Name: Metagenomanalyse von Silage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Analyse bakterieller Gemeinschaften in Silage mittels Shotgun-Metagenomik. Diese Methode ermöglicht präzise taxonomische Klassifizierung und funktionelle Annotation für die Futterqualitätssicherung.

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Die Autoren danken Andrew Bird für die Silageproben und Audrey Farbos vom Exeter Sequencing Service für ihre Unterstützung bei der Erstellung von DNA-Sequenzierungsbibliotheken. Exeter Sequencing Service und Computational Core Facilities an der Universität Exeter. Auszeichnung des Medical Research Council für klinische Infrastruktur (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) und BBSRC LOLA Award (BB/K003240/1).

1. Site Location <ol><li> Sammeln Sie die Silage Probe aus einer geeigneten Stelle wie einer Farm. Hier wurde der Bauernhof in Ballydulea, Co. Cork, Irland (51 ° 51&#39;58.4 &quot;N 8 ° 16&#39;48.7&quot; W). </li></ol> 2. DNA-Extraktion HINWEIS: DNA-Extraktion wurde ein kommerzieller Kit folgenden Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Eine negative Kontrolle, die keine Probe enthielt, wurde in der gesamten Bibliothek Herstellungsverfahren verwendet. <ol><li> In 100 bis 400 mg der Probe bis 978 &amp; mgr; l Natriumphosphat-Puffer und 122 ul Boden Lysepuffer in den Lyse Rohre geliefert. </li><li> Homogenisieren Proben durch die Lyse Rohre in den Homogenisator für 40 s bei einer Geschwindigkeit von 6,0 m / s setzen. </li><li> Centrifuge Lysate bei 14000 × g für 15 min und den Überstand auf eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 ul Proteinpräzipitates Solution (PPS). Mischen Sie die Lösung durch Umkehren 10-mal und Zentrifugebei 14000 × g für 5 min. </li><li> Fügen Sie den Überstand in 1 ml DNA-Bindungsmatrix in einem sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Lösung durch das Rohr ständig für 3 min zu invertieren. Lassen Sie die Mischung für 3 Minuten absetzen, verwerfen dann 500 &amp; mgr; l Überstand. Mischen Sie die verbleibende Überstand. </li><li> Übertragung von 600 &amp; mgr; l der Suspension auf einem Spinfilter und Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min. Entsorgen Sie das Filtrat und wiederholen Sie den Vorgang mit der verbleibenden Suspension. </li><li> Hinzufügen 500 ul Waschpuffer auf die DNA-Bindungsmatrix innerhalb des Spinfilter, mischen durch Pipettieren, dann Zentrifugieren bei 14.000 × g für 1 min. </li><li> Entsorgen Sie das Filtrat und Zentrifuge wieder den Spinfilter bei 14.000 × g für 2 min alle Waschpuffer entfernt wird, um sicherzustellen. Trocknen Sie die Spinfilter bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Pre-warm (70 ° C) der DNase-freiem Wasser (DES) und resuspendieren die DNA-Bindungsmatrix in 100 ul DES innerhalb des Spinfilter. Übertragen Sie die Spinfilter auf ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugen tuund Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min DNA zu eluieren. Lagern Sie die gereinigte DNA bei -20 ° C bis zur weiteren Analyse durchgeführt wird. </li></ol> 3. DNA-Reinigung mit DNA Purification Beads HINWEIS: Vor metagenomic Bibliothek Vorbereitung der extrahierten DNA wurde unter Verwendung von Reinigungsperlen gereinigt, um eine reine DNA-Probe, um sicherzustellen, erhalten. <ol><li> Inkubieren der Perlen bei 23 ° C für 30 min vor dem Gebrauch. Hinzufügen 2 Volumina Kügelchen zu der DNA-Probe und inkubiere die Lösung bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Legen Sie die Proben auf eine Trennung Magnet für 5 min und dann den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 &amp; mgr; l frischem 80% igem Ethanol (EtOH). Luft trocknen die Kügelchen für 10 min. </li><li> Entfernen Sie die Proben aus dem Trennmagneten und 50 &amp; mgr; l Elutionspuffer (EB), mischen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren der Suspension bei 23 ° C für 5 min, wonach die Proben wieder auf die Trennmagnet für 3 min schalten. </li><li> Transfer den Überstand, der die DNA enthält, in ein sauberes Röhrchen. Entsorgen Sie die Perlen. </li><li> Quantifizieren der gereinigten DNA gemäß Abschnitt vier. </li></ol> 4. Quantifizierung der gereinigten DNA HINWEIS: Die gereinigte DNA wurde quantifiziert den Anweisungen des Herstellers nach einem Fluorometer und doppelsträngige (dsDNA) High Sensitivity (HS) Assay-Kit. <ol><li> Bereiten Sie eine Arbeitslösung unter Verwendung von 199: 1-Verhältnis von Puffer zu Reagenz. </li><li> Fügen Sie 10 ul jeder DNA-Standard bis 190 &amp; mgr; l der Arbeitslösung. </li><li> In 10 ul gereinigter DNA zu 190 &amp; mgr; l der Lösung arbeiten. Das Endvolumen sollte 200 &amp; mgr; l sein. Inkubieren Standard und DNA-Proben bei 23 ° C für 2 min. </li><li> Analysieren Standards, bevor die DNA-Proben auf dem Fluorometer die Anweisungen auf dem Bildschirm verwendet wird. </li></ol> 5. Shotgun Sequencing Bibliothek Vorbereitung HINWEIS: Die Shotgun-Sequenzierung Bibliothek wurde unter Verwendung einerkommerzielle Bibliothek Vorbereitung Kit Anweisungen des Herstellers verwendet wird. <ol><li> Verdünnen Sie die DNA-Proben auf 0,2 ng / &amp; mgr; l unter Verwendung von EB. Alle , die Probe ist bereits unterhalb dieser Konzentration, dh die negative Kontrolle wird an der aktuellen Konzentration gelassen. </li><li> Mix 5 &amp; mgr; l der gereinigten DNA mit 10 &amp; mgr; l Puffer und 5 &amp; mgr; l Enzymgemisch. Inkubieren Proben bei 55 ° C für 5 min. </li><li> In 5 &amp; mgr; l Puffer zu neutralisieren und Inkubation der Lösung bei 23 ° C für 5 min. </li><li> Werden 5 &amp; mgr; l von jeder der probenspezifischen Sequenzindizes und 15 &amp; mgr; l PCR-Mastermix. </li><li> In einem Thermocycler, Inkubation der Proben bei 72 ° C für 3 min, 95 ° C für 30 s, vor 12 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s. Inkubieren Proben schließlich bei 72 ° C für 5 min. </li><li> Reinige den vorbereiteten DNA des Wulstes Reinigung wie zuvor, aber mit einer endgültigen Elution von 30 &amp; mgr; l EB verwendet wird. </li></ol> 6. Library Quantität und Qualität prüfen HINWEIS: Die Menge und die Qualität der hergestellten Bibliotheken wurden unter Verwendung eines kommerziellen Kits und Instrumentierungs beurteilt. <ol><li> Inkubieren Sie die Komponenten des Kits bei 23 ° C für 30 Minuten vor der Verwendung. </li><li> Fügen Sie 2 &amp; mgr; l DNA bis 2 &amp; mgr; l Puffer und vortex für 1 min bei 2000 Upm. </li><li> Drehen um die Probe nach unten zu gewährleisten, ist es an der Unterseite des Rohres ist. </li><li> Setzen Sie die Probenröhrchen, Analyseband und Spitzen in das Gerät, und führen Sie Analyse, wie durch die Software gerichtet. </li></ol> 7. DNA - Sequenzierung <ol><li> Übertragen Sie die vorbereiteten und quantifizierten DNA - Sequenzierung Bibliotheken Proben auf eine Sequenzierdienstleister und Sequenz mit 300 bp gepaart Ende Sequenzierung 45. </li></ol> 8. Analyse von Roh-Sequenzdaten HINWEIS: Die Befehle für jedes Programm ein Linux-Betriebssystem verwenden, werden unter dem Protokollschritt gezeigt. Die Pipeline für s verwendetequence Datenanalyse ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Programme sind vor der Analyse durch den Benutzer installiert werden. Dieser Prozess sollte für jede Probe einzeln durchgeführt werden. <ol><li> Analyse und Visualisierung von Daten DNA - Sequenz FastQC mit 46 eingeben , indem Sie auf der Kommandozeile / path-to-file / fastqc, gefolgt von der Vorwärts- und Rückwärts rohen raw_read1.fastq raw_read2.fastq liest. </li><li> einen Ausgabeordner angeben, indem Sie -o output_fastqc und das Dateiformat der rohen Lese Dateien durch -f fastq eingeben. </li><li> Sehen Sie sich die Ausgabedatei (Abbildung 2). path-to-file / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq. </li></ol> 9. Qualitätskontrolle Trimming und Filtern von Sequenzdaten <ol><li> Führen Sie das Trimmen Programm, Trimmomatic 28 durch in die Kommandozeile java -jar / path-to-file / trimmomatic-0.35.jar eingeben. </li><li> Geben Sie die Dateien gepaart Ende Dateien durch Eingabe von &quot;PE&quot;. Staat, dass 16 zentrale prHOLZBEARBEITUNGS- Einheiten (CPUs) sollte 16 -threads durch die Eingabe von dem Programm verwendet werden. </li><li> Führen Sie die beiden Dateien in der QC-Überprüfung durch die Namen der rohen vorwärts eingeben und rückwärts liest. Das Präfix der Ausgabedateien wird durch die Eingabe einer -baseout Silage bestimmt. </li><li> Definieren Sie die Optionen für das Programm von ILLUMINACLIP eingeben: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20 ERNTE: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36. </li><li> Wenn Sie fertig sind, analysieren die getrimmten Sequenzen unter Verwendung von FastQC wie zuvor, und die Ausgabe auf den Roh-Sequenzdaten zu vergleichen, um sicherzustellen, wurde erfolgreich durchgeführt trimmen. HINWEIS: Das Software-Tool, Trimmomatic, getrimmt liest weiter durch führende niedrige Qualität oder N-Basen zu entfernen (unter Qualität 3), Entfernen von geringer Qualität oder N Basen Hinter (unter Qualität 3) und jede Abtastung mit einem 4-Sockel breite Schiebefenster lesen. Die Parameter wurden eingestellt für das Schneiden, wenn die durchschnittliche Qualität pro Base unter 20 fällt und dann unter 36 Basen jeder liest lange fallen zu lassen. Schließlich wurden 15 Basen abgeschnitten from Kopf jeder lesen und wurden liest abgeschnitten vom Beginn des Lese 200 Basen zu halten. Dieser letzte Schritt wurde durchgeführt, einige Qualitätsprobleme zu überwinden, wenn die Sequenzierung lang (&gt; 200 bp) liest. Diese können für bestimmte Proben 28 eingestellt werden. java -jar /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout Silage ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 LEADING: 3 TRAILING: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 ERNTE: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36 </li></ol> 10. Metagenom Versammlung <ol><li> das ungepaarte Merge, liest, indem Sie Katze durch das ungepaarte liest gefolgt getrimmt; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Schreiben Sie die Dateien in eine neue Datei, indem Sie&gt; silage_merged_unpaired.fastq Katze silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq&gt; silage_merged_unpaired.fastq </li><li> Um de novo die sequenzierte DNA montieren, verwenden Sie Spades (St. Petersburg Genom Assembler) 30 , indem Sie / path-to-file / spades.py. Gibt an, dass 16 CPUs, indem Sie -t 16 und dass der metagenomic Parameter angewendet sollte, indem Sie --meta verwendet werden sollen. </li><li> Identifizieren Sie die nach vorne getrimmt liest mit -1 silage_read1_paired.fastq und die Rückseite liest von -2 silage_read2_paired.fastq. Das fusionierte ungepaarten liest werden durch -s silage_merged_unpaired.fastq angegeben. </li><li> Definieren Sie den Ausgabeordner von silage_spades eingeben -o. path-to-file / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades </li></ol> 11. Gepaart-End Read Overlap <ol><li> Merge Paare der DNA - Sequenz liest FLASH (schnelle Verstellung des Kurz Liest) unter Verwendung von 29 durch die Eingabe in Kommandozeile / path-to-file / Blitz. Gibt an, dass 16 CPUs sollten über -t 16 und die Ausgabe Präfix, indem Sie -o Silage verwendet werden. </li><li> Identifizieren getrimmten liest von silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq eingeben path-to-file / flash t 16 -o geflasht silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq </li></ol> 12. taxonomische <ol><li> Typ / path-to-file / kraken und die Datenbank angeben, indem Sie --db / path-to-file / Standard. </li><li> Definieren Sie, dass 16 CPUs sollten, indem Sie --threads 16 und identifizieren einen Ausgabeordner unter Verwendung --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt verwendet werden. Geben Sie den Eingabedateinamen; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq path-to-file / kraken --db Standard --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq HINWEIS: Die Einstufung der DNA - Sequenz zusammengesetzt Gerüste mit Kraken 7 gegen die jüngsten, abgeschlossen wurde Standard - Kraken - Datenbank , die alle verfügbaren Prokaryote Genomsequenzen enthalten. </li><li> Transfer Spalten 2 und 3 aus der Ausgabedatei und in eine neue Datei durch die Eingabe einer Schnitt -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li&gt; Die Ausgabedatei in Web-Browser öffnen. schneiden -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt&gt; FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int </li><li> Importieren Sie die neue Datei in Krona 12 durch ktImportTaxonomy eingeben. Geben Sie die Eingabedatei durch FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int eingeben. Identifizieren Sie die Ausgabedatei von FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html eingeben -o. path-to-file / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html </li></ol> 13. Funktions Annotation <ol><li> Gehen Sie auf die MG-RAST 47 Website, http://metagenomics.anl.gov/. Registrieren Sie sich als neuer Benutzer, falls erforderlich. in, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Hochladen&quot; Nach der Anmeldung. Laden Sie die zusammengebauten Gerüsten aus Schritt 10. </li><li> Sobald die Dateien hochgeladen haben, klicken Sie auf &quot;Senden&quot; und folgen Sie den Anweisungen und warten auf die Fertigstellung der Analyse. </li><li> Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, sehen Sie den Link per em gesendetail von MG-RAST oder alternativ klicken Sie auf &quot;Progress&quot;. Es gibt eine Liste der abgeschlossenen Aufträge. Klicken Sie auf den entsprechenden Job-ID und dann auf den Link zum &quot;Download-Seite&quot;. </li><li> Auf der Download-Seite unter der Überschrift &quot;Protein Clustering 90%&quot;, klicken Sie auf das Protein, um die vorhergesagten Protein Datei, 550.cluster.aa90.faa zum Download bereit. </li><li> Um die Proteine zu klassifizieren als mutmaßlich Zugehörigkeit zu einer bestimmten cazy Enzymklasse, zu vergleichen , die heruntergeladenen Proteine an die cazy Datenbank 48. Laden Sie die Kohlenhydrat-aktive Enzyme Database (cazy) von Dateien sind: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip und PL.zip. Diese Dateien repräsentieren die folgenden Enzymklassen jeweils: Hilfs Aktivitäten (AA), Carbohydrate Esterasen (CE), Glycosidhydrolasen (GH), Glycosyltransferasen (GT) und Polysaccharidlyasen (PL). </li><li> Entpacken Sie die Datenbankdateien und mit Anmerkungen versehen, die die Proteine ​​durch die Bestimmung der Protein Ähnlichkeit mit den cazy Datenbank Proteine, die die USEARCH UBLAST algor mitithm 49. Um eine Bash-Schleife (for i in * .txt) über die 5-Datenbank TXT-Dateien Typ iterieren &quot;for i in * .txt; do&quot;. </li><li> Führen Sie USEARCH, indem Sie / path-to-file / usearch8 mit dem Parameter -ublast um den ublast Algorithmus zu verwenden. Geben Sie dann den Namen der Datei Proteinsequenz heruntergeladen von MG-RAST &quot;mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa&quot;. </li><li> Um die Datenbankdatei angeben , um Typ verwendet werden &quot;-db $ i&quot; und die E-Wertschwelle bei 1e -5, Typ &quot;-evalue 1e-5&quot; zu spezifizieren. </li><li> Um die Suche nach der Entdeckung einer Zielsequenz zu beenden und damit , dass die Proteinsequenz Klassifizierung als zu der Zielenzymklasse, zB GH, Typ &quot;-masaccepts 1&quot; gesetzt . </li><li> Um festzulegen, dass 16 CPUs sollten Typ verwendet werden &quot;-threads 16&quot; und das Format der Ausgabedatei als ATAB-separierte Texttyp &quot;-blast6out&quot; angeben. Um die Ausgabedateityp &quot;$ i.ublast&quot; identifizieren. Um die Bash-Schleife zu beenden, typ &quot;; getan&quot; für i in * .txt; do / path-to-file / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $ i.ublast; erledigt </li></ol> 14. Visualizing cazy Annotation <ol><li> Um die Ausgabe von der cazy Annotation als Venn-Diagramm visualisieren, Protein-ID-Listen für jede Enzymklasse mit einer Bash-Schleife erzeugen. Geben Sie &quot;for i in * .ublast; do&quot;. </li><li> Um Spalte 1 aus der Ausgabedatei übertragen und in eine neue Datei, geben Sie &quot;cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list&quot;. </li><li> Beenden Sie die Schleife und geben Sie &quot;; done&quot;. </li><li> Öffnen Sie die .list Dateien in einem Texteditor. Gehen Sie auf die Webseite, wählen Sie die Anzahl der Sätze als 5 und fügen Sie den Inhalt der einzelnen Listendatei in einer separaten Box. Laden Sie das resultierende Diagramm als SVG-Datei. für i in * .ublast; tun cat $ i | cut -f 1&gt; $ i.list; erledigt </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Während eine in silico Analyse kann einen hervorragenden Einblick in die mikrobiellen Gemeinschaften geben , die in Umweltproben vorhanden sind, ist es wichtig , dass die taxonomische Klassifikationen zeigte mit entsprechenden Kontrollen und dass eine geeignete Tiefe der Sequenzierung erreicht wurde , in Verbindung durchgeführt werden , um die gesamte zu erfassen Bevölkerung derzeit 51. Mit jeder Computeranalyse, gibt es viele Wege ein ähnliches Ziel zu erreichen. Die Methoden , die wir in dieser Studie verwendet wurden , sind Beispiele für geeignete und einfache Methoden, die zusammengebracht wurden , um eine Reihe von Analysen auf der Silage microbiome zu erzielen. Eine Vielzahl und eine ständig wachsende Zahl von Bioinformatik - Tools und Techniken zur Verfügung metagenomic Daten zu analysieren, zum Beispiel Phylosift 8 und MetaPhlAn2 52, und diese sollten für ihre Relevanz für die Probe und die Analyse req auf die Untersuchung vor ausgewertet werdenuired 53. Metagenomanalyse Methoden werden von den Datenbanken zur Verfügung begrenzt für die Einstufung, Sequenzierung Tiefe und die Qualität der Sequenzierung. Die bioinformatische Verarbeitung hier demonstriert wurde auf lokaler, Hochleistungs-Maschine durchgeführt; jedoch Cloud-basierte Systeme sind ebenfalls erhältlich. Diese Cloud-basierte Dienste ermöglichen die Vermietung der notwendigen Rechenleistung, ohne die hohen Kosten Investition eines geeigneten leistungsfähigen lokalen Arbeitsplatz haben. Eine mögliche Anwendung dieser Methode wäre Silage in der Landwirtschaft vor seiner Verwendung zu beurteilen, daher sicherstellen, dass keine potenziell schädlichen Bakterien vorhanden sind, um sie in die Lebensmittelkette zu verhindern.

Metagenomics ist die direkte Analyse von DNA aus biologischen Gemeinschaften innerhalb Umweltproben 1 gefunden gereinigt und wurde ursprünglich verwendet , kultivierbarer Bakterien in Sedimenten 2 gefunden zu erkennen. Metagenomics wurde für eine Reihe von Anwendungen, beispielsweise die Identifizierung der humanen microbiome 3, Klassifizieren mikrobiellen Populationen im Meer 4 und auch für die Analyse der Bakteriengemeinschaften, entwickeln sich auf Kaffeemaschinen 5 eingesetzt. Die Einführung der nächsten Generation-Sequencing-Technologien führte zu größeren Sequenzierungsdurchsatz und Ausgang. Folglich wurde DNA Sequenzierung wirtschaftlichere 6 und die Tiefe der Sequenzierung werden , die stark erhöhte durchgeführt hat werden kann, Metagenomics werden ein leistungsfähiges, analytisches Werkzeug ermöglicht. &quot;Front-end&quot; Verbesserungen in der praktischen, molecular Aspekt metagenomic Sequenzierung haben , das Wachstum der in getriebensilico Bioinformatik - Tools zur Verfügung für die taxonomische Klassifizierung 7-9, funktionelle Annotation 10,11 und visuelle Darstellung 12,13 von DNA - Sequenzdaten. Die zunehmende Zahl der zur Verfügung stehenden, sequenziert pro- und eukaryotischen Genomen 14 ermöglicht eine weitere Genauigkeit bei der Klassifizierung von mikrobiellen Gemeinschaften, die gegen ausnahmslos durchgeführt werden , ein &quot;Back-End&quot; Referenzdatenbank von sequenzierten Genome 15. Zwei Hauptansätze für Metagenom-Analyse übernommen werden. Die herkömmlicheren Verfahren ist die Analyse der 16S rRNA-Gen codierende Region der bakteriellen Genoms. Die 16S - rRNA ist stark zwischen Prokaryonten Spezies konserviert , aber weist neun hypervariablen Regionen (V1 - V9) , die zur Spezies Identifizierung 16 ausgenutzt werden kann. Die Einführung von mehr Sequenzierung (≤ 300 bp paarigen end) für die Analyse von DNA-Sequenzen erlaubt Spanning zwei hypervariablen Regionen, insbesonderedie V3 - V4 Bereich 17. Advances in anderen Sequenzierungstechnologien, wie Oxford Nanopore 18 und PacBio 19, erlauben die gesamte 16S - rRNA - Gen angrenzend sequenziert werden. Während 16S rDNA basierte Bibliotheken einen gezielten Ansatz zur Identifizierung von Arten liefern und den Nachweis von geringer Kopienzahl DNA ermöglichen, die in gereinigten Proben, Shotgun-Sequenzierung Bibliotheken ermöglichen die Detektion von Spezies natürlicherweise vorkommt, die DNA-Bereiche enthalten, die entweder nicht amplifizierbare durch die 16S sind rRNA Marker Primersequenzen verwendet werden, oder weil die Unterschiede zwischen der Template - Sequenz und die Verstärkungsprimersequenz sind zu groß , 20,21. Obwohl weiterhin DNA - Polymerasen eine hohe Genauigkeit der DNA - Replikation, können Basisfehler dennoch während des PCR - Amplifikation auftreten und auf diese eingebauten Fehler in falsche Klassifizierung der ursprünglichen Spezies 22 führen kann. Vorspannungen in der PCR-Amplifikation des Templates seqüsse kann auch auftreten; Sequenzen von DNA mit einem hohen GC - Gehalt kann unter im endgültigen Amplikon Pool 23 und ähnlich unnatürliche Basenmodifikationen, wie Thymin Glykol dargestellt werden, können DNA - Polymerasen , wodurch Fehler in der Amplifikation von DNA - Sequenzen 24 stoppen. Im Gegensatz dazu ist eine Shotgun-Sequenzierung DNA-Bibliothek eine DNA-Bibliothek, die unter Verwendung aller der gereinigten DNA hergestellt worden ist, die aus einer Probe und anschließend fragmentiert in kürzere DNA-Kettenlängen vor der Herstellung für die Sequenzierung extrahiert wurde. Taxonomische Klassifizierung von DNA - Sequenzen , die durch Shotgun - Sequenzierung erzeugt wird genauer , wenn im Vergleich zu 16S - rRNA - Amplikon - Sequenzierung 25, obwohl der finanzielle Aufwand eine zuverlässige Sequenzierungstiefe zu erreichen ist erforderlich größer als die der Amplikon - Sequenzierung 26. Der große Vorteil der Shotgun-Sequenzierung Metagenom ist, dass sequenzierten Regionen der verschiedenen Genomen in der Probe für die Gen-Prospektion zur Verfügung stehen, sobald sie gewesen seinwurde 27 taxonomisch klassifiziert. Metagenom-Sequenzdaten werden von einer ständig wachsenden Palette bioinformatischer Tools analysiert. Diese Werkzeuge sind in der Lage eine Vielzahl von Anwendungen auszuführen, zum Beispiel Qualitätskontrolle Analyse der Roh - Sequenzdaten 28, der gekoppelten Ende überlappende liest 29, de novo Assemblierung von Sequenz liest zu Contigs und Gerüsten 30,31, taxonomische Klassifizierung und Visualisierung der Sequenz liest und montierten Sequenzen 7,12,32,33 und die funktionelle Annotation von montierten Sequenzen 34,35. Silage, von den Landwirten auf der ganzen Welt aus fermentiertem Getreide hergestellt wie Mais (Zea Mays) wird überwiegend als Viehfutter verwendet. Silage wird mit dem Bakterium Lactobacillus sp behandelt. zu unterstützen 36 Gärung bis heute, aber es gibt begrenzte Kenntnis der anderen in Silage gefunden mikrobiellen Populationen. Die fermentation Prozess kann zu unerwünschten und potenziell schädlichen Mikroorganismen führen , dass weit verbreitet in der Silage 37. Neben Hefen und Schimmelpilze, Bakterien sind besonders anpassungsfähig an die anaerobe Umgebung in Silagen Fermentieren und häufiger im Zusammenhang mit Erkrankungen bei Nutztieren sind statt der Abbau der Silage 38. Buttersäurebakterien können versehentlich aus dem Boden zugesetzt werden , bleibt , wenn die Silage Silos Füllen und sind in der Lage , die Milchsäure, ein Produkt von anaerober Digestion, um Buttersäure zu konvertieren, wodurch der pH - Wert der Silage Erhöhung 39. Dieser Anstieg des pH - Wertes kann in Fäulnisbakterien zu einem Aufschwung führen , die normalerweise nicht in der Lage sein würde , 38 Wachstum unter optimalen Silagefermentationsbedingungen aufrecht zu erhalten. Clostridium spp. , Listeria spp. und Bacillus spp. sind von besonderer Bedeutung, vor allem in Silage für Milchvieh Futtermittel, wie Bakteriensporen, die die gastr überlebt habenointestinal - Darm - Trakt 40 können die Nahrungskette gelangen, führen zu Verderb von Lebensmitteln und in seltenen Fällen von Mensch und Tier Todesfälle 37,39,41-44. Hinzu kommt, dass es schwierig ist, die genaue wirtschaftlichen Auswirkungen der tierärztlichen Behandlung und Vieh Verlust von Silage Verderb verursacht abschätzen zu können, ist es wahrscheinlich zu einer Farm schädlich sein, wenn ein Ausbruch stattfinden war. Es wird vermutet, dass durch eine Metagenom-Ansatz können wir die mikrobiellen Populationen zu klassifizieren, die in Silageproben vorhanden sind und weiterhin mikrobielle Gemeinschaften mit Silage Verderb verbunden sind, identifizieren, die wiederum würde möglicherweise eine schädliche Wirkung auf das Vieh haben, so dass Abhilfemaßnahmen zu vor der Silage genommen ist als Nahrungsquelle verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit für Boden</td><td>MP Bio</td> 116560200 <td>DNA-Extraktion</td><td></td></tr><tr><td>DNA FastPrep</td><td>MP Bio</td> 116004500 <td>DNA-Extraktion</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Kügelchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Elutionspuffer</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>DNA </td></tr><tr><td>Quantifizierung Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA-Bibliotheksvorbereitungskit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td> G2964AA <td>DNA-Quantifizierung</td><td></td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>HS D100 ScreenTape Reagenzien</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 und 401425 DNA-Quantifizierung</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA-Sequenzierung - zur Verfügung gestellt von einem Sequenzierungsdienst</td></tr><tr><td>Hochleistungs-Analyse-Workstation</td><td>Verschiedene</td><td></td><td>Lokale oder Cloud-basierte, vom Benutzer bevorzugte Systeme</td></tr></tbody></table>

metagenomanalyse von silage

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomik ist definiert als die direkte Analyse von Desoxyribonukleinsäure (DNA), die aus Umweltproben gereinigt wurde, und ermöglicht die taxonomische Identifizierung der in ihnen vorhandenen mikrobiellen Gemeinschaften. Es gibt zwei hauptsächliche metagenomische Ansätze; Sequenzierung der 16S rRNA-Genkodierungsregion, die eine ausreichende Variation zwischen den Taxa für die Identifizierung aufweist, und Shotgun-Sequenzierung, bei der Genome der in der Probe vorhandenen Organismen analysiert und "operationellen taxonomischen Einheiten" zugeordnet werden; Arten, Gattungen oder Familien, je nach Umfang der Sequenzierungsabdeckung. 
In dieser Studie wurde die Schrotflintensequenzierung verwendet, um die in Rindersilage vorhandene mikrobielle Gemeinschaft zu analysieren und, gekoppelt mit einer Reihe von bioinformatischen Werkzeugen zur Qualitätsprüfung und Filterung der DNA-Sequenz-Reads, eine taxonomische Klassifizierung der in der beprobten Silage vorhandenen mikrobiellen Populationen durchzuführen und eine funktionelle Annotation der Sequenzen zu erreichen. Diese Methoden wurden eingesetzt, um potenziell schädliche Bakterien zu identifizieren, die in der Silage vorhanden waren, was ein Hinweis auf den Verderb der Silage ist. Wenn verdorbene Silage nicht saniert wird, kann sie bei der Aufnahme für das Vieh potenziell tödlich sein.

Vor der bioinformatischen Verarbeitung, liest wurden Rohsequenz getrimmt und Adapter wurden mit Trimmomatic Software 28 entfernt. Nach dem Trimmen und Filterungsschritt liest die Anzahl von bis zu 50% der Sequenz reduziert liest (Tabelle 1). Die durchschnittliche Basis phred Stand&gt; 30 nach Qualitätskontrolle (Abbildung 2). Paare von DNA - Sequenzen , die wurden überlappende Bereiche hatten 29 FLASH Software verschmolzen mit zu erzeugen einzelne länger liest, nicht überlappende liest in einer separaten Datei gespeichert. 45.47% liest (105.343) erfolgreich kombiniert. Im Anschluss an die Überlagerung von liest FLASH mit der liest, sind die resultierenden Fragmente erweitert bakterielle taxonomische Klassifizierung mit Kraken - Software 7 und wurden anschließend visualisiert mit Krona Software (Abbildung 3) unterzogen wurden . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page='"1"&gt;' die mehrheit der bakterienarten in silage metagenom sind innerhalb von prokaryotischen phyla gefunden: firmicutes actinobacteria proteo und bacteroidetes . verteilung klassen dieser st k>Abbildung 4 zu sehen ist. Die häufigsten Arten in der Metagenom waren Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) und Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). Arten wichtig für die Tiergesundheit und in Krankheit in Verbindung gebracht wurden ebenfalls beobachtet; Clostridium spp. (1%) , Bacillus spp. (0,6%), Listeria spp. (0,2%) vorhergesagt wurden, die in der Silage Probe sein. Functional Annotation wurde am durchgeführt montiert liest. Die Metagenom wurde mit der Pik montiert Assembler 30 der zugeschnittene und filtriertPaired-End und ungepaarten liest Erzeugung 92.284 Gerüste. Um Cellulasen zu identifizieren, wurden die Proteine ​​vorhergesagt MG-RAST mit und kommentierte die Kohlenhydrat-aktive Enzyme Datenbank unter Verwendung von (cazy). Von den 97.562 vorhergesagten Proteine wurden 6357 als mutmaßliche Kohlenhydrat-aktives Enzym kommentierte in einer der fünf Enzyme Klassen, die die cazy Datenbank (Abbildung 5) bilden. Die Ergebnisse wurden als ein Venn - Diagramm unter Verwendung von 50 InteractiVenn visualisiert Software die Verteilung von Protein Annotationen einschließlich derjenigen zeigt , die mehr als eine Cazy Enzymklasse Annotation. Davon wurden 3861 vorhergesagt Glycosid-Hydrolase-Aktivität aufweisen und im Labor weiter charakterisiert werden Funktion zu bestätigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg"> Abbildung 1: Die bioinformatische Metagenomics Pipeline für die Analyse von Silage. Zwei Hauptansätze warenverwendet, um die microbiome von Silage, taxonomische Klassifizierung und funktionelle Annotation zu untersuchen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg"> Abbildung 2: Sequenz Qualität Per-Basis vor und nach dem Trimmen und Adapter Entfernen. Die pro-Basensequenz Qualität Plot von FASTQC zeigt die durchschnittliche phred Punktzahl über die Länge der Sequenz liest vor und nach der Qualitätskontrolle. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg"> Abbildung 3: Die taxonomische Classification des bakteriellen Microbiome Solid Silage. Klassifizierung von getrimmt und überlappende Sequenz liest aus FLASH durchgeführt wurde Kraken 7 verwenden und anschließend mit Krone sichtbar gemacht . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg"> Abbildung 4: Taxonomische Klassenverteilung des 4 am reichlichsten Phyla in der Bakterien Microbiome Solid Silage. Der Anteil der einzelnen Klassen von Bakterien innerhalb der vier am häufigsten vorkommende Stämme. Firmicutes: Clostridien (rot) und Bazillen (dunkelblau); Proteo: delta / epsilon (rosa), alpha (blassblau), Gamma (orange) und Beta (türkis); Bacteroidetes: Flavobacteriia (dunkelblau) und Bacteroidia(blasses Grün); Actinobacteria: Coriobacteriia (dunkelviolett) und andere Actinobacteria (dunkelgrün). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg"> Abbildung 5: cazy Annotation des Prognostizierte Proteome im festen Silage Microbiome. Venn-Diagramm der Verteilung der fünf Enzymklassen Cazy Annotationen in der vorhergesagten Proteoms von festen Silage microbiome zeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> # Raw liest </td><td rowspan="2"> # Filtered liest (gepaart) </td> # Filtered liest <td rowspan="2"> # Geflasht liest </td></tr><tr><td> (Gepaart) </td><td> (Ungepaarten) </td></tr><tr><td> 2.374.949 x2 </td><td> 231.679 x2 </td><td> 1892534 </td><td> 105343 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung Tabelle der Sequenzierung liest.

Metagenomik wurde verwendet, um das Mikrobiom von Silage-Rinderfutter zu untersuchen. Die Analyse wurde durch Schrotflintensequenzierung durchgeführt. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Viehfutter zu charakterisieren.

Metagenomanalyse von Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Bakteriengemeinschaft zu verstehen, die in einer Silageprobe vorhanden ist, obwohl diese Verfahren auf eine Reihe verschiedener Probentypen angewendet werden können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wenn es darum geht, die prokaryotischen Gemeinschaften zu identifizieren, die in komplexen mikrobiellen Systemen zu finden sind, wie im hier vorgestellten Fall, Silage für Tierfutter. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Schrotflintensequenzierung anstelle der konventionelleren 16S-Amplikon-Sequenzierung verwendet wird, was eine viel höhere Genauigkeit bei der Klassifizierung des Mikrobioms ermöglicht.Diese Methode kann auf eine Vielzahl anderer Proben angewendet werden, in denen sich komplexe Mikrokosmen bilden können, z. B. im menschlichen Darm, auf der Hautoberfläche, in Wasserproben oder sogar um die Kaffeemaschine im Büro. Ein kommerzielles Kit wird verwendet, um DNA aus der Silageprobe zu extrahieren. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 100 bis 400 Milligramm der Probe zu 978 Mikrolitern Natriumphosphatpuffer und 122 Mikrolitern Bodenlysepuffer in das mitgelieferte Lyseröhrchen geben.Fügen Sie eine Negativkontrolle hinzu, die keine Silageprobe enthält. Homogenisieren Sie die Proben, indem Sie die Lyseröhrchen 40 Sekunden lang mit einer Geschwindigkeit von 6,0 Metern pro Sekunde in den Homogenisator einführen. Zentrifugieren Sie die Lysate 15 Minuten lang.Den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 Mikrolitern Proteinfällungslösung überführen und die Lösung durch 10-maliges Invertieren mischen. Dann fünf Minuten zentrifugieren. Der Überstand wird in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, das einen Milliliter DNA-Bindungsmatrix enthält.Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen drei Minuten lang ständig umdrehen. Lassen Sie die Mischung drei Minuten lang absetzen, verwerfen Sie dann 500 Mikroliter des Überstands und mischen Sie den restlichen Überstand durch Pipettieren. 600 Mikroliter der Suspension werden in einen Schleuderfilter überführt und eine Minute lang bei 14.000 G zentrifugiert.Das Filtrat verwerfen und den Vorgang mit der restlichen Suspension wiederholen. Nach dem Verwerfen des Filtrats 500 Mikroliter Waschpuffer zur DNA-Bindungsmatrix im Spin-Filter hinzufügen, durch Pipettieren mischen und eine Minute lang bei 14.000 G zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und zentrifugieren Sie den Schleuderfilter zwei Minuten lang, um sicherzustellen, dass der gesamte Waschpuffer entfernt wird.Trocknen Sie den Schleuderfilter fünf Minuten lang bei 23 Grad Celsius. Geben Sie 100 Mikroliter vorgewärmtes DNase-freies Wasser in die DNA-Bindungsmatrix und geben Sie den Spin-Filter in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 14.000 Mal G, um die DNA zu eluieren.Lagern Sie die DNA bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die weitere Analyse benötigt wird. Die aus Silageproben extrahierte DNA wird mit DNA-Reinigungskügelchen aufgereinigt. Nehmen Sie die Kügelchen aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie mindestens 30 Minuten vor Gebrauch bei 23 Grad Celsius.Geben Sie zwei Volumen Kügelchen zu jeder DNA-Probe und inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 23 Grad Celsius. Legen Sie die Proben fünf Minuten lang auf einen Trennmagneten und entsorgen Sie dann den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 200 Mikrolitern frischem 80%igem Ethanol.Trocknen Sie die Perlen 10 Minuten lang an der Luft. Die Perlen müssen ausreichend trocken, aber nicht übergetrocknet sein, daher ist es wichtig, die Perlen visuell zu inspizieren, bevor Sie fortfahren. Nehmen Sie die Proben aus dem Trennmagneten, fügen Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 23 Grad Celsius und legen Sie die Proben dann für drei Minuten wieder auf den Trennmagneten.Übertragen Sie den Überstand, der die DNA enthält, in ein sauberes Röhrchen und entsorgen Sie die Kügelchen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Arbeitslösung mit einem Verhältnis von Puffer zu Reagenz von 199 zu eins vor. Geben Sie 10 Mikroliter jedes DNA-Standards in 190 Mikroliter Arbeitslösung.Fügen Sie 10 Mikroliter gereinigte DNA zu 190 Mikrolitern Arbeitslösung hinzu. Inkubieren Sie die Standard- und DNA-Proben zwei Minuten lang bei 23 Grad Celsius. Analysieren Sie anschließend die Standards vor den DNA-Proben auf dem Fluorometer gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm.Es ist wichtig, dass die gereinigte DNA von guter Qualität und genau quantifiziert ist, so dass die DNA-Extraktion wiederholt werden muss, wenn Zweifel an der Qualität und der Konzentration der DNA bestehen. Die Shotgun-Sequencing-Bibliothek wird mit einem kommerziellen Bibliotheksvorbereitungskit vorbereitet. Verdünnen Sie die DNA-Proben mit Elutionspuffer auf 0,2 Nanogramm pro Mikroliter.Mischen Sie fünf Mikroliter der gereinigten DNA mit 10 Mikrolitern Tagmentationspuffer und fünf Mikrolitern Tagmentationsenzymmischung. Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 55 Grad Celsius. Geben Sie fünf Mikroliter Neutralisationspuffer zu jeder Probe und inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 23 Grad Celsius.Fügen Sie als Nächstes jeweils fünf Mikroliter des probenspezifischen Sequenzierungsindex und 15 Mikroliter des PCR-Mastermixes hinzu. Geben Sie die Proben in einen Thermocycler und führen Sie die PCR durch. Die vorbereitete DNA wird unter Verwendung der Bead-Aufreinigungsmethode wie zuvor gezeigt aufgereinigt, jedoch mit einer abschließenden Elution von 30 Mikrolitern Elutionspuffer.Anschließend wird die DNA sequenziert und eine Reihe von bioinformatischen Werkzeugen verwendet, um die Sequenzdaten zu analysieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Die taxonomische Klassifizierung des bakteriellen Mikrobioms wurde mit der Kracken-Software durchgeführt und anschließend mit der CHROMA-Software visualisiert. Die Mehrzahl der im Silagemetagenom vorkommenden Bakterienarten kommt in vier prokaryotischen Fila vor, Firmicutes bei 34%, Actinobakterien bei 28%, Proteobakterien bei 27% und Bactoroitis bei 7%. Die Verteilung der innerhalb dieser Fila vorkommenden Klassen ist ebenfalls angegeben.Die funktionelle Annotation, die an assemblierten Reads durchgeführt wurde, führte zu 6.357 vorhergesagten Proteinen, die als mutmaßliches kohlenhydrataktives Enzym und eine der fünf Enzymklassen annotiert wurden, aus denen sich die Datenbank der kohlenhydrataktiven Enzyme zusammensetzt. Dieses Venn-Diagramm zeigt die Verteilung von Proteinannotationen, einschließlich solcher, die mehr als eine Enzymklassenannotation enthalten. Von diesen wurde bei 3.591 eine Glykosidhydrolase-Aktivität vorhergesagt.Einmal gemeistert, kann die Vorbereitung von DNA-Sequenzierungsbibliotheken an einem einzigen Tag abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sicherzustellen, dass es keine Kreuzkontamination zwischen den Proben gibt und immer geeignete Kontrollen wie z. B. eine Blindprobe verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere biofomatische Analysen durchgeführt werden, um die von Kracken vorgenommenen Klassifizierungen zu validieren.Diese metagenomischen Techniken ermöglichen es Forschern, das Mikrobiom in vielen komplexen Systemen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie metagenomische DNA-Sequenzierungsbibliotheken vorbereiten und bioinformatische Analysen der erhaltenen DNA-Sequenz-Reads durchführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DNA-Bindungsreagenzien äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe und Laborkittel bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getragen werden sollten.

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