Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, durch intravitale Multiphotonen-Bildgebung der Ohrhaut der Maus zu verstehen, wie Immunzellen auf Ischämie-Reperfusion reagieren. Diese Methode kann dazu beitragen, einige der sehr wichtigen Fragen im Bereich der Immunologie und Dermatologie zu beantworten, um das dynamische Verhalten von Immunzellen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein robustes Bildgebungsmodell für die Untersuchung zellulärer Aktivitäten in der Haut im entzündeten oder ruhenden Zustand bietet.

Obwohl diese Methode Aufschluss über ischämische Reperfusionsschäden geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Überempfindlichkeitsreaktionen und Infektionen angewendet werden. Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, um ihre Körpertemperatur während des gesamten Vorbereitungsvorgangs bei 37 Grad Celsius zu halten. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Zehenquetschreflexes.

Tragen Sie anschließend Augenschmiermittel auf die Augen des Tieres auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Tragen Sie anschließend vorsichtig Enthaarungscreme auf die oberen zwei Drittel des Hinterohrs auf und warten Sie zwei bis drei Minuten. Entfernen Sie dann die Creme mit feuchten Wattestiften gründlich, aber sanft

Induzieren Sie nun mit den Neodym-Magneten eine Ischämie in der Haut des Mausohrs. Stecken Sie dazu zunächst die Magnete in ihre einzelnen Kunststoffführungen. Positionieren Sie einen Magneten so, dass nur der Rand mit einem zweiten ventralen Magneten in Berührung kommt, der unter der ventralen Seite des Ohrs platziert werden sollte, wobei das Ohr flach auf dem Magneten aufliegt.

Wenn Sie fertig sind, lassen Sie die Magnete vorsichtig zusammenkommen. Entfernen Sie nach 1,5 Stunden Ischämie die Magnete, indem Sie sie mit den Kunststoffführungen voneinander wegdrehen, damit die Reperfusion stattfinden kann. Unmittelbar nach der Entfernung des Magneten ist Evans Blue oder ein anderes Mittel zur Markierung von Blutgefäßen Ihrer Wahl intravenös zu verabreichen.

Schneide in diesem Schritt zwei Stücke Kreppband ab. Lassen Sie die Klebeseiten zusammenkleben und lassen Sie dabei etwa einen Millimeter Klebstoff über die gesamte Breite übrig. Schneiden Sie dann das Kreppband in zwei Teile, damit es im Schlitz auf der Ohrplattform platziert werden kann.

Führen Sie dieses Kreppband etwa zur Hälfte durch den Schlitz ein, so dass die Klebeseite nach oben zeigt. Positionieren Sie danach die Maus so auf dem Heizkissen, dass sich das abzubildende Ohr neben dem Kreppbandstreifen befindet. Drücken Sie das Ohr mit zwei PBS-angefeuchteten Wattestäbchen-Applikatoren vorsichtig gegen den Klebestreifen.

Führe das Mausohr mit dem Streifen als Führung durch den Schlitz und richte die Maus gleichzeitig näher an die Bühne heran. Da die Ohrhaut sehr empfindlich ist, muss dieser Schritt sehr vorsichtig durchgeführt werden, um Verletzungen durch die Vorbereitung zu vermeiden. Um das Klebeband zu entfernen, fügen Sie zuerst einen Tropfen PBS hinzu, um die Haftfähigkeit des Klebebandes zu verringern.

Trennen Sie dann das Mausohr so vorsichtig wie möglich mit einem feinen Pinsel vom Kreppband. Drücke das Ohr gegen die Ohrplattform flach, indem du einen feuchten Wattestäbchen-Applikator vorsichtig über das Ohr rollst. Geben Sie anschließend einen Tropfen PBS unter das Deckglas und legen Sie es vorsichtig über das Ohr.

Führen Sie anschließend den rektalen Temperaturfühler ein und schließen Sie die Drähte gemäß den Anweisungen des Herstellers an das Heizsystem an. Um Bilder aufzunehmen, legen Sie das Tier unter das Multiphotonenmikroskop. Beginnen Sie mit einer Bildgebungsregion, die sich in unmittelbarer Nähe des Randes der Ischämie befindet und durch eine massive Evans-Blue-Leckage gekennzeichnet ist.

Die schematische Darstellung zeigt hier die Positionierung der Magnete. Diese beiden Fotos zeigen ein präischämisches und ein postischämisches Ohr nach dem Magnetklemmen. In diesem Schema zeigt das Ohr den abgebildeten Bereich in Bezug auf die Stelle, an der der Magnet platziert wurde.

Diese Zeitraffersequenz der maximalen Projektion zeigt die Neutrophileninfiltration als Reaktion auf die Reperfusion in der Ohrhaut von LysM-eGFPM-Albino-Mäusen nach 1,5 Stunden Ischämie. Zu früheren Zeitpunkten deutet das Fehlen des Evans-Blue-Signals auf einen vorübergehenden Gefäßverschluss nach Ischämie hin. Einmal gemeistert, können die Vorbereitungen für das ischämische reperfundierte Ohr für die Bildgebung in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Anästhesietiefe und die Temperatur der Maus ständig zu überprüfen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Färbung der Haut des Mausohrs durchgeführt werden, um einen globalen Überblick über die zellulären Lokalisationen zu erhalten. Nach der Entwicklung dieses Protokolls ebnete es Forschern auf dem Gebiet der Immunologie und Dermatologie den Weg, die angeborene Immunität in der Haut des Mausohrs zu erforschen.

Nachdem Sie sich diese Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Bildgebungsmodell für die Haut des Mausohrs einrichten, um ischämische Reperfusionsschäden zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Multifotomikroskop gefährlich sein kann. Und es sollten Vorsichtsmaßnahmen wie Lasersicherheitsschulungen getroffen werden.