Name: Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Bioengineering-Methode zur Entwicklung künstlicher Spleißfaktoren für die spezifische Manipulation alternativen Spleißens in menschlichen Zellen. Diese flexible Technik ermöglicht die gezielte Regulation von RNA-Prozessierung.

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Diese Arbeit wurde von NIH Zuschuss R01-CA158283 und NSFC gewähren 31.400.726 zu ZWYW unterstützt von dem Young Thousand Talents-Programm und die National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 31471235 und 81422038) finanziert wird. XY wird durch die Habilitations Science Foundation of China (2015M571612) gefördert.

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<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung für die Konstruktion und den Bau von künstlichen Spleißfaktoren, die spezifisch das alternative Spleißen eines Zielgens manipulieren kann. Diese Methode nutzt den einzigartigen RNA-Bindungsmodus von PUF wiederholt ein RNA-bindenden Gerüst mit maßgeschneiderter Spezifität herzustellen. Es kann verwendet werden, um entweder aktiviert oder Spleißen unterdrücken. Der kritische Schritt in diesem Protokoll ist die Erzeugung der neu programmiert...

Die meisten menschlichen Gene werden einem alternativen Spleißen (AS) unterzogen, um mehrere Isoformen mit unterschiedlichen Aktivitäten zu produzieren, was die Kodierungskomplexität des Genoms 1 , 2 stark erhöht hat. AS bietet einen wichtigen Mechanismus zur Regulierung der Genfunktion, und es ist eng reguliert durch verschiedene Wege in verschiedenen zellulären und Entwicklungsstadien 3 , 4 . Weil das Spleißen der Fehlinformation eine häufige Ursache für die menschliche Erkrankung ist 5 , 6 , 7 , 8 , wird die Zielvermehrungsregelung zu einem attraktiven therapeutischen Weg. Nach einem vereinfachten Modell der Spleißregulierung wird AS hauptsächlich durch Splicing Regulatory cis -Elements (SREs) in Pre-mRNA kontrolliert, die als Spleißverstärker oder Schalldämpfer von alternativen Exons fungieren. ThEse SREs rekrutieren spezifisch verschiedene transaktive Proteinfaktoren ( dh Spleißfaktoren), die die Spleißreaktion 3 , 9 fördern oder unterdrücken. Die meisten transaktiven Spleißfaktoren haben separate sequenzspezifische RNA-Bindungsdomänen, um ihre Ziele und Effektordomänen zu erkennen, um das Spleißen zu kontrollieren. Die bekanntesten Beispiele sind die Mitglieder der Serin / Arginin-reichen (SR) Proteinfamilie, die N-terminale RNA-Anerkennungs-Motive (RRMs) enthalten, die exonische Spleißverstärker binden und C-terminale RS-Domänen, die den Exon-Einschluss fördern . Umgekehrt bindet hnRNP A1 an exonische Spleißschalldämpfer durch die RRM-Domänen und hemmt den Exoneinschluss durch eine C-terminale Glycin-reiche Domäne 11 . Mit solchen modularen Konfigurationen sollten Forscher in der Lage sein, künstliche Spleißfaktoren durch die Kombination einer spezifischen RNA-Binding Domain (RBD) mit verschiedenen Effec zu entwickelntor-Domänen, die Splicing aktivieren oder hemmen. Der Schlüssel für eine solche Gestaltung ist es, eine RBD zu verwenden, die Ziele mit programmierbaren RNA-Bindungsspezifität gegeben erkennt, die an die DNA-Bindungsmodus des TALE Domäne analog ist. Allerdings enthalten die meisten nativen Spleißfaktoren RRM oder K Homology (KH) Domänen, die kurze RNA - Elemente mit schwacher Affinität erkennen und somit fehlt eine prädiktive RNA-Protein - Erkennung „Code“ 12. Das RBD von PUF repeat Proteinen (dh der PUF - Domäne) hat einen einzigartigen RNA Erkennungsmodus für die Neugestaltung von PUF Domänen ermöglichen spezifisch an verschiedene RNA - Targets 13, 14 zu erkennen. Die kanonische PUF Domäne enthält acht Wiederholungen von drei α-Helices, die jeweils eine einzelne Base in einem 8-nt RNA-Ziel zu erkennen. Die Seitenketten der Aminosäuren an bestimmten Positionen der zweiten α-Helix bilden spezifische Wasserstoffbrücken mit dem Watson-Crick Rand ter RNA - Basen, die die RNA - Bindungsspezifität von jedem Rapport (1A) bestimmt. Der Code für die RNA - Basenerkennungs der PUF repeat ist überraschend einfach (Figur 1A), so dass für die Erzeugung von PUF - Domänen , die jeden möglichen 8-Basen - Kombination erkennen (rezensiert von Wei und Wang 15). Dieses Baukastenprinzip ermöglicht die Erzeugung eines Engineered Splicing Factor (ESF), die aus einer angepassten PUF - Domäne und einer Spleiß - Modulations Domäne (also eine SR - Domäne oder eine Gly-reichen Domäne) besteht. Diese ESFs funktionieren kann entweder als Splicing Aktivatoren oder als Inhibitoren auf verschiedene Arten von Spleißereignisse zu steuern, und sie haben sich bewährt , als Werkzeuge , um das Spleißen endogener Gene zu manipulieren , 16 für die menschliche Krankheit verbundenen, 17. Als Beispiel haben wir PUF-Gly-Typ-ESFs konstruiert, um speziell das Spleißen des Gens Bcl-x zu verändernDie anti-apoptotische lange Isoform (Bcl-xL) an die pro-apoptotische kurze Isoform (Bcl-x S) umzuwandeln. Eine Verschiebung des Verhältnisses der Bcl-x - Isoform war ausreichend , um mehrere Krebszellen mehr Anti-Krebs - Chemotherapie - Medikament 16, zu sensibilisieren darauf hindeutet , dass diese künstlichen Faktoren als potentielle therapeutische Reagenzien nützlich sein können. Zusätzlich Spleißen mit bekannten Spleißen Effektordomänen zu steuern (beispielsweise eine RS oder Gly-reiche Domäne) kann die engineered PUF Faktoren auch die Aktivitäten des neuen Spleißfaktoren zu untersuchen , verwendet werden. Zum Beispiel kann bei Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass die C-terminale Domäne von mehreren SR - Proteine aktivieren oder Splicing hemmen , wenn auf verschiedene prä-mRNA - Bereiche 18, dass das Alanin-reiches Motiv von RBM4 Bindung kann Splicing 19, hemmen , und dass das Prolin-reiches Motiv DAZAP1 kann 20 Spleißen verbessern, 21 &lt;/ Sup&gt;. Diese neuen funktionellen Domänen können verwendet werden, um zusätzliche Arten von künstlichen Faktoren Feinabstimmung Spleißen zu konstruieren.

<table><tbody><tr><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase (Phusion High-Fidelity) mit PCR-Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Ligase (T4-DNA-Ligase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Liposomales Transfektionsreagenz (Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA Extraktionspuffer (TRIzol-Reagenz)</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol-Reagenz enthält Phenol, das Verbrennungen verursachen kann. Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transkriptase (RT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3 Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>PARP Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-x Antikörper</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Aktin-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Tubulin-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>FLAG-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose-Membran</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting-Nachweisreagenzien</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>Filtersterilisieren und lagern bei 4 & Grad; C</td></tr><tr><td>Vector pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vector pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vector psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Sekundärantikörper (Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

engineering künstliche faktoren zur speziellen manipulation alternativen spleißen in menschlichen zellen

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Die Verarbeitung der meisten eukaryotischen RNAs durch RNA-Bindungsproteine ​​(RBPs) mit modularen Konfigurationen, einschließlich einer RNA-Erkennungsmodul, vermittelt, die spezifisch die prä-mRNA-Target und eine Effektor-Domäne bindet. Bisher haben wir die Vorteile des einzigartigen RNA-Bindungsmodus der PUF-Domäne in der menschlichen Pumilio 1 genommen ein programmierbares RNA-Binde Gerüst zu erzeugen, die verwendet wurde, verschiedene künstliche RBPs Ingenieur RNA-Metabolismus zu manipulieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll wird beschrieben Engineered Spleißfaktoren (ESFs) zu konstruieren, die speziell darauf ausgelegt sind, die alternativen Spleißen von Zielgen zu modulieren. Das Protokoll enthält, wie ein maßgeschneidertes PUF Gerüst für ein bestimmtes RNA-Ziel zu entwerfen und zu konstruieren, wie ein ESF-Expressionsplasmid zu konstruieren, von einer Designer PUF Domäne Verschmelzen und eine Effektor-Domäne, und wie ESFs verwenden, um das Spleißen von Zielgen zu manipulieren. In den repräsentativen Ergebnissen dieser Methode haben wir beschrieben auch die gemeinsamen Testsdie ESF-Aktivitäten unter Verwendung von Splicing-Reportern, die Anwendung des ESF in kultivierten menschlichen Zellen und die anschließende Wirkung von Spleißen Änderungen. Indem Sie die detaillierten Protokolle in diesem Bericht ist es möglich, ESFs für die Regulierung der verschiedenen Arten von Alternative Splicing (AS) zu entwerfen und zu erzeugen, eine neue Strategie Bereitstellung Splicing Regulierung und die Funktion der unterschiedlichen Splicing-Isoformen zu untersuchen. Darüber hinaus kann durch verschiedene funktionelle Domänen mit einer projektierten PUF Domäne Verschmelzen können die Forscher künstliche Faktoren entwickeln, die spezifischen RNAs Ziel verschiedene Schritte von RNA-Prozessierung zu manipulieren.

Dieser Bericht beschreibt das vollständige Protokoll für die Gestaltung und den Bau von ESFs und Spleißreportern. Es skizziert auch die weitere Anwendung von ESFs bei der Manipulation der AS von endogenen Genen 16 . Um typische Ergebnisse von ESF-vermittelten Spleißänderungen zu veranschaulichen, verwenden wir die Daten aus unserer bisherigen Arbeit als Beispiel. Die ESFs mit unterschiedlichen Funktionsdomänen können verwendet werden, um die Einbeziehung des Zielk...

Dieser Bericht beschreibt ein Bioengineering Verfahren zu entwerfen und neuartige Künstliches Spleißfaktoren (ASFs) zu konstruieren, die das Spleißen von Zielgenen in Säugetierzellen spezifisch modulieren. Dieses Verfahren kann weiter ausgebaut werden, um verschiedene künstliche Faktoren zu konstruieren, andere Aspekte des RNA-Metabolismus zu manipulieren.

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, künstliche Spleißfaktoren zu entwickeln, die das alternative Spleißen eines bestimmten Ziels spezifisch manipulieren können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Prozessierung zu beantworten, wie z.B. die Regulation und die Fehlregulation des alternativen Spleißens in Krebszellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Flexibilität.Wir können künstliche Faktoren entwickeln, die verschiedene Arten von alternativem Spleißen in einem bestimmten Gen entweder fördern oder hemmen. Dieses Verfahren wird von Huan-Huan, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter meines Labors, und Qianyun, einem Postdoc in meinem Labor, demonstriert. Wildtyp-PUF-DNA wird als Vorlage für die Generierung des angepassten PUF-Domänengerüsts verwendet.Verwenden Sie PCR-Primer mit PUF-Sequenzen, die spezifisch unterschiedliche RNA-Nukleotide in jeder Position erkennen. Verwenden Sie für jede PUF-Wiederholung vier verschiedene Primer, um an jeder Position eine andere Basis zu erkennen. In der ersten PCR-Runde verwenden Sie die gezeigten Primerpaare, um kodierende Sequenzen für vier PUF-Wiederholungen, universelle Brückenfragmente und Kapp

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Genetics

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Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

Alternative Spleißen (AS) und alternative Polyadenylierung (APA) erweitern die Vielfalt der Transkriptisoformen und ihrer Produkte. Hier beschreiben wir bioinformatische Protokolle zur Analyse von Bulk-RNA-seq und 3'-Endsequenzierungsassays, um AS und APA zu erkennen und zu visualisieren, die unter experimentellen Bedingungen variieren.

Identifizierung von alternativem Spleißen und Polyadenylierung in RNA-seq-Daten

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

Neue Strategien zur getreuen Modellierung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sind notwendig, um die hämatopoetische Stammzellbiologie und hämatologische Malignome besser zu untersuchen. Hier wird ein Protokoll zur Modellierung heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in HSPCs durch Kombination der Verwendung von CRISPR/Cas9 und dualer rAAV-Donortransduktion beschrieben.

Entwicklung onkogener heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Erfahren Sie die Bioengineering-Methode zur Entwicklung künstlicher Spleißfaktoren für die spezifische Manipulation alternativen Spleißens in menschlichen Zellen. Diese flexible Technik ermöglicht die gezielte Regulation von RNA-Prozessierung.

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

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