Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Das übergeordnete Ziel dieser CD14-Magnetkügelchen-Trenntechnik ist es, Monozyten aus dem Blut zu isolieren, um sie in vitro weiter in dendritische Zellen oder Makrophagen zu differenzieren. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen der Immunologie zur Erkennung, Verarbeitung und Präsentation von Krankheitserregern oder Antigenen durch dendritische Zellen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Isolierungsverfahrens besteht darin, dass die 98 bis 99%ige reine Monozytenpopulation gewonnen werden kann.

Verfahren wird von Karolin Thurnes, einer Technikerin aus unserer Arbeitsgruppe, vorgeführt. Beginnen Sie damit, das Volumen der Blutpackung auf sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen entsprechend der erhaltenen Blutmenge aufzuteilen. Das Endvolumen in jedem Röhrchen wird bei Bedarf mit sterilem Dulbecco's PBS auf 50 Milliliter eingestellt und die Proben zentrifugiert.

Entfernen Sie mit einer sterilen serologischen Ein-Milliliter-Pipette, die an eine Laborvakuumpumpe angeschlossen ist, die Plasma- und Thrombozytenschichten, wobei die Grenzschichten ungestört bleiben. Verwenden Sie dann eine neue 25-Milliliter-Pipette, um die mononukleären Zellgrenzschichten von zwei der Röhrchen in dem neuen sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen zu kombinieren. Geben Sie dann 15 Milliliter Dichtegradientenmedium in jedes konische 450-Milliliter-Röhrchen und pipettieren Sie langsam und vorsichtig, indem Sie 25 Milliliter gepoolte Blutzellen auf den Dichtegradienten in jedem Röhrchen aufschlagen.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Anschließend werden die oberen Schichten des Plasmas und der Thrombozyten aspiriert und die PBMC-Interphasen in neue einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die PBMCs zweimal mit bis zu 50 Millilitern sterilem DPBS, ziehen Sie die Zellen nach der ersten Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet nach der zweiten Zentrifugation in 50 Millilitern frischem DPBS.

Nach der Zählung werden die Zellen durch Zentrifugation zur Isolierung von Monozyten-Magnetpartikeln entnommen. Um die Monozyten durch Magnetpulverisolierung zu reinigen, stellen Sie die PBMC-Konzentration auf achtmal 10 bis 7 Zellen pro Milliliter Isolationspuffer ein. Als nächstes werden die Anti-Human-CD14-Magnetpartikel gründlich vortex und 50 Mikroliter Partikel für jedes Mal 10 bis zum 7. PBMC in die Zellen gemischt und die Zellbead-Lösung in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gesamtvolumen auf 12 Milliliter Isolationspuffer eingestellt und zwei Milliliter der Zellpartikelsuspension in jedes der sechs sterilen Röhrchen mit rundem Boden überführt. Legen Sie die Röhrchen sofort für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf den Zelltrennmagneten. Entfernen Sie dann den Überstand mit den Lymphozyten des peripheren Blutes aus jedem Röhrchen.

Nehmen Sie die Röhrchen vom Magneten und geben Sie zwei Milliliter frischen Isolationspuffer zu jeder Zellprobe. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen und Partikel wieder zu suspendieren, und setzen Sie die Röhrchen für weitere fünf Minuten wieder in den Magneten ein. Entfernen Sie am Ende der Inkubation den Überstand wieder und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern frischem Isolationspuffer, wie gerade gezeigt.

Ziehen Sie dann die CD14-positiven Monozyten, die Zellfraktionen enthalten, in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und bringen Sie das endgültige Volumen des Röhrchens auf 50 Milliliter in sterilem DPBS. Um die gereinigten Monozyten in dendritische Zellen zu differenzieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugaiton und resuspendieren Sie das Pellet in 50 Millilitern DPBS. Nach dem Zählen schleudern Sie die Zellen wieder herunter und resuspendieren das Pellet in einer Konzentration von einmalig 10 auf die 6. Zellen pro Milliliter und vorgewärmtes Kulturmedium.

Übertragen Sie drei Milliliter Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen und fügen Sie rekombinantes humanes Interleukin, vier und GMCSF zu jeder Vertiefung hinzu, um eine 48-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu gewährleisten. Am zweiten Tag der Kultur stimulieren Sie die Zellen erneut mit frischen Zytokinen und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Ziehen Sie am fünften Tag die Überstände und pipettieren Sie frisches Medium mehrmals vorsichtig in die Vertiefungen, um die unreifen dendritischen Zellen zu ernten.

Nach der Trennung durch Dichtegradient besteht eine typische PBMC-Fraktion aus etwa 4 % B-Lymphozyten, 28 % Monozyten und 68 % anderen Zellen, von denen 44 % T-Lymphozyten sind. Nach der Magnetpartikeltrennung zeigt die durchflusszytometrische Analyse der negativen Fraktion einen ähnlichen Prozentsatz an b-Lymphozyten, einen höheren Prozentsatz der anderen Zellpopulationen und einen stark reduzierten Prozentsatz an Monozyten.

Die Charakterisierung der positiven Fraktion zeigt die hohe Reinigungseffizienz, da über 99% der Zellen CD14 exprimieren. Nach fünftägiger Interleukin-4- und GMCSF-Simulation differenzieren sich die CD14-positiven Zellen in unreife CD83-negative DC-SIGN-positive Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen, die in der Morphologie, dem Verhalten und der Rezeptorexpression mit dermalen dendritischen Zellen vergleichbar sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis fünf Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Monozyten aus Vollblut isoliert und in dendritische Zellen unterscheidet. Diese Technik ist für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie sehr wichtig, um nicht nur die Funktion der dendritischen Zellen, sondern auch die Funktion von Monozyten und Makrophagen im primären menschlichen In-vitro-Zellsystem zu untersuchen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie mikroskopische Analysen, Durchflusszytometrie, Infektions- oder Antigenpräsentationsaufsätze durchgeführt werden, um Fragen zur Biologie, Funktion und Wechselwirkung mit Antigenen zu beantworten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut gefährlich sein kann und dass vor Beginn dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, ein Laborkittel oder eine Hepatitis-Impfung getroffen werden sollten.