Name: Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Monozyten aus menschlichem Vollblut mittels magnetischer CD14-Beads zur Differenzierung in dendritische Zellen. Diese Methode erreicht 98-99% Reinheit und ermöglicht immunologische In-vitro-Studien.

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Wir danken unserer Technikerin Karolin Thurnes, Abteilung für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie, sowie Dr. Annelies Mühlbacher und Dr. Paul Hörtnagl, Zentralinstitut für Bluttransfusion und Immunologische Abteilung, für ihre wertvolle Hilfe und Unterstützung bezüglich dieses Manuskripts. Wir danken dem österreichischen Wissenschaftsfonds für die Unterstützung dieser Arbeit (P24598 an DW, P25389 an WP).

Ethik-Anweisung: schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen teilnehmenden Blutspender vom Zentralinstitut für Bluttransfusion und Immunologische Abteilung, Innsbruck, Österreich erhalten. Die Verwendung von anonymisierten übrig gebliebenen Proben für wissenschaftliche Zwecke wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Innsbruck genehmigt. 1. Anreicherung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) <ol><li> Konzentration von PBMCs durch Zentrifugation. <ol><li> Öffnen Sie die Blutpackung und Split-Blut in sterilen 50 ml Zentrifugenröhrchen nach der Menge des Blutes empfangen. </li><li> Falls erforderlich, stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml für jedes Röhrchen mit sterilem Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (D-PBS). </li><li> Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 15 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Bremse. </li><li> Zeichnen Sie die obere Schicht mit Plasma und Blutplättchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette ab, so dass die boundary Schicht ungestört. HINWEIS: Wenn autologem Plasma anstelle von FCS verwendet, wird das Kulturmedium zu ergänzen, muss das Plasma in diesem Schritt aufgefangen und hitzeinaktiviertem werden. </li><li> Sammeln Sie die mononuklearen Zellen (Grenzschichten) aus zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen und übertragen sie in eine sterile 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette. </li><li> Stellen Sie das Volumen auf 50 ml für jedes Rohr mit sterilen D-PBS. </li><li> Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 15 min bei RT ohne Bremse. </li><li> Zeichnen Sie die obere Schicht, die das Plasma ausgeschaltet und Blutplättchen eine sterile 10 ml serologische Pipette, so dass die Grenzschicht ungestört. </li><li> Sammeln Sie die mononuklearen Zellen (Grenzschichten) aus den 50 ml Zentrifugenröhrchen und übertragen sie in zwei sterile 50 ml Sammelröhrchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette. </li><li> Stellen Sie das Volumen auf 50 ml für jedes Röhrchen mit sterilem D-PBS. </li></ol></li><li> Trennungvon PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 1). <ol><li> Bereiten Sie vier 50-ml-Röhrchen und Pipette 15 ml Dichtegradientenmedium in jedes Röhrchen. </li><li> 25 ml gepoolt Zellen / Blut aus dem Sammelrohr (Schritt 1.1.10) und sorgfältig die Dichtegradientenmedium überlagern. </li><li> Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 700 xg für 30 min bei RT ohne Bremse. </li></ol></li><li> Sammlung und Reinigung von PBMCs. <ol><li> Zeichnen Sie die obere Schicht, die das Plasma ausgeschaltet und Blutplättchen eine sterile 10 ml serologische Pipette, so dass die PBMC Schicht ungestört. </li><li> Sammeln Sie die PBMC Interphase aus allen Rohren und bündeln die Zellen in zwei sterile 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen 25 ml serologische Pipette. </li><li> Stellen Sie das Volumen auf 50 ml für jedes Röhrchen mit sterilem D-PBS. Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 15 min bei 4 ° C mit der Bremse. </li><li> Den Überstand aspirieren und resuspendieren dieZellen in sterile D-PBS. Pool der Zellen aus den beiden Rohren und stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit sterilem D-PBS. </li><li> Die Röhrchen in die Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C mit Bremse. </li><li> Den Überstand aspirieren und resuspendieren die Zellen in sterilen D-PBS. Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit sterilem D-PBS und Pipette 50 ul in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 450 &amp; mgr; l D-PBS. </li><li> Vortex die 1,5-ml-Röhrchen kräftig und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer oder einem anderen Zellzählung Instrument. </li><li> Platzieren Sie die 50-ml-Röhrchen in die Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C mit Bremse. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung von Monozyten durch Anti-human CD14 magnetische Partikel <ol><li> Kennzeichnung von PBMCs mit magnetischen Partikeln. <ol><li> Stellen Sie die PBMC - Konzentration auf 8 x 10 7 Zellen / ml Isolationspuffer verwendet wird . </li><li> Vortex die anti-human CD14 magnetischen Teilchen thoroughly und je 1 x 10 7 PBMCs für 50 ul Partikel hinzufügen. </li><li> Mischen der Zellpartikel-Suspension gründlich und Inkubation es bei RT für 30 min. </li></ol></li><li> Trennung der positiven und negativen Fraktionen. <ol><li> Stellen Sie die Lautstärke bis zu 12 ml mit Isolationspuffer. </li><li> Bereiten Sie sechs sterile Rundboden Röhrchen und Pipette 2 ml der Zell-Partikel-Suspension in jedes Röhrchen. </li><li> Unmittelbar danach ist die Rohre auf dem Magneten. Inkubieren sie für 10 min bei RT. </li><li> Halten Sie die Rohre auf dem Magneten und den Überstand vorsichtig abziehen. Der Überstand enthält die negative Fraktion. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch aus dem Magneten und 2 ml Isolationspuffer. </li><li> die Zellen durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig resuspendieren. </li><li> Die Röhrchen wieder auf den Magneten. Inkubieren für 5 min bei RT. </li><li> Halten Sie die Rohre auf dem Magneten und den Überstand vorsichtig abziehen. Der Überstand enthält die negative Fraktion. </li><li>Entfernen Sie die Schläuche aus dem Magneten und 2 ml Isolationspuffer in jedes Röhrchen. die Zellen durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig resuspendieren. </li><li> Übertragen Sie die positive Fraktion in ein steriles 50-ml-Tube und stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml unter Verwendung von sterilen D-PBS. </li></ol></li></ol> 3. Stimulation von isolierten Monozyten mit IL-4 und GM-CSF <ol><li> Das Röhrchen wird in die Zentrifuge und drehen Sie es bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C mit Bremse. </li><li> Den Überstand aspirieren und wieder die Zellen in 50 ml D-PBS. </li><li> Je 50 ul in ein 1,5 ml Röhrchen mit 450 &amp; mgr; l D-PBS. Vortex die 1,5-ml-Röhrchen kräftig und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer oder eine andere Zelle Zählgerät. </li><li> Legen Sie die 50-ml-Röhrchen in die Zentrifuge und drehen Sie es bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C mit Bremse. HINWEIS: Wenn die negative Fraktion, peripheren Blut-Lymphozyten (PBL) enthält, auch erforderlich ist, führen Sie das Waschen und Zählen Schritte ähnlich zu tSchlauch der positiven Fraktion (Schritte 3,1-3,5). </li><li> Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 10 6 / ml mit vorgewärmten Kulturmedium (RPMI 1640 Medium , ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und 1% L-Glutamin - Lösung) und Pipette 3 ml / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen. HINWEIS: Wenn hitzeinaktiviertem autologem Plasma verwendet, ersetzen Sie die 10% FCS mit 1-5% autologem Plasma, nach dem Versuchsaufbau. </li><li> Stimulierung der Monozyten mit rekombinantem humanem IL-4 (250 U / ml) und rekombinantem Human-GM-CSF (1000 U / ml) pipettiert, die Cytokine direkt in das Kulturmedium. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Re-Stimulierung der Zellen mit IL-4 (250 U / ml) und GM-CSF (1000 U / ml) nach 48 h durch das Pipettieren Cytokine direkt in das Kulturmedium. HINWEIS: Wenn es irgendwelche Anzeichen für eine Versauerung durch den pH-Indikator in dem Medium gezeigt sind, mit vorgewärmten Kulturmedium die Hälfte des Mediums ersetzen. </li><li> Ernte unreifen dendritischen Zellen am Tag 5 füraus der 6-Well-Platte down-stream-Experimente durch die kultivierten Zellen pipettiert und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen nach dem Pipettieren des Kulturmediums nach oben und unten ein paar Mal. </li><li> Zählen Sie die Zellen und färben eine Probe von isolierten Monozyten mit anti-human Antikörper gegen CD11b, CD11c und DC-SIGN / CD209, zusammen mit einem Zellebensfähigkeit Farbstoff. Zur Vermeidung von unspezifischer Bindung der Antikörper bei der Oberflächenfärbung, die Verwendung von Fc-Rezeptor-Reagenzien oder Rinderserumalbumin (BSA) Puffer blockiert wird dringend empfohlen. </li><li> Analyse der Probe, die die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Farbstoff, entsprechend dem Protokoll des Herstellers durch Zytometrie Durchführung fließen, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der erzeugten iDCs zu beurteilen. </li></ol>

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<li>Banki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+as+an+endogenous+adjuvant+for+dendritic+cell-mediated+induction+of+retrovirus-specific+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).</li>
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<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-Opsonized+HIV-1+Overcomes+Restriction+in+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+T-Helper+17+Polarization+Upon+Triggering+CD11b%2Fc+on+HIV-Exposed+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells.</a> J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).</li>
<li>Grassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+have+a+phenotype+comparable+to+that+of+dermal+dendritic+cells+and+display+ultrastructural+granules+distinct+from+Birbeck+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules.</a> J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) durch die Isolierung von humanen Monozyten aus antikoaguliertem Blut eines magnetischen Nanopartikel-basierten Assay. In diesem Protokoll werden die Zentrifugationsschritte stromaufwärts der Zellisolierungsverfahren durchgeführt, was zu einer Anreicherung der PBMC-Fraktion führt. Obwohl Zellen während der Zentrifugation verloren gehen würde, den Inhalt eines Vollblut-Packung auf Dichtegradienten-Medium zu überlagern 200-300...

Dendritische Zellen (DCs) sind die wichtigsten spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems. Unreifen DCs (iDC) befinden sich in der Haut oder in Schleimhautgewebe und sind daher unter den ersten Immunzellen mit eindringenden Pathogenen zu interagieren. DCs stellen die Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem 1, da sie T- und B-Zell - Antworten folgende Erregernachweis aktivieren kann. Außerdem tragen sie zur proinflammatorische Immunantworten aufgrund der Sekretion von hohen Mengen von Cytokinen, wie IL-1β, IL-6 und IL-12. DCs aktivieren auch NK-Zellen und ziehen andere Immunzellen an den Ort der Infektion durch Chemotaxis. DCs können in unreife dendritische Zellen (iDC) und reifen dendritischen Zellen (mDCs) 2 auf der Grundlage ihrer Morphologie und Funktion aufgeteilt werden. Nach der Erkennung von fremden Antigenen durch eine der vielen Mustererkennung Rezeptoren (zB Toll-like - Rezeptoren, C-TypLektine, Rezeptoren oder Komplement) reichlich auf der Zelloberfläche exprimiert, durchlaufen iDCs große Veränderungen und beginnen zu reifen. Während dieser Reifungsprozess, Rezeptoren für Antigen - Capture werden herunterreguliert, während wesentliche Moleküle für die Antigenpräsentation sind drei hochreguliert. Reifen DCs hochregulieren die Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexen I und II (MHC I und II), co-stimulatorische Moleküle, wie CD80 und CD86, die für die Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Lymphozyten wichtig sind. Zusätzlich ist die Expression des Chemokinrezeptors CCR7 auf der Zelloberfläche induziert, die die Migration von DCs aus peripheren Geweben in die Lymphknoten ermöglicht. Die Migration wird durch die &quot;Rollen&quot; von DCs entlang eines Chemokinligand 19 (CCL19 / MIP-3b) und Chemokinligand 21 (CCL21 / SLC) Gradienten in die Lymphknoten 4-6 erleichtert. Nach der Migration präsentieren mDCs das verarbeitete Antigen CD4 + und CD8 + T - Zellen zu naiv, so initiating eine adaptive Immunantwort gegen das eindringende Pathogen 7. Diese Interaktion mit T - Zellen in den Lymphknoten ist auch mit der Ausbreitung des Virus 8 verbunden. Andere In - vitro - Studien zeigten , dass DCs effizient erfassen und übertragen HIV T - Zellen und dass diese Übertragung führt zu einer kräftigen Infektion 12.09. Diese Experimente unterstreichen , dass in vivo HIV - Exploits DCs als Shuttles von der Peripherie zu den Lymphknoten. Während der Antigenpräsentation, sekretieren DCs Schlüssel Interleukine, die die Differenzierung von Effektor-T-Helferzellen die Form und somit die Ergebnisse der gesamten Immunantwort gegen die Mikrobe in diesem sehr Wechselwirkung bestimmt. Abgesehen von Typ 1 (Th1) und Typ 2 (Th2) Effektor - T - Zellen, andere Untergruppen von CD4 + T - Helferzellen (zB Typ 17 (Th17) und Typ 22 (Th22) T - Zellen) beschrieben wurden, und deren Induktion und Funktion wurden eingehend untersucht. DCs sind außerdem beteiligtdie Erzeugung von regulatorischen T - Zellen (Treg) 13,14. Diese Zellen sind Immunsuppressiva und stoppen kann oder herunterregulieren Induktion oder Proliferation von Effektor-T-Zellen und sind somit entscheidend für die Immunität und Toleranz zu entwickeln. Menschliche herkömmlichen DCs (cDCs) umfassen mehrere Untergruppen von Zellen mit einer myeloischen Ursprungs (dh Langerhans&#39;schen Zellen (LKS) und dermale und interstitielle DCs) oder lymphatischen Ursprungs (dh plasmazytoiden DCs (pDCs)). Für In - vitro - Experimente oder DC Impfstrategien, Monozyten abgeleiteten DCs sind als Modell für die dermale DCs routinemäßig eingesetzt. Diese Zellen zeigen Ähnlichkeiten in der Physiologie, Morphologie und Funktion zu herkömmlichen myeloischen dendritischen Zellen. Sie werden durch die Zugabe von Interleukin 4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen - Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) an Monozyten isoliert von gesunden Spendern 12,15-18 erzeugt. Dendritische Zellen können auch aus dermalen oder Schleimhaut-Biopsien direkt isoliert werden oder können sogar be von CD34 + hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut erhaltenen Proben ex utero isoliert entwickelt. Hier zeigen wir, wie Monozyten isoliert und stimuliert von antikoaguliertem menschlichem Blut nach Pbmc (PBMC) Anreicherung durch Dichtegradientenzentrifugation. Nach einer Inkubation für 5 Tage, sind menschliche Monozyten unter spezifischen Bedingungen in iDCs differenziert und sind bereit für die experimentellen Verfahren in einem nicht-klinischen Umfeld.

<table><tbody><tr><td>APC Maus Anti-Human CD19 Klon HIB19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human CD83 Klon HB15e</td><td>BD Biosciences</td><td>551073</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag Anti-Human CD14 Magnetpartikel</td><td>BD Biosciences</td><td>557769</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumin Fraction V)</td><td>Carl Roth</td><td>EG-Nr 2923225</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-Well-Clear-TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten</td><td>Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradienten-Medien: Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10&nbsp; ml Serologische Pipette</td><td>Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25&nbsp; ml Serologische Pipette</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; ml High Clarity PP Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human CD3 Klon HIT3a</td><td>BD Biosciences</td><td>555339</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510 (Reagenz für die Zellviabilität)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-862</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FBS (Fötales Rinderserum), EU-zugelassene Herkunft (Südamerika)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 CC</td><td>PromoKine</td><td>C-61401</td><td></td></tr><tr><td>Isolationspuffer: BD IMag Puffer (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 ml, SuperSpin</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Human CD14 Klon M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td></td></tr><tr><td>PE Maus Anti-Human CD209 Klon DCN46</td><td>BD Biosciences</td><td>551265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von menschlichen monozyten abgeleiteten dendritischen zellen aus vollblut

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritische Zellen (DCs) erkennen fremde Strukturen verschiedener Krankheitserreger, wie Viren, Bakterien und Pilze, über eine Vielzahl von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), die auf ihrer Zelloberfläche exprimiert werden, und aktivieren und regulieren dadurch die Immunität. 
Die Hauptfunktion von DCs ist die Induktion adaptiver Immunität in den Lymphknoten, indem Antigene über MHC I- und MHC II-Moleküle naiven T-Lymphozyten präsentiert werden. Daher müssen DCs nach der Erkennung von Krankheitserregern an den Infektionsherden von der Peripherie in die Lymphknoten wandern. Für In-vitro-Experimente oder DC-Impfstrategien werden routinemäßig von Monozyten abgeleitete DCs verwendet. Diese Zellen weisen Ähnlichkeiten in Physiologie, Morphologie und Funktion mit herkömmlichen myeloischen dendritischen Zellen auf. Sie werden durch Stimulation von Monozyten, die von gesunden Spendern isoliert wurden, durch Interleukin 4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) erzeugt. Hier zeigen wir, wie Monozyten aus antikoaguliertem menschlichem Blut nach Anreicherung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und stimuliert werden. Humane Monozyten werden in unreife DCs differenziert und sind nach 5-tägiger Inkubation für experimentelle Verfahren in einer nicht-klinischen Umgebung bereit.

Nach der Zentrifugation von antikoaguliertem Blut ein Sucrosekissen, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung von in einem Interphase auf dem Dichtegradienten-Medium (Abbildung 1) angereichert. Nachdem die PBMCs abgezogen werden, wird FACS - Analyse durchgeführt , um die verschiedenen Zellpopulationen innerhalb der PBMCs zu charakterisieren mit Lineage Marker (zB CD3 für T - Lymphozyten, CD14 für Monozyten und CD19 für B - Lymphozyten). <stro...

Hier zeigen wir, wie Monozyten durch magnetische Kügelchentrennung aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach Dichtegradientenzentrifugation von humanem antikoaguliertem Blut isoliert werden. Nach einer 5-tägigen Inkubation werden die menschlichen Monozyten in unreife dendritische Zellen differenziert und sind bereit für experimentelle Verfahren in einer nicht-klinischen Umgebung.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Das übergeordnete Ziel dieser CD14-Magnetkügelchen-Trenntechnik ist es, Monozyten aus dem Blut zu isolieren, um sie in vitro weiter in dendritische Zellen oder Makrophagen zu differenzieren. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen der Immunologie zur Erkennung, Verarbeitung und Präsentation von Krankheitserregern oder Antigenen durch dendritische Zellen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Isolierungsverfahrens besteht darin, dass die 98 bis 99%ige reine Monozytenpopulation gewonnen werden kann.Das Verfahren wird von Karolin Thurnes, einer Technikerin aus unserer Arbeitsgruppe, vorgeführt. Beginnen Sie damit, das Volumen der Blutpackung auf sterile 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen entsprechend der erhaltenen Blutmenge aufzuteilen. Das Endvolumen in jedem Röhrchen wird bei Bedarf mit sterilem Dulbecco's PBS auf 50 Milliliter eingestellt und die Proben zentrifugiert.Entfernen Sie mit einer sterilen serologischen Ein-Milliliter-Pipette, die an eine Laborvakuumpumpe angeschlossen ist, die Plasma- und Thrombozytenschichten, wobei die Grenzschichten ungestört bleiben. Verwenden Sie dann eine neue 25-Milliliter-Pipette, um die mononukleären Zellgrenzschichten von zwei der Röhrchen in dem neuen sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen zu kombinieren. Geben Sie dann 15 Milliliter Dichtegradientenmedium in jedes konische 450-Milliliter-Röhrchen und pipettieren Sie langsam und vorsichtig, indem Sie 25 Milliliter gepoolte Blutzellen auf den Dichtegradienten in jedem Röhrchen aufschlagen.Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Anschließend werden die oberen Schichten des Plasmas und der Thrombozyten aspiriert und die PBMC-Interphasen in neue einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die PBMCs zweimal mit bis zu 50 Millilitern sterilem DPBS, ziehen Sie die Zellen nach der ersten Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet nach der zweiten Zentrifugation in 50 Millilitern frischem DPBS.Nach der Zählung werden die Zellen durch Zentrifugation zur Isolierung von Monozyten-Magnetpartikeln entnommen. Um die Monozyten durch Magnetpulverisolierung zu reinigen, stellen Sie die PBMC-Konzentration auf achtmal 10 bis 7 Zellen pro Milliliter Isolationspuffer ein. Als nächstes werden die Anti-Human-CD14-Magnetpartikel gründlich vortex und 50 Mikroliter Partikel für jedes Mal 10 bis zum 7. PBMC in die Zellen gemischt und die Zellbead-Lösung in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführt.Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gesamtvolumen auf 12 Milliliter Isolationspuffer eingestellt und zwei Milliliter der Zellpartikelsuspension in jedes der sechs sterilen Röhrchen mit rundem Boden überführt. Legen Sie die Röhrchen sofort für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf den Zelltrennmagneten. Entfernen Sie dann den Überstand mit den Lymphozyten des peripheren Blutes aus jedem Röhrchen.Nehmen Sie die Röhrchen vom Magneten und geben Sie zwei Milliliter frischen Isolationspuffer zu jeder Zellprobe. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen und Partikel wieder zu suspendieren, und setzen Sie die Röhrchen für weitere fünf Minuten wieder in den Magneten ein. Entfernen Sie am Ende der Inkubation den Überstand wieder und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern frischem Isolationspuffer, wie gerade gezeigt.Ziehen Sie dann die CD14-positiven Monozyten, die Zellfraktionen enthalten, in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und bringen Sie das endgültige Volumen des Röhrchens auf 50 Milliliter in sterilem DPBS. Um die gereinigten Monozyten in dendritische Zellen zu differenzieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugaiton und resuspendieren Sie das Pellet in 50 Millilitern DPBS. Nach dem Zählen schleudern Sie die Zellen wieder herunter und resuspendieren das Pellet in einer Konzentration von einmalig 10 auf die 6. Zellen pro Milliliter und vorgewärmtes Kulturmedium.Übertragen Sie drei Milliliter Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen und fügen Sie rekombinantes humanes Interleukin, vier und GMCSF zu jeder Vertiefung hinzu, um eine 48-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu gewährleisten. Am zweiten Tag der Kultur stimulieren Sie die Zellen erneut mit frischen Zytokinen und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Ziehen Sie am fünften Tag die Überstände und pipettieren Sie frisches Medium mehrmals vorsichtig in die Vertiefungen, um die unreifen dendritischen Zellen zu ernten.Nach der Trennung durch Dichtegradient besteht eine typische PBMC-Fraktion aus etwa 4 % B-Lymphozyten, 28 % Monozyten und 68 % anderen Zellen, von denen 44 % T-Lymphozyten sind. Nach der Magnetpartikeltrennung zeigt die durchflusszytometrische Analyse der negativen Fraktion einen ähnlichen Prozentsatz an b-Lymphozyten, einen höheren Prozentsatz der anderen Zellpopulationen und einen stark reduzierten Prozentsatz an Monozyten.Die Charakterisierung der positiven Fraktion zeigt die hohe Reinigungseffizienz, da über 99% der Zellen CD14 exprimieren. Nach fünftägiger Interleukin-4- und GMCSF-Simulation differenzieren sich die CD14-positiven Zellen in unreife CD83-negative DC-SIGN-positive Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen, die in der Morphologie, dem Verhalten und der Rezeptorexpression mit dermalen dendritischen Zellen vergleichbar sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis fünf Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Monozyten aus Vollblut isoliert und in dendritische Zellen unterscheidet. Diese Technik ist für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie sehr wichtig, um nicht nur die Funktion der dendritischen Zellen, sondern auch die Funktion von Monozyten und Makrophagen im primären menschlichen In-vitro-Zellsystem zu untersuchen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie mikroskopische Analysen, Durchflusszytometrie, Infektions- oder Antigenpräsentationsaufsätze durchgeführt werden, um Fragen zur Biologie, Funktion und Wechselwirkung mit Antigenen zu beantworten.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blut gefährlich sein kann und dass vor Beginn dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, ein Laborkittel oder eine Hepatitis-Impfung getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von dendritischen Zellen - Schlüsselantigen-präsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren - aus dem Knochenmark einer erwachsenen Maus.

Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

Dieses Video zeigt die Erzeugung von unreifen, reifen und tolerogenen dendritischen Zellen (DCs) aus menschlichen Monozyten. Die Inkubation von Monozyten mit Wachstumsfaktoren und Zytokinen führt zur Produktion von unreifen DCs. Als Reaktion auf immunregulatorische Moleküle differenzieren sich unreife DCs in tolerogene und reife DCs.

Erzeugung unreifer, reifer und tolerogener dendritischer Zellen aus Monozyten

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Diese Studie vergleicht zwei verschiedene Methoden der Isolierung humaner Monozyten zur Gewinnung von in vitro dendritischen Zellen (DCs). Monozyten werden durch Adhärenz selektiert oder durch magnetische Trennung negativ angereichert. Die Monozytenausbeute und -viabilität sowie die Viabilität, Proliferation und Expression von CD11c/CD14-Oberflächenmarkern werden zwischen beiden Methoden verglichen.

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Die Tranmmunisierung (TI) Gerät oder Platte und verwandte Protokolle wurden entwickelt, um die wichtigsten Merkmale der extrakorporalen Photochemotherapie (ECP) zu replizieren, in einem experimentellen Umfeld, die die Produktion von physiologisch aktivierten, tausenfähigen dendritischen Zellen (DCs) für die Krebs-Immuntherapie.

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Die Methodik beschreibt die Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) und deren Anwendung für die In-vitro-Evaluierung von Antigenkandidaten während der Entwicklung potenzieller veterinärmedizinischer Impfstoffe bei Rindern.

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Ein einzigartiges, umfassendes Protokoll zur Generierung von de-sialylierten humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mo-DCs) aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Sialidase-Behandlung wird vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden zur Beurteilung der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von mo-DCs beschrieben und evaluiert, wie die Behandlung mit Sialidase das Reifungsniveau von mo-DCs verbessert.

Generierung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen mit unterschiedlichen sialylierten Phänotypen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Lernen Sie die Isolierung von Monozyten aus menschlichem Vollblut mittels magnetischer CD14-Beads zur Differenzierung in dendritische Zellen. Diese Methode erreicht 98-99% Reinheit und ermöglicht immunologische In-vitro-Studien.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

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