3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Erzähler}Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine strukturierte und reproduzierbare Methode für die 3D-Verarbeitung von Ganzherzgewebe zu ermöglichen, die zur Beurteilung der Zielgenauigkeit von intramyokardialen Injektionen in die Infarktgrenzzone verwendet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kardioregenerativen Medizin zu beantworten, wie z.B. die Praxisentwicklung und die Optimierung von Injektionstechniken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine standardisierte und reproduzierbare Methode für die 3D-Verarbeitung von Ganzherzgewebe bietet.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung kardialer regenerativer Therapien und die Validierung der Injektionsgenauigkeit normaler Verabreichungstechniken. Ziel dieser kardialen Stammzelltherapie ist es, Zellen in die Infarktgrenzzone zu injizieren, um die lokale Vaskulogenese und den Schutz der Kardiomyozyten zu stimulieren. Die Erfassung des Herzens in der enddiastolischen Phase erfordert Übung und Geduld.

Eine visuelle Demonstration dieser Schritte ist von entscheidender Bedeutung. Beginnen Sie damit, das Perikard von dem mit Mikroperlen injizierten Herzen zu trennen und die Vorhöfe und Ventrikel intakt zu halten. Wenn das gesamte Gewebe entfernt wurde, präparieren Sie mit einer Klinkenberg-Schere die aufsteigende Aorta etwa einen Zentimeter oberhalb der Aortenklappe und schneiden Sie die Vena cavalis und pulmonalis inferior etwa einen Zentimeter vom Vorhof entfernt.

Nachdem Sie die Spitze des Herzens am Boden des Kunststoffeinbettungsbehälters befestigt haben, um ein Aufschwimmen zu verhindern, legen Sie 2-0 Nähte durch den verbleibenden Teil der Aorta zu den Rändern des Behälters und fixieren Sie das Herz. Achten Sie darauf, dass das Herz zentriert ist und die Wände des Behälters nicht berührt. Wenn das Organ in einer enddiastolischen Geometrie fixiert ist, greifen Sie mit Mückenklemmen die Vena cavalis inferior und injizieren Sie mit einer 50-Milliliter-Spritze langsam frisch zubereiteten 50 bis 60 Grad Celsius heißen Agar über die Vena caval superior in den rechten Vorhof, bis sowohl der rechte Vorhof als auch der Ventrikel vollständig gefüllt sind.

Um ein eingebettetes Herz zu erhalten, das der enddiastolischen Geometrie so nahe wie möglich kommt, fixieren Sie die Spitze des linken Ventrikels am Boden des Behälters und füllen Sie den rechten Ventrikel mit Agar, während die Lungenvenen eingeklemmt werden. Platzieren Sie anschließend eine Mückenklemme auf den Lungenvenen und führen Sie eine neue, mit Agar gefüllte 50-Milliliter-Spritze vorsichtig in retrograder Richtung durch die Aortenklappen. Injizieren Sie die Lösung langsam in den linken Ventrikel, bis der Ventrikel und der linke Vorhof vollständig gefüllt sind, und klemmen Sie die Aorta ein, sobald der linke Ventrikel gefüllt ist.

Gießen Sie nun den restlichen Agar in den Behälter, bis das Herz vollständig bedeckt ist, und platzieren Sie zwei starre Kunststoffröhrchen in dem Einbettungsbehälter, die als Referenzstrukturen während der Bildregistrierung dienen. Legen Sie dann das Herz für mindestens vier Stunden bei zwei bis sieben Grad Celsius, um den Agar zu verfestigen. Drehen Sie nach der Magnetresonanztomographie den Behälter auf den Kopf und lassen Sie Luft zwischen dem Agar und den Seiten des Behälters zu, um die feste Agarlösung und das Herz aus dem Behälter zu entfernen.

Entferne die Plastikstäbe. Verwenden Sie dann einen Fleischschneider, um den Agarblock und das Herz in fünf Millimeter große Scheiben von der Spitze bis zur Basis des Herzens zu schneiden, wobei Sie parallel zur Unterseite des Agarblocks schneiden, um die Winkelung der Scheiben wie auf den aufgenommenen Magnetresonanzbildern zu halten. Wenn alle Scheiben erhalten wurden, färben Sie die Gewebeproben in TTC.

Fotografieren Sie nach 15 Minuten die Scheiben auf beiden Seiten in einem senkrechten Winkel, spülen Sie die Abschnitte dann vorsichtig mit 0,9 % Kochsalzlösung ab. Um die Proben durch Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, wählen Sie die Fluoreszenzmodus-Bildgebung auf dem Scanner mit variablem Modus und stellen Sie die Pixelgröße auf 100 x 100 Mikrometer ein. Wählen Sie für den ersten Filterblock einen Bandpassfilter aus, der sich mit der Emissionswellenlänge der Fluoreszenz der Perle im ersten Kanal überschneidet, und dann den Bandpassfilter für den zweiten Filterblock außerhalb der Emissionswellenlänge im zweiten Kanal.

Wählen Sie als Nächstes den entsprechenden Filterblock aus, stellen Sie die Photomultiplier-Röhre auf die entsprechende Spannung und den Anregungslaser auf die Anregungswellenlänge ein, die der der injizierten Mikrokügelchen am nächsten kommt. Nachdem alle Bilder erhalten wurden, segmentieren Sie in der entsprechenden Nachbearbeitungssoftware die Grenzen des Myokards und des endo- und epikardialen linken Ventrikels in den Magnetresonanzbildern, gefolgt von einer ähnlichen Segmentierung des Myokards und der Injektionsstellen in den Fluoreszenzbildern. Interpolieren Sie dann linear die im Bild registrierten Segmente von beiden Seiten der Schichten, um die ursprüngliche Probendicke zu rekonstruieren und ein 3D-Modell der Daten zu erstellen.

Mit dem Herzen, das in einer enddiastolischen Geometrie gesichert war, wie gerade in diesem repräsentativen Experiment gezeigt, haftete der Agar erfolgreich am Herzgewebe an, so dass das Gewebe in der gewünschten Angulation mit gleichen Schichtdicken geschnitten werden konnte. Sowohl auf den 2D-Fluoreszenz- als auch auf den Magnetresonanzbildern sind die Narben- und Injektionsstelle deutlich voneinander zu unterscheiden. TTC-gefärbtes Gewebe und späte Gadolinium-verstärkte Magnetresonanztomographien bieten eine Kontrolle für die Narbenbeurteilung in der Fluoreszenzbildgebung.

Die Nachbearbeitung der Bildgebung ermöglicht die Rekonstruktion der 3D-Geometrie des ex vivo-Herzens auf der Grundlage der Segmentierungen und Fluoreszenzbilder, wodurch die Genauigkeit der 3D-Injektion beurteilt werden kann. In dieser Studie wurden die Injektionsablagerungen und die Infarktgrenzzone an der Endokardwand geschützt und die Abstände zwischen den Projektionen auf der Endokardoberfläche gemessen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie eine chirurgische Beurteilung, die Quantifizierung der Infarktgröße oder die Validierung anderer dreidimensionaler Bildgebungsmodalitäten durchgeführt werden.

Wir haben diese Technik verwendet, um die Genauigkeit der Injektion in die Infarkt-Grenzzone zu beurteilen. Diese Forschung wurde durchgeführt, um die kardioregenerative Therapie bei Herzinsuffizienz zu verbessern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Herz vorbereitet, wie man Herzgewebe einbettet und verarbeitet und wie man Fluoreszenzbildgebung von Herzgewebeproben durchführt.