Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genfunktion in Dermestes maculatus zu erforschen, einem neuen Insektenmodellsystem, das die vielfältige Gruppe der Käfer repräsentiert und die Untersuchung von grundlegenden und angewandten Forschungsfragen erleichtert. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie, Evolutionsbiologie und darüber hinaus zu beantworten, indem sie es ermöglicht, die Genfunktion in Dermestes-Embryonen und -Erwachsenen zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass RNA-Interferenz verwendet werden kann, um jedes Gen anzugreifen, das nur auf Sequenzinformationen basiert, auch wenn keine vollständige Genomsequenz vorhanden ist.

Die hier vorgestellten Methoden bieten nicht nur einen Ansatz zur Untersuchung der Genfunktion bei Dermestes. Sie können auch zur Entwicklung neuer Insektenmodellsysteme und möglicherweise zur Bekämpfung von Schadinsekten eingesetzt werden. Um einen Aufzuchtkäfig für einen D.maculatus vorzubereiten, verteilen Sie zunächst eine dünne Schicht Holzspäne in einen mittelgroßen Insektenkäfig

Legen Sie ein Stück Styropor in den Käfig, um den Larven eine Umgebung zu geben, in der sie sich verpuppen können. Setzen Sie zwanzig bis fünfzig erwachsene Käfer oder Larven im späten Stadium in den Käfig ein. Geben Sie Nassfutter für Katzen als Nahrungsquelle in eine Petrischale oder ein Waagschiffchen.

Decken Sie den Käfig mit einem Netztuch ab und legen Sie ihn in einen Inkubator. Bevor Sie mit der Embryonenentnahme beginnen, überprüfen Sie den Käfig zunächst sorgfältig auf vorhandene Embryonen und entfernen Sie diese. Sobald der Käfig frei ist, lege einen gespannten Wattebausch in den Käfig und brüte die Kolonie bei 30 Grad Celsius aus.

Nach dem entsprechenden Zeitfenster sammeln Sie den Wattebausch, entfernen Sie alle anwesenden Erwachsenen und setzen Sie sie wieder in den Käfig. Kneifen Sie den Wattebausch vorsichtig auf ein Stück schwarzes Bastelpapier und reißen Sie ihn langsam in dünnes Filament, so dass alle vorhandenen Eier auf das schwarze Papier fallen. Nimm einen normalen Petrischalendeckel und verwende ein Stück schwarzes Filterpapier, um das Innere abzudecken.

Kleben Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband entlang der Kante eines Standard-Objektträgers. Legen Sie den Objektträger auf das schwarze Filterpapier im Deckel der Petrischale. Nehmen Sie das Papier mit den entnommenen Embryonen und klopfen Sie vorsichtig darauf, um die Embryonen auf den Deckel der Petrischale zu übertragen.

Richten Sie die Embryonen auf dem Klebeband mit einem Pinsel senkrecht zum Objektträger aus, wobei das vordere oder hintere Ende zum Rand zeigt. Um mit RNAi zu beginnen, nehmen Sie zunächst 2-4 Mikroliter dsRNA in eine 20-Mikroliter-Mikrolader-Pipettenspitze auf. Führen Sie die Spitze in eine vorgezogene Glaskapillare ein, die als Nadel bezeichnet wird, und pipettieren Sie die Lösung vorsichtig in die Nadel.

Befestigen Sie die Nadel in einem Kapillarhalter aus Glas und montieren Sie dann den Kapillarhalter in den Mikromanipulator. Übertragen Sie dann den Objektträger mit den daran befestigten Embryonen vorsichtig auf den Tisch des Präpariermikroskops. Bewegen Sie den Objektträger, um einen Embryo in die Mitte des Feldes zu bringen und das Mikroskop zu fokussieren.

Während Sie in das Präparierfernrohr schauen, positionieren Sie die Spitze der Kapillare mit dem Mikromanipulator. Führe die Spitze nahe an das Ende des ersten Embryos in der Reihe. Schalten Sie die Stickstoff- oder Luftzufuhr ein und stellen Sie dann den Wahlschalter des Magneteingangs auf Vakuum.

Stellen Sie den Auswurfdruckregler je nach Gerät auf 10-15 psi ein. Öffnen Sie die Kapillare, und die farbige dsRNA-Lösung füllt die Spitze und ist bereit für die Injektion. Bewegen Sie die Kapillarspitze nach vorne und stechen Sie vorsichtig in den Embryo.

Bei idealer Druckeinstellung fließt keine embryonale Flüssigkeit in die Kapillare. Treten Sie auf den Fußschalter, um dsRNA in den Embryo zu schleudern, bis die entsprechende Menge abgegeben wird. Lassen Sie die Spitze etwa zwei Sekunden lang im Embryo und entfernen Sie sie dann vorsichtig.

Sobald alle Embryonen injiziert wurden, legen Sie den Objektträger in eine Petrischale. Lege einen nassen Wattebausch in die Schüssel und achte darauf, dass er nicht mit der Rutsche in Berührung kommt. Decken Sie die Petrischale ab und wickeln Sie sie mit Siegelfolie ein.

Beschriften Sie es mit dem dsRNA-Typ, der Konzentration, dem Datum, der Uhrzeit und der Anzahl der injizierten Embryonen. Zum Schluss stellen Sie die Schale in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius, bis die Embryonen schlüpfen. Um pRNAi durchzuführen, sammeln Sie zunächst Puppen aus der Kolonie.

Sortieren Sie männliche und weibliche Puppen in zwei separate Schalen und legen Sie diese in einen 30 Grad Celsius heißen Brutkasten. Überprüfen Sie die Platten täglich auf geschlossene Käfer und setzen Sie diese Individuen in zwei separate Petrischalen für männliche und weibliche Erwachsene um. Füttern Sie diese erwachsenen Tiere und pflegen Sie die Platten jeden zweiten Tag, bis genügend erwachsene Tiere sich geschlossen haben, um mit der Injektion zu beginnen.

Sobald das adulte Becken fertig ist, betäuben Sie einen weiblichen Käfer und halten Sie mit einer Hand die einzelne Bauchseite nach oben, während Sie mit der anderen die Spritze halten. Dringen Sie vorsichtig in die Segmacoria-Membran zwischen den Sterniten 2 und 3 ein. Überprüfen Sie die Spritzenwaage und geben Sie langsam etwa zwei Mikroliter pro Frau ab.

Halten Sie die Nadel nach der Injektion mindestens 5 Sekunden lang ruhig und ziehen Sie sie dann vorsichtig zurück. Injizierte Weibchen mit Katzenfutter in eine Petrischale geben. Beschrifte das Gericht entsprechend.

Stellen Sie die Schale in einen 30 Grad heißen Inkubator. Nach 24 Stunden werden die injizierten Weibchen in einen Minikäfig umgefüllt und die gleiche Anzahl der nicht injizierten jungen Männchen hinzugefügt. Beschriften Sie den Käfig und fügen Sie Katzenfutter hinzu.

Stellen Sie den Käfig in einen 30 Grad Celsius heißen Inkubator, um die Paarung zu ermöglichen. Die daraus resultierenden Nachkommen können dann untersucht werden, um die Wirkung der pRNAi zu bestimmen. Dieses Bild zeigt einen Nachkommen eines pRNAi-Individuums, dem DS GFP, grün fluoreszierendes Protein, als Kontrolle injiziert wurde.

Hier schlüpften, wie bei Wildtyp-Individuen, die Nachkommen mit einem pigmentierten Streifen pro Segment. Benachbarte pigmentierte Streifen waren durch eine unpigmentierte Lücke getrennt. Nach der gepaarten pRNAi schlüpften die betroffenen Nachkommen mit verschmolzenen benachbarten pigmentierten Streifen, was auf defekte Segmentgrenzen hinweist.

Der phänotypische Schweregrad war variabel, aber Fusionen traten konsistent an bestimmten Grenzregionen auf, was auf paarregelartige Defekte hinweist. In ähnlicher Weise zeigten die Kutikula-Phänotypen von nicht geschlüpften Embryonen nach dem gepaarten Knockdown einen Verlust der Abdominalsegmente sowie eine verkürzte Körperlänge. Die Färbung früher Embryonen mit eingeklemmten Antikörpern zur Untersuchung molekularer Defekte zeigte bei Kontrollindividuen Expressionsstreifen gleicher Intensität in jedem Segment.

Im Gegensatz dazu wurde eine verminderte Expression in alternativen Streifen bei Nachkommen von Dmac-gepaarten dsRNA-injizierten Weibchen nachgewiesen. Dieses Muster verminderter Expression stimmt mit dem defekten Kutikulamuster überein, das bei den betroffenen geschlüpften Larven beobachtet wurde. Hier stellen wir zum ersten Mal unser Protokoll vor, um ein Gen von Interesse während der frühen Embryonalentwicklung in Dermestes maculatus mittels RNA-Interferenz auszuschalten.

Wenn Sie diese Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Embryonen oder weibliche Erwachsene in einem geeigneten Stadium zu verwenden. Einmal gemeistert, kann die Injektion von etwa 100 Embryonen oder 10 weiblichen Erwachsenen innerhalb einer halben Stunde durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie die Embryonenfärbung oder die quantitative PCR, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu genregulatorischen Mechanismen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Dermestes-Laborkolonie einrichten und sowohl embryonale als auch elterliche RNA-Interferenzen bei diesem Käfer durchführen. Derzeit steht nur eine kleine Anzahl von Insektenmodellen für funktionelle Studien zur Verfügung. Die hier vorgestellten Techniken ebnen den Forschern den Weg, Dermestes als Modellsystem zu verwenden und den Anwendungsbereich von Insekten zu erweitern, die für molekulargenetische Analysen geeignet sind.