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Die Röntgenfluoreszenzspektroskopie (RFA) ist eine zerstörungsfreie Analysetechnik, die zur Durchführung von Elementaranalysen von Proben bei Raumtemperatur verwendet wird.
RFA kann auf eine Vielzahl von Proben angewendet werden, darunter biologische, forensische, Umwelt- und sogar Kunstwerke. Die Proben können auch eine Vielzahl von Formen annehmen, wie z. B. Pulver, Kristalle und Flüssigkeiten. Bei der RFA wird eine Probe mit einem Röntgenstrahl beschossen, wodurch sie sekundäre Röntgenstrahlen mit geringerer Energie emittiert, die als Fluoreszenzstrahlung bezeichnet werden.
Obwohl sie als Fluoreszenztechnik bezeichnet wird, unterscheidet sich die RFA von der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie dadurch, dass sie kein sichtbares Licht mit niedrigerer Energie oder lichtaktive Moleküle verwendet.
In diesem Video werden die Grundlagen der RFA vorgestellt und gezeigt, wie Elementkarten einer biologischen Probe gesammelt werden.
Wenn ein Photon mit ausreichender Energie mit einem Atom kollidiert, wird die Energie absorbiert und regt eines der Elektronen der äußeren Schale an. Wenn sich das Elektron entspannt, emittiert es ein sekundäres Photon, typischerweise mit niedrigerer Energie. Dieser Prozess wird als Fluoreszenz bezeichnet. Im Gegensatz zu niederenergetischen Photonen, wie sie in der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, sind Röntgenphotonen energiereich genug, um fest gehaltene Elektronen vollständig aus einer inneren Hülle auszustoßen. Ein Elektron aus einer Hülle mit höherer Energie fällt dann in die Leerstellenstelle. Es wird ein Photon freigesetzt, das proportional zur Energiedifferenz zwischen den beiden Schalen ist. Jedes Element emittiert einen einzigartigen Satz von Photonen oder Spektrum, der zur Identifizierung des Elements und zur Bestimmung der vorhandenen Menge verwendet werden kann. Dieses Phänomen ist als Röntgenfluoreszenz bekannt.
Sobald ein Elementspektrum gesammelt wurde, können die Signale der interessierenden Elemente isoliert werden. Messungen können an mehreren Stellen in einer Probe durchgeführt werden, wodurch ein Bild Pixel für Pixel erzeugt wird. Dieser Vorgang wird als Raster-Scanning bezeichnet. Bilder aller interessanten Elemente können nachträglich erstellt werden. Diese Elementkarten liefern wertvolle Informationen über die Probe. Mit einem Verständnis der RFA sind Sie nun bereit, eine biologische Zellprobe vorzubereiten, um Elementkarten zu erstellen.
Bereiten Sie zunächst ein Siliziumnitrid-Fenster vor und sterilisieren Sie es, das die Probe für den Scan an Ort und Stelle hält. Seien Sie vorsichtig, da sie sehr zerbrechlich sind. Richten Sie das Fenster so aus, dass es mit der flachen Seite nach oben zeigt. Legen Sie dann das Fenster in eine Kulturschale und kleben Sie es mit kleinen Stücken Klebeband auf die Schale.
Zum Schluss wird das Siliziumnitrid-Fenster 1 Stunde lang mit UV-Strahlung sterilisiert.
Nachdem das Fenster sterilisiert wurde, kann die Probe daran befestigt werden. Halten Sie zuerst die Kulturschale schräg und legen Sie das Medium an die Seite der Schale. Verringern Sie langsam die Neigung, um das Fenster zu beschichten. Geben Sie auf die gleiche Weise Zellen in die Schale und inkubieren Sie.
Beobachten Sie die Zellen regelmäßig unter einem Lichtmikroskop, bis sie gebrauchsfertig sind.
In einer Laminar-Flow-Haube das Medium vorsichtig aus der Schale ansaugen.
Spülen Sie dann die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um überschüssiges Medium zu entfernen.
Aspirieren Sie das PBS und fixieren Sie die Zellen mit Paraformaldehyd. Nach 20 min die Mischung entfernen und als Sondermüll entsorgen.
Nehmen Sie das Fenster aus der Schale und tupfen Sie die Ränder und die hintere Vertiefung des Fensters schnell mit einem Kimwipe ab. Stellen Sie das Fenster zum Trocknen auf eine saubere Oberfläche.
Sobald die Probe trocken ist, überprüfen Sie mit einem Lichtmikroskop das Vorhandensein von Zellen auf dem Fenster.
Befestigen Sie das Fenster mit klarem Nagellack an einer Aluminiumhalterung.
Setzen Sie den Probenhalter in die Instrumentenhalterung ein und setzen Sie die Halterung dann auf den Positionierungstisch des Röntgenmikroskops.
Positionieren Sie das Probenfenster im Brennpunkt der Röntgenmikroskopoptik, mit einem Winkel von 45 Grad zum einfallenden Strahl.
Verlassen Sie den Instrumentenbereich und führen Sie die verbleibenden Schritte aus der Ferne durch, um die Röntgenstrahlenbelastung zu minimieren.
Öffnen Sie den Verschluss und verwenden Sie die Optik, um den monochromatischen Röntgenstrahl auf eine Punktgröße im Submikrometerbereich zu fokussieren.
Die Position des Spots kann mit einer vorkalibrierten Kamera abgebildet werden. Bestimmen Sie mithilfe der Positionierungsstufen die geeignete Breite und Höhe, die für das Rastern der Stichprobe erforderlich sind.
Sammeln Sie ein Testspektrum des interessierenden Elements mit einer Verweildauer von 1 ? 2 Sekunden.
Wählen Sie aus dem Testspektrum eine geeignete Scanzeit, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis für die interessierenden Elemente bereitzustellen.
Bestimmen Sie dann die für die Stichprobe erforderliche Auflösung. Die Auflösung sollte kleiner als die interessierenden Features, aber größer als die Spotgröße sein. Programmieren Sie abschließend den Scan in die Scansoftware und erfassen Sie das Bild.
In diesem Experiment wurde eine Elementkarte einer Zelle für mehrere verschiedene Elemente erstellt. Viele Metalle wie Kupfer, Eisen und Zink sind wichtige Nährstoffe in der Zelle und wurden innerhalb der Zelle eindeutig identifiziert.
Durch die Bestimmung, wo sich jedes Metall in der Zelle befindet, können wertvolle Informationen über seine normalen zellulären Prozesse aufgeklärt werden. Darüber hinaus können metallbasierte Erkrankungen verstanden werden.
Die Röntgenfluoreszenz wird in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Bereichen eingesetzt. Die zerstörungsfreie Natur der RFA ermöglicht ihren Einsatz bei der Untersuchung historischer Artefakte. Kunsthistoriker nutzen die Technik, um die Pigmente zu bestimmen, die ursprünglich in Kunstwerken verwendet wurden. Dadurch können Informationen über das Werk geklärt werden, wie z. B. die Provenienz, die im Laufe der Zeit verblassten Farben und die Authentizität. Forensiker verwenden RFA auch bei der Untersuchung von Tatorten. Wenn eine Waffe abgefeuert wird, wird die Umgebung mit Schrotresten überzogen. Schussrückstände enthalten Schießpulver, Zündzündhütchen und Metall aus dem Gehäuse und der Kugel. Die mit RFA gesammelten Informationen können den Täter und die verwendete Waffe identifizieren.
Ein weiteres Forschungsgebiet, das sich für die Röntgenfluoreszenz eignet, ist die Paläontologie. Hier werden elementare Informationen von einem Trilobitenfossil gesammelt, einem marinen Gliederfüßer, der vor über 250 Millionen Jahren lebte.
Durch die Charakterisierung der elementaren Zusammensetzung von Fossilien können neue Informationen über lange ausgestorbene Leben gewonnen werden. Besser konservierte Proben können sogar die Zusammensetzung von Weichgeweben liefern, die sich vor langer Zeit verschlechtert haben.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Röntgenfluoreszenz gesehen. Sie sollten nun die Theorie der Röntgenspektroskopie verstehen und wissen, wie man elementare Informationen aus einer Vielzahl von Quellen sammelt.
Danke fürs Zuschauen!
