenztest <ol><li> Rehydrieren die Abschnitte, wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben. </li><li> Eintauchen der Objektträger in Natriumcitrat-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), und dann halten sie an einem Unter Siedetemperatur für 10 min unter Verwendung einer Mikrowelle. </li><li> Kühlen Sie die Folien für 20 min bei RT und dann waschen Sie sie mit Leitungswasser. </li><li> Inkubieren Sie die Dias in 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) für 15 Minuten und dann waschen Sie sie mit Leitungswasser für 15 min 11. </li><li> Blockieren die Objektträger mit Blockierungspuffer (10% normales Ziegenserum in PBS) für 1 h. </li><li> Saugen Sie das Blockierungslösung, und dann gelten die Folien eine primäre Antikörper verdünnt mit 5% normalem Ziegenserum auf. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Inkubieren der Objektträger in Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörpers mit 5% normalem Ziegenserum verdünnt, für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten im Dunkeln. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger mit DAPI (1 ug / ml) für 10 Minuten und dann waschen Sie sie zweimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas nach Restwasser zu entfernen. Legen Sie das Dia (Zellenseite nach unten) auf dem Montagemedium. </li><li> Lassen Sie die Folien für 2-3 trocknenh im Dunkeln bei RT. </li><li> Visualisieren Sie die Folien mit der Fluoreszenzmikroskopie (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X und 200 - facher Vergrößerung) 12. </li></ol></li></ol>

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<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
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</ol>

Wir erklären, dass wir keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit haben.

Die stemness Zustand von Zellen ist sehr wichtig für CG-induzierten Überexpression von SOX9. In unserer Studie konnte SOX9 Expression von CG in frühen Passage ASCs (2-3), aber nicht in späteren Durchgang ASCs induziert werden. Es wurde berichtet , dass während der Kultivierung ASCs 16 CD34 + -Zellen bis 3 Passagen enthalten. ASCS neigen dazu, die Expression von CD34 zu verlieren, wie die Zellen passagiert werden, in einer geringen Reaktion auf CG führt. Mit zentrifuga...

Defekte im Gelenkknorpel nicht heilen natürlich. Folglich Stammzelltransplantation hat sich als vielversprechender Ansatz für die Reparatur von Knorpel beeinträchtigt vorgeschlagen worden. Jedoch erfordert dieses Verfahren sowohl die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Stammzellen und die Induktion dieser Zellen chondrogene Differenzierung zu unterziehen. Knochenmark (BM) wurde als Quelle für Stammzellen weit verbreitet, aber Zellisolation aus BM hat zwei wesentliche Nachteile: Invasivität und ungenügender Ausbeute. Aufgrund seiner Leichtigkeit des Erwerbs, Fettgewebe ist eine bevorzugte Quelle für Stammzellen. Frühere Studien zeigten die Machbarkeit Stammzellen aus Fettgewebe zur Isolierung und chondrogene Differenzierung in diesen Zellen Zytokine, wie TGF-β1 1 unter Verwendung von 2 zu induzieren. Diese Verfahren sind wirksam, aber teuer. Als preiswertere Alternative zu Cytokine können mechanische Belastungen verwendet werden,induzieren die chondrogene Differenzierung. Mechanische Belastung spielt eine kritische Rolle bei der Gesundheit von Gelenkknorpel Aufrechterhaltung 3, und es kann chondrogenen Phänotyp in verschiedenen Zellen induzieren. Beispielsweise induziert hydrostatischem Druck chondrogenen Phänotyp in Synovium abgeleiteten Vorläuferzellen über die MAP kinase / JNK - Weg 4 und mechanische Kompression induziert die Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen (MSCs) durch chondrozytische Gene 5 upregulating. Zusätzlich trägt Scherspannung auf die Expression von Chondrogenese bezogenen extrazellulären Matrix (ECM) in humanen MSCs 6. Kreiselschwerkraft (CG), ein leicht angewendet und kontrolliert mechanischer Beanspruchung durch Zentrifugation erzeugt, kann Differential Gen induzieren Expression in Zellen 7. Beispielsweise in Karzinomzellen Lungenepithelzellen, wird die Expression von Interleukin (IL) -1b durch Zentrifugation 8 nach oben reguliert. Therefore als experimentell induzierbaren mechanische Beanspruchung kann CG verwendet werden chondrozytische Genexpression in Stammzellen zu induzieren. Es bleibt jedoch unklar, ob CG die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren können. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass CG die Hochregulation von SOX9, einen Master-Regulator der Chondrogenese, in der menschlichen ASCS induziert, was zu einer Überexpression von chondrozytische Gene. Zusätzlich verglichen wir die Wirkungen von CG auf Chondrogenese mit denen von TGF-β1, die meisten der Wachstumsfaktor im Allgemeinen in vitro - Chondrogenese in Stammzellen zu induzieren , verwendet.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</strong</td></tr><tr><td>>100 mm Schale</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Schale</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Einwegpipette</td><td>Falcon</td><td>7543<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">ASC Nährmedienmaterialien</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Low Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11885-084</td><td>Wachstumsbasismedien</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Chondrogenes Differenzierungsmedium Materialien</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td>chondrogene Differenzierungsbasismedien</td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Penicilin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1%</td></tr><tr><td>Ascorbat-2-phosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607 50</td><td>&#956; g/mL</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td></td><td>354352 1%</td></tr><tr><td>Humane TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>18 mm Deckglas</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kollagen II Antikörper</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 Konjugat</td><td>Molekulare Sonde</td><td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molekulare Sonde</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerglas, beschichtet</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalkohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Erststrang-cDNA-Synthesekit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA-Polymerase</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>loading star</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA-Leitermarker</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Humane Fettstammzellen (ASCs)</td><td>Katholische MASTER-Zellen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chondrogene differenzierung induktion von fettgewebe gewonnene stammzellen durch zentrifugalkraft gravity

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Beeinträchtigter Knorpel kann nicht auf natürliche Weise heilen. Die derzeit fortschrittlichste Therapie für Knorpeldefekte ist die Transplantation von Chondrozyten, die mit Hilfe von Zytokinen aus Stammzellen differenziert werden. Leider ist die zytokininduzierte chondrogene Differenzierung kostspielig, zeitaufwändig und mit einem hohen Kontaminationsrisiko während der in vitro Differenzierung verbunden. Biomechanische Reize dienen aber auch als entscheidende Regulationsfaktoren für die Chondrogenese. Zum Beispiel kann mechanischer Stress die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren, was auf einen möglichen therapeutischen Ansatz zur Reparatur von beeinträchtigtem Knorpel hindeutet. In dieser Studie konnten wir zeigen, dass die Zentrifugalgravitation (CG, 2.400 × g), eine mechanische Belastung, die durch Zentrifugation leicht ausgeübt werden kann, die Hochregulierung der geschlechtsbestimmenden Region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASCs) induziert, was dazu führt, dass sie chondrogene Phänotypen exprimieren. Die zentrifugierten ASCs exprimierten höhere Konzentrationen von chondrogenen Differenzierungsmarkern wie Aggrecan (ACAN), Kollagen Typ 2 alpha 1 (COL2A1) und Kollagen Typ 1 (COL1), aber niedrigere Spiegel von Kollagen Typ 10 (COL10), einem Marker für hypertrophe Chondrozyten. Darüber hinaus wurde die chondrogene Aggregatbildung, eine Voraussetzung für die Chondrogenese, in zentrifugierten ASCs beobachtet.

Kreiselschwerkraft induziert die Überexpression von chondrogenen Differenzierungsmarker in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. Um das Ausmaß der Zentrifugal-Schwerkraft bestimmen, die geeignet ist die chondrogene Differenzierung zu induzieren, ASCs wurden mit unterschiedlichen Graden der CG stimuliert (0, 300, 600, 1.200 und 2.400 xg) für 15 min. Nach der Stimulation wurden die ASCs erneut ausgesät auf Kulturplatten und kultivi...

Mechanischer Stress kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren und bietet damit einen potentiellen therapeutischen Ansatz für die Reparatur von gestörtem Knorpel. Wir stellen ein Protokoll vor, um die chondrogene Differenzierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ASCs) mit Hilfe der Zentrifugalgravitation (CG) zu induzieren. Die CG-induzierte Hochregulierung von SOX9 führt zur Entwicklung chondrogener Phänotypen.

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine chondrogene Differenzierung von ASCs für eine defekte Knorpelreparatur zu induzieren. Mit dieser Methode soll die prächondrogene Differenzierung von ASCs mit Hilfe der Zentrifugalgravitation induziert werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die chondrogene Differenzierung von ASCs geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z.B. die osteogene und fibrogene Differenzierung.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die chondrogene Differenzierung aus Stammzellen leicht induziert werden kann, ohne dass Zytokine behandelt werden müssen. Das Verfahren wird von Yeri Alice Rim und Yoojun Nam aus meinem Labor vorgeführt. Beginnen Sie mit der Entnahme von 80 % konfluenten Stammzellen aus Fett aus einer 100-Milliliter-Kulturschale, indem Sie das Medium verwerfen und mit fünf Millilitern PBS waschen.Fügen Sie dann einen Milliliter PBS mit einem millimolaren EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Klopfen Sie nach zwei Minuten vorsichtig auf die Kulturplatte, fügen Sie vier Milliliter frisches Medium hinzu und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen werden bei 250 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 10 Millilitern Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Für die Zentrifugalgravitation wird das 2,5-fache Zehnfache in die fünften Zellen in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 2400 g zentrifugiert. Fahren Sie nach der Zentrifugation entweder mit einer Pellet- oder Mikromassenkultur fort. Unmittelbar nach der Zentrifugation wird der Überstand und bei 500 Mikrolitern chondrogenem Differenzierungsmedium (CDM) und 50 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetem L-Ascorbinsäure-2-phosphat in das Pellet aspiriert.Eine Positivkontrolle, induziert die chondrogene Differenzierung und sammelt ihre Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 enthält. Verschließen Sie die Röhrchen locker und inkubieren Sie sie drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Unmittelbar nach der Schwerkraftzentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in 10 Mikrolitern CDM wieder suspendiert.Um eine Mikromasse zu bilden, pipettieren Sie die resuspendierten Zellen in die Mitte einer Vertiefung einer 24-Well-Platte und legen Sie die Platte dann in den Inkubator. Geben Sie nach zwei Stunden vorsichtig 500 Mikroliter CDM in die Vertiefung und pipetieren Sie gegen die Wand der Platte, um eine Störung der Mikromasse zu vermeiden. Als Positivkontrolle wird eine Mikromassenkultur mit nicht zentrifugierten Zellen durchgeführt, indem CDM mit 10 Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 hinzugefügt wird.Inkubieren Sie die Mikromasse drei Wochen lang. Verwenden Sie am 21. Tag nach der Bildung der Mikromasse eine Pipette, um die Sphäroidpellets zu ernten, und waschen Sie sie dann mit 1X PBS. Fixieren Sie die Sphäroidpellets, indem Sie sie 24 Stunden lang in 4%iges Paraformaldehyd eintauchen.Entsorgen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel und spülen Sie die Zellpellets mit entionisiertem Wasser ab. Legen Sie eine Schicht Gaze auf die Gewebekassette und übertragen Sie die fixierten Sphäroid-Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet ab, indem Sie die Gaze falten und den Kassettendeckel schließen.Als nächstes dehydrieren Sie die Sphäroidpellets, indem Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%iges Ethanol eintauchen. Fahren Sie dann mit einer Reihe von Ethanolkonzentrationen für jeweils fünf Minuten fort. Tauchen Sie die Pellets dann 15 Minuten lang in 100%iges Xylol.Tauchen Sie die Sphäroidpellets zum Einbetten in 56 Grad Celsius warmes Paraffin. Schneiden Sie anschließend mit einem Rotationsmikrotom fünf Mikrometer dicke Abschnitte aus dem in Paraffin eingebetteten Zellpellet ab. Schwimmen Sie die Abschnitte in 50%igem Ethanol und geben Sie sie dann in ein 50 Grad Celsius heißes Wasserbad.Montieren Sie die schwimmenden Abschnitte auf Objektträger und fahren Sie dann mit Safranin O und Alcian Blue für die Immunfluoreszenzfärbung fort. Um eine geeignete Zentrifugalgravitationskraft zu bestimmen, wurden ASCs bei einer Zentrifugalgravitation von null, 300, 600, 1, 200 und 2.400 g für fünfzehn Minuten gedreht. Die SOX9-mRNA-Expression wurde 24 Stunden nach der CG-Stimulation untersucht.Ein CG von 2.400 mal g induzierte signifikant die SOX9-mRNA-Expression. Um die Expression von Chondrogenese-bezogenen Genen zu bewerten, wurde die Gesamt-RNA aus unstimulierten ASCs extrahiert, die zentrifugiert oder mit TGF-beta-on behandelt worden waren. Wie hier zu sehen ist, induziert die CG-Stimulation die Kollagen-Typ-2- und Aggrecan-Expression.Die Überexpression von Kollagen Typ-2 in ASC's, die mit CG behandelt wurden, wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Antikörpers gegen Kollagen Typ-2 in einem Alexa Fluor 594 konjugierten Sekundärantikörper bestätigt. Um die Wirkung von CG auf die Chondrogenese-bedingte EZM-Überexpression zu bestimmen, wurden ASCs mit TGF-beta-on als Positivkontrolle behandelt. Bei der Negativkontrolle handelte es sich um eine Pelletkultur, die keiner CG-Beladung oder TGF-beta-on-Behandlung unterzogen wurde.Die Überexpression der Chondrogenese-bedingten EZM wurde in Sphäroidpellets, die aus zentrifugierten ASC's bestehen, unter Verwendung von Safranin o und Alcianblau-Färbung untersucht. Glykosaminoglykan, ein Hauptbestandteil des Gelenkknorpels, wurde durch Alcianblau blau oder durch Safranin o orange gefärbt. Nach 14-tägiger Mikromassenkultur wurde die Chondrozytenkondensation anhand der Größe der Aggregate bewertet.Die Größe jedes Aggregats, das durch CG erzeugt wurde, betrug etwa 0,5 Millimeter. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die chondogene Differenzierung von Stammzellen mithilfe der Zentrifugalgravitation induziert wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von aus Schweinefettgewebe gewonnenen Stammzellen (pADSC) aus subkutanem Fettgewebe mit Untersuchung der Multipotenz. Die multipotenten pADSC werden verwendet, um Prozesse der Adipozytendifferenzierung abzugrenzen und die Transdifferenzierung in mehrere Zelllinien des mesodermalen Mesenchyms oder weitere Linien des Ektoderms und des Endoderms für regenerative Studien zu untersuchen.

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.

Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier schlagen wir ein Protokoll für die chondrogene Differenzierung von Nervenblut mononuklearen Zell-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen vor.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Eine Methode, um Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale Arginin Glycin Asparagin (RGD) Oberfläche Säuredichte ermöglichen ist beschrieben und für das Studium der Zelldifferenzierung Adhäsion und Chondrogenic angewendet.

Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns, lokal Steuerfläche Haftfähigkeit: eine Methode, um direkte Chondrogenic Differenzierung

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Fähigkeit der Vorläuferzellen aus menschlichen perivaskuläre Fettgewebe abgeleitet, in mehrere Linien der Zelle differenzieren zu testen. Differenzierung war im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen Knochenmark, die bekanntlich in Adipocyte, Osteocyte und Knorpelzelltransplantation Abstammungen zu differenzieren.

Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von neuronalen Kamm abgeleiteten Adipose-abgeleiteten Stammzellen (NCADSCs) aus dem periaortischen Fettgewebe von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse. Die NCADSCs können eine leicht zugängliche Quelle von ADSCs zur Modellierung von Adipogenese oder Lipogenese in vitro sein.

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Das Fettgewebe ist eine ausgezeichnete Quelle für mesenchymale Stammzellen. Hier bringen wir die Schritt-für-Schritt-Extraktion, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe von Schweizer Mäusen an.

Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Erfahren Sie die chondrogene Differenzierung von fettgewebsgewonnenen Stammzellen durch Zentrifugalkraft. Diese zytokinfreie Methode aktiviert SOX9 und fördert die Knorpelregeneration effizient.

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

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