Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, künstliche Spleißfaktoren zu entwickeln, die das alternative Spleißen eines bestimmten Ziels spezifisch manipulieren können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Prozessierung zu beantworten, wie z.B. die Regulation und die Fehlregulation des alternativen Spleißens in Krebszellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Flexibilität.

Wir können künstliche Faktoren entwickeln, die verschiedene Arten von alternativem Spleißen in einem bestimmten Gen entweder fördern oder hemmen. Dieses Verfahren wird von Huan-Huan, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter meines Labors, und Qianyun, einem Postdoc in meinem Labor, demonstriert. Wildtyp-PUF-DNA wird als Vorlage für die Generierung des angepassten PUF-Domänengerüsts verwendet.

Verwenden Sie PCR-Primer mit PUF-Sequenzen, die spezifisch unterschiedliche RNA-Nukleotide in jeder Position erkennen. Verwenden Sie für jede PUF-Wiederholung vier verschiedene Primer, um an jeder Position eine andere Basis zu erkennen. In der ersten PCR-Runde verwenden Sie die gezeigten Primerpaare, um kodierende Sequenzen für vier PUF-Wiederholungen, universelle Brückenfragmente und Kappenfragmente zu generieren.

Verwenden Sie in Runde zwei die im letzten Schritt generierten PCR-Produkte als Templates mit den gezeigten Primerkombinationen, um kodierende Sequenzen für die RNA-Erkennungscodes R-eins bis R-vier und R-fünf bis R-acht zu generieren. Verwenden Sie in Runde drei die Produkte aus Runde zwei und Bridge vier bis fünf als Vorlagen mit dem R-one Forward Primer und dem R-Eight Reverse Primer, um Codierungssequenzen für R-one bis R-eight ohne Kappen zu generieren. Verwenden Sie in der PCR der vierten Runde R-one bis R-acht, die Endkappe mit fünf Primzahlen und die Endkappe mit drei Primzahlen als Vorlagen, um Codierungssequenzen für vollständige PUF-Domänen zu generieren.

Um mit der Transfektion von HEK-293T-Zellen zu beginnen, mischen Sie das liposomale Transfektionsreagenz, indem Sie die Flaschen vorsichtig umdrehen. Verdünnen Sie dann zwei Mikroliter liposomales Transfektionsreagenz in 50 Mikrolitern reduziertem Serummedium pro Transfektion. Vorsichtig mischen und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Als nächstes verdünnen Sie 04 Mikrogramm des glycinreichen Domänenexpressionsvektors und 0,2 Mikrogramm des modularen Spleißreporterplasmids in 50 Mikrolitern reduziertem Serummedium in einem sterilen Röhrchen. Verdünnen Sie dann 0,4 Mikrogramm des Expressionsvektors der RS-Effektordomäne und 0,2 Mikrogramm des PGZ-3-Reporterplasmids in 50 Mikrolitern reduziertem Serummedium. Zum Schluss verdünnen Sie 0,4 Mikrogramm PGL-RS-PUF-Expressionsvektor und 0,2 Mikrogramm PEZ-1B- oder PEZ-2F-Reporterplasmide in 50 Mikrolitern reduziertem Serummedium in einem sterilen Röhrchen.

Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird das verdünnte liposomale Transfektionsreagenz vorsichtig mit den verdünnten Plasmidmischungen vermischt. Die fertigen Mischungen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie dann die Transfektionsmischungen, die die Expressionsvektoren enthalten, in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit HEK-293-Zellen besiedelt ist, und inkubieren Sie mindestens 12 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nach 12 Stunden Inkubation werden die transfizierten Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugation geerntet. Nach der Zentrifugation das Medium verwerfen und 0,5 Milliliter RNA-Extraktionspuffer pro Röhrchen hinzufügen. Geben Sie 0,1 Milliliter Chloroform pro 0,5 Milliliter RNA-Extraktionspuffer zu jeder Probe.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann die wässrige Basis in eine frische Tube. Fügen Sie 0,25 Milliliter Isopropanol pro 0,5 Milliliter RNA-Extraktionspuffer hinzu, der bei der ersten Homogenisierung verwendet wurde.

Durch Vortexen mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach einer Zentrifugation wie zuvor ist der RNA-Niederschlag in der Regel am Boden des Röhrchens sichtbar. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet mit 0,5 Millilitern 75%igem Ethanol pro 0,5 Milliliter RNA-Extraktionspuffer.

Kräftig vortexen und dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 7.500 G zentrifugieren. Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand und trocknen Sie die RNA-Kügelchen an der Luft. Löse die RNAs in 50 Mikrolitern RNase-freiem Wasser auf.

Fügen Sie als Nächstes zwei Mikroliter à fünf Einheiten pro Mikroliter DNase-one, sieben Mikroliter 10X Puffer und 11 Mikroliter Wasser zu jeder 50-Mikroliter-RNA-Lösung hinzu. Erhitzen Sie die Lösungen nach der Inkubation 15 Minuten lang auf 70 Grad Celsius, um die DNase zu inaktivieren. Nachdem Sie eine reverse Transkriptase-Reaktion durchgeführt haben, um cDNA aus jeder Probe zu synthetisieren, fügen Sie die Komponenten der körpermarkierten PCR-Reaktion in der auf dem Bildschirm gezeigten Reihenfolge in die PCR-Röhrchen hinzu.

Bereiten Sie eine Reaktion pro Probe vor. Führen Sie das RT-PCR-Programm auf dem Thermocycler aus. Zum Schluss lösen Sie die PCR-Produkte durch Elektrophorese durch ein 10%iges Polyacrylamid-Gel mit FSME-Puffer auf.

Verwenden Sie einen Fluoreszenzscanner, um die Produkte zu visualisieren, und messen Sie die Menge jeder gespleißten Isoform mit Hilfe einer Densitometrie-Software. Für den Immunfluoreszenz-Assay zur Messung der Apoptose bereiten Sie eine Transfektionsmischung her, die Glycin-reiche Domänenexpressionsplasmide enthält, wie zuvor gezeigt, und transfizieren Sie HeLa-Zellen, die auf Polylysin-beschichteten Glasabdeckfolien gezüchtet wurden, in einer Sechs-Well-Platte. 24 Stunden nach der Transfektion die Zellen auf den Deckgläsern mit einem Milliliter 4%Paraformaldehyd in 1x PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur fixieren.

Waschen Sie dann die Zellen auf den Deckgläsern vorsichtig mit zwei Millilitern 1x PBS für fünf Minuten. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,2% Triton X-100 in 1x PBS für 10 Minuten. Nach dreimaligem Waschen mit 1x PBS wie zuvor die unspezifische Bindung mit 3%Rinderserumalbumin in 1x PBS für 10 Minuten blockieren.

Verdünnen Sie den Flaggenantikörper um eins bis 1.000 in 3 % BSA in PBS und pipettieren Sie 30 Mikroliter des verdünnten Flaggenantikörpers auf ein Parafilmblatt. Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Deckglas zu entfernen. Trocknen Sie überschüssigen Puffer vorsichtig mit Labortüchern ab und legen Sie dann den Deckglas mit der Zellseite nach unten auf die Anti-Flag-Lösung.

Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation geben Sie ca. 500 Mikroliter 1x PBS auf die Zellseite des Deckglases, bis es auf der Lösung schwimmt. Setzen Sie es wieder auf die Sechs-Well-Platte mit 1x PBS in den Wells ein.

Inkubieren Sie wie zuvor 15 Minuten lang mit einem Sekundärantikörper auf Parafilm. Waschen Sie die Deckgläser wie zuvor und montieren Sie sie dann mit einem DAPI-haltigen Eindeckmedium auf Objektträger. Visualisieren Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop und fotografieren Sie sie mit einer Digitalkamera.

Mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie wiesen viele Zellen, die Gly-PUF-531 exprimierten, eine fragmentierte Kern-DNA auf, was darauf hindeutet, dass sie sich in einer Apoptose befanden. Als Kontrolle hatten Zellen, die den Gly-PUF-Wildtyp exprimierten, im Vergleich zu Gly-PUF-531-transfizierten Zellen weniger fragmentierte Kern-DNA. Hier zeigt die Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem Anti-Flag-Antikörper, der mit DAPI-gefärbten Zellen fusioniert wurde, dass das Gly-PUF-531 überwiegend in den Zellkernen transfizierter Zellen lokalisiert ist.

Gly-PUF-Wildtyp, der auch in den Zellkernen transfizierter Zellen lokalisiert ist, was darauf hindeutet, dass diese ESFs von ihren Zielen dissoziieren, wenn die vollständig gespleißten mRNAs in das Zytoplasma transportiert werden. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen mit fragmentierter Kern-DNA wurde aus zufällig ausgewählten Feldern von Fluoreszenzmikroskopie-Bildern gemessen. Einmal gemeistert, kann der Bau von PUF-Gerüsten mit RNA-Bindungsspezifität in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn er richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man alternatives Spleißen in menschlichen Zellen durch die Entwicklung künstlicher Faktoren spezifisch manipulieren kann.