Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity
24. Februar 2017
Mechanischer Stress kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren und bietet damit einen potentiellen therapeutischen Ansatz für die Reparatur von gestörtem Knorpel. Wir stellen ein Protokoll vor, um die chondrogene Differenzierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ASCs) mit Hilfe der Zentrifugalgravitation (CG) zu induzieren. Die CG-induzierte Hochregulierung von SOX9 führt zur Entwicklung chondrogener Phänotypen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine chondrogene Differenzierung von ASCs für eine defekte Knorpelreparatur zu induzieren. Mit dieser Methode soll die prächondrogene Differenzierung von ASCs mit Hilfe der Zentrifugalgravitation induziert werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die chondrogene Differenzierung von ASCs geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z.B. die osteogene und fibrogene Differenzierung.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die chondrogene Differenzierung aus Stammzellen leicht induziert werden kann, ohne dass Zytokine behandelt werden müssen. Das Verfahren wird von Yeri Alice Rim und Yoojun Nam aus meinem Labor vorgeführt. Beginnen Sie mit der Entnahme von 80 % konfluenten Stammzellen aus Fett aus einer 100-Milliliter-Kulturschale, indem Sie das Medium verwerfen und mit fünf Millilitern PBS waschen.
Fügen Sie dann einen Milliliter PBS mit einem millimolaren EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Klopfen Sie nach zwei Minuten vorsichtig auf die Kulturplatte, fügen Sie vier Milliliter frisches Medium hinzu und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen werden bei 250 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 10 Millilitern Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Für die Zentrifugalgravitation wird das 2,5-fache Zehnfache in die fünften Zellen in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 2400 g zentrifugiert. Fahren Sie nach der Zentrifugation entweder mit einer Pellet- oder Mikromassenkultur fort. Unmittelbar nach der Zentrifugation wird der Überstand und bei 500 Mikrolitern chondrogenem Differenzierungsmedium (CDM) und 50 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetem L-Ascorbinsäure-2-phosphat in das Pellet aspiriert.
Eine Positivkontrolle, induziert die chondrogene Differenzierung und sammelt ihre Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 enthält. Verschließen Sie die Röhrchen locker und inkubieren Sie sie drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Unmittelbar nach der Schwerkraftzentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in 10 Mikrolitern CDM wieder suspendiert.
Um eine Mikromasse zu bilden, pipettieren Sie die resuspendierten Zellen in die Mitte einer Vertiefung einer 24-Well-Platte und legen Sie die Platte dann in den Inkubator. Geben Sie nach zwei Stunden vorsichtig 500 Mikroliter CDM in die Vertiefung und pipetieren Sie gegen die Wand der Platte, um eine Störung der Mikromasse zu vermeiden. Als Positivkontrolle wird eine Mikromassenkultur mit nicht zentrifugierten Zellen durchgeführt, indem CDM mit 10 Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 hinzugefügt wird.
Inkubieren Sie die Mikromasse drei Wochen lang. Verwenden Sie am 21. Tag nach der Bildung der Mikromasse eine Pipette, um die Sphäroidpellets zu ernten, und waschen Sie sie dann mit 1X PBS. Fixieren Sie die Sphäroidpellets, indem Sie sie 24 Stunden lang in 4%iges Paraformaldehyd eintauchen.
Entsorgen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel und spülen Sie die Zellpellets mit entionisiertem Wasser ab. Legen Sie eine Schicht Gaze auf die Gewebekassette und übertragen Sie die fixierten Sphäroid-Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet ab, indem Sie die Gaze falten und den Kassettendeckel schließen.
Als nächstes dehydrieren Sie die Sphäroidpellets, indem Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%iges Ethanol eintauchen. Fahren Sie dann mit einer Reihe von Ethanolkonzentrationen für jeweils fünf Minuten fort. Tauchen Sie die Pellets dann 15 Minuten lang in 100%iges Xylol.
Tauchen Sie die Sphäroidpellets zum Einbetten in 56 Grad Celsius warmes Paraffin. Schneiden Sie anschließend mit einem Rotationsmikrotom fünf Mikrometer dicke Abschnitte aus dem in Paraffin eingebetteten Zellpellet ab. Schwimmen Sie die Abschnitte in 50%igem Ethanol und geben Sie sie dann in ein 50 Grad Celsius heißes Wasserbad.
Montieren Sie die schwimmenden Abschnitte auf Objektträger und fahren Sie dann mit Safranin O und Alcian Blue für die Immunfluoreszenzfärbung fort. Um eine geeignete Zentrifugalgravitationskraft zu bestimmen, wurden ASCs bei einer Zentrifugalgravitation von null, 300, 600, 1, 200 und 2.400 g für fünfzehn Minuten gedreht. Die SOX9-mRNA-Expression wurde 24 Stunden nach der CG-Stimulation untersucht.
Ein CG von 2.400 mal g induzierte signifikant die SOX9-mRNA-Expression. Um die Expression von Chondrogenese-bezogenen Genen zu bewerten, wurde die Gesamt-RNA aus unstimulierten ASCs extrahiert, die zentrifugiert oder mit TGF-beta-on behandelt worden waren. Wie hier zu sehen ist, induziert die CG-Stimulation die Kollagen-Typ-2- und Aggrecan-Expression.
Die Überexpression von Kollagen Typ-2 in ASC's, die mit CG behandelt wurden, wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Antikörpers gegen Kollagen Typ-2 in einem Alexa Fluor 594 konjugierten Sekundärantikörper bestätigt. Um die Wirkung von CG auf die Chondrogenese-bedingte EZM-Überexpression zu bestimmen, wurden ASCs mit TGF-beta-on als Positivkontrolle behandelt. Bei der Negativkontrolle handelte es sich um eine Pelletkultur, die keiner CG-Beladung oder TGF-beta-on-Behandlung unterzogen wurde.
Die Überexpression der Chondrogenese-bedingten EZM wurde in Sphäroidpellets, die aus zentrifugierten ASC's bestehen, unter Verwendung von Safranin o und Alcianblau-Färbung untersucht. Glykosaminoglykan, ein Hauptbestandteil des Gelenkknorpels, wurde durch Alcianblau blau oder durch Safranin o orange gefärbt. Nach 14-tägiger Mikromassenkultur wurde die Chondrozytenkondensation anhand der Größe der Aggregate bewertet.
Die Größe jedes Aggregats, das durch CG erzeugt wurde, betrug etwa 0,5 Millimeter. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die chondogene Differenzierung von Stammzellen mithilfe der Zentrifugalgravitation induziert wird.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Induktion der chondrogenen Differenzierung von fettgewebsabgeleiteten Stammzellen (ASCs) unter Verwendung von Zentrifugalkraft (CG). Die Methode zeigt das Potenzial mechanischer Belastung bei der Knorpelreparatur durch die Förderung der Aufregulierung von SOX9, was zur Entwicklung chondrogener Phänotypen führt.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Stammzellenbiologie
- Knorpelreparatur
- Effekte mechanischer Belastung
Hintergrund
- Chondroge Differenzierung ist entscheidend für die Knorpelreparatur.
- Fettgewebsabgeleitete Stammzellen (ASCs) sind eine vielversprechende Quelle für regenerative Therapien.
- Mechanische Kräfte können die Stammzellendifferenzierung beeinflussen.
- SOX9 ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor in der Chondrogenese.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Induktion der chondrogenen Differenzierung von ASCs zu entwickeln.
- Die Auswirkungen der Zentrifugalkraft auf die Stammzellendifferenzierung zu untersuchen.
- Einen zytokinfreien Ansatz für die Knorpelreparatur bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Ernte von ASCs aus Kulturschalen.
- Anwendung von Zentrifugalkraft zur Induktion der Differenzierung.
- Bewertung der Expression chondrogener Marker.
- Demonstration des Verfahrens durch Laborpersonal.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion der chondrogenen Differenzierung in ASCs.
- Aufregulierung von SOX9 nach der Behandlung beobachtet.
- Entwicklung chondrogener Phänotypen bestätigt.
- Mögliche Anwendungen in anderen Differenzierungswegen festgestellt.
Schlussfolgerungen
- Zentrifugalkraft ist eine effektive Methode zur Induktion der chondrogenen Differenzierung.
- Diese Technik könnte Knorpelreparaturstrategien verbessern.
- Weitere Forschung könnte deren Anwendung auf andere Stammzellendifferenzierungsprozesse ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Mechanical induction of chondrogenic differentiation offers a cytokine-free alternative for cartilage repair, reducing contamination risks and process complexity in stem cell-based therapies. This approach supports target validation by enabling functional assessment of chondrogenic potential in adipose-derived stem cells under defined biomechanical conditions. The method provides a scalable, reproducible system for early-stage de-risking of cartilage regeneration strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of SOX9 upregulation as a mechanistic readout for chondrogenic commitment in stem cells.
- Operational Value: Provides a cytokine-free induction system that minimizes variability and contamination risk in differentiation assays.
- Predictive Value: Supports assessment of chondrogenic phenotype through marker expression (ACAN, COL2A1) and aggregate formation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized chondrogenic aggregates suitable for downstream ECM and histological analysis.
- Quantitative Output: Enables measurement of glycosaminoglycan deposition via safranin O and alcian blue staining.
- Scalability: Uses conventional centrifugation equipment, facilitating integration into existing laboratory workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early chondrogenic events critical for articular cartilage repair strategies.
- Mechanistic De-risking: Avoids hypertrophic differentiation markers (COL10), supporting evaluation of stable chondrocyte phenotypes.
- Translational Continuity: Bridges in vitro differentiation with preclinical evaluation through spheroid pellet formation and histological validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical modeling by providing a biomechanical induction system for chondrogenesis.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that mechanical stress can substitute for biochemical inducers in stem cell differentiation.
- Screening: Produces reproducible micromass cultures for compound or condition testing in chondrogenesis.
- Analytics: Delivers quantifiable readouts including SOX9, ACAN, COL2A1 expression and histological staining intensity.
- Translational Research: Supports progression to preclinical models by generating stable chondrogenic pellets without hypertrophic markers.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other differentiation lineages (osteogenic, fibrogenic) using the same centrifugal gravity platform.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating mechanical stress as a differentiation inducer.
- Operational Value: Eliminates cytokine dependency, simplifying reagent logistics and reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of chondrogenic potential in stem cell sources.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cartilage repair candidates through predictive phenotypic screening.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and histological processing.
- Depends on access to calibrated centrifuges capable of 2,400 × g.
- Necessitates standardization of cell seeding density and centrifugation timing across laboratories.
- Requires adaptation of chondrogenic medium formulation when applying to different stem cell sources.
- Limited to in vitro models; does not replace in vivo validation of cartilage integration or function.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Centrifugal Gravity Loading
2:22
Pellet Culture
3:12
Micromass Culture
4:10
Paraffin-embedding Cell Pellets
5:59
Results: Upregulation of Chondrogenic Differentiation Markers in Adipose-derived Stem Cells Following Centrifugal Gravity Loading
7:59
Conclusion
