Name: Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie lebende dopaminerge Neurone in Mittelhirnkulturen mithilfe von TH-getriebener eGFP-Expression und RNA-Sequenzierung zuverlässig identifizieren. Diese Methode ermöglicht Genexpressionsanalysen bei Parkinson-Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), der Michael J. Fox Foundation und der Caltech Innovation Initiative unterstützt, die das Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory am California Institute of Technology finanziert. Wir danken Brian Williams für die Optimierung des RNA-Seq-Bibliotheksprotokolls und die Unterstützung durch diese Hilfe. Wir danken Henry Amrhein für das computergestützte Training. Wir danken Barbara J. Wold für die Nutzung ihrer Geräte und Laborräume. Wir danken Igor Antoshechkin für die Sequenzierung der Bibliothek und für das Facility Management.

<ol><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+nicotine+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).</li>
<li>Marinov, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single-cell+to+cell-pool+transcriptomes%3A+stochasticity+in+gene+expression+and+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing.</a> Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+reveals+dynamic+changes+in+lncRNA+expression+during+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).</li>
<li>Gertz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposase+mediated+construction+of+RNA-seq+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transposase mediated construction of RNA-seq libraries.</a> Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).</li>
<li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li>
<li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs%2C+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry%2C+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency%2C+and+Prevents+Nicotine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubator+embedded+cell+culture+imaging+system+%28EmSight%29+based+on+Fourier+ptychographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy.</a> Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).</li>
<li>Lammel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+transgenic+mouse+models+for+selective+targeting+of+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons.</a> Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dryanovski, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+entry+and+alpha-synuclein+inclusions+elevate+dendritic+mitochondrial+oxidant+stress+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons.</a> J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).</li>
<li>Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Regulation+of+Action+Potential+Shape+and+Burst-Frequency+Firing+by+BK+and+Kv2+Channels+in+Substantia+Nigra+Dopaminergic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons.</a> J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier isolieren wir einzelne Zellen aus einer heterogenen Population einen Fluoreszenzmarker verwenden, dann jede Zelle studieren mit Single-Cell-RNA-seq. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die wir waren tatsächlich dopaminergen Neuronen geerntet und sequenziert, basierend auf der Anwesenheit der folgenden drei DA-verwandtes Gen-Transkripte, TH, DDC und SLC6A3. Alle der TH-eGFP positiven Zellen, die diese drei Gene exprimiert durch RNA-Seq beurteilt wie. Das war konkordant mit elektrophysiologischen St...

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine unheilbare, altersbedingte neurodegenerative Erkrankung. Die Ursache für diese relativ häufige Erkrankung bleibt kaum verstanden. Es ist weit verbreitet Neuronenverlust im gesamten Gehirn, mit ausgeprägter neuronaler Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra (SNC), was zu einem diagnostischen klinischen Merkmale der Bradykinesie, Rigor und Tremor. Primäre Mischkulturen SNc dopaminergen Neuronen enthalten, sind besonders relevant für die Parkinson-Krankheit. Ventralen Tegmentum (VTA) dopaminergen Neuronen wurden in Lohn und Sucht beteiligt. Ventrale mesencephalen (VM) primären gemischten embryonalen Kulturen enthalten sowohl SNc und VTA dopaminergen (DA) Neuronen und GABAergen Neuronen. VM Primärkulturen können für Neuroprotektion Assays nützlich sein und die selektive Anfälligkeit von dopaminergen Neuronen aufzuklären. Es gibt keine zuverlässige Möglichkeit, dopaminergen Zellen in Kultur, die auf Morphologie zu identifizieren. ErSingle-Cell, High-Yield-RNA-Sequenzierung Bibliotheken re entwickeln wir Techniken einzelne dopaminergen Neuronen zu identifizieren und zu ernten, und zu konstruieren. Wir berichten Vertreter RNA Transkriptom-Daten für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Dieses Protokoll kann für Neuroprotektion, Neurodegeneration und pharmakologische Tests verwendet werden, um die Wirkungen von verschiedenen Behandlungen auf dem DA / GABA Transkriptom zu studieren. Da dopaminergen Neuronen eine kleine Minderheit der exprimierten Neuronen in der primären VM Kulturen repräsentieren, die Fähigkeit, zuverlässig diese Neuronen in lebenden Kulturen identifizieren eine erweiterte Palette von Single-Cell-Studien ermöglichen. Diese neuen Techniken werden Fortschritte erleichtern, die Mechanismen zu verstehen, Platz auf der zellulären Ebene und Anwendungen an anderer Stelle in den Bereichen der Neurowissenschaften und Molekularbiologie haben.

<table><tbody><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation&nbsp;</td><td></td><td></td>LS003126</tr><tr><td>Hanks-balancierte Salzlösung (HBSS), 1x</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Spenderserum für Pferde</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Medium: Neurobasales Medium</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nährmedien, die eine stabilisierte Form von L-Glutamin, L-Alanyl-L-Glutamin, enthalten: GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-061</td><td>0,5 mM Endkonzentration.</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td>50x Stammlösung, 1x Endkonzentration.</td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenschalen</td><td>MatTek&nbsp; &nbsp;</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>L2020</td><td>Gelagert bei -20 Grad C in 20 & Mikro; L aliquote</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I (DNase)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Blaue Pipettenspitzen P1000</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>&nbsp;Inc. 10130</td><td></td></tr><tr><td>10 mm flache</td><td>Petrischale VWR&nbsp;</td><td>25384-324</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 > C, 5 % Luftfeuchtigkeit, Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Equitech</td><td>SD-0100HI</td><td>100%ige Stammlösung, 1% Endkonzentration.</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere mit Standardmuster</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette - 2x3 Zähne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette - Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7,4</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Lösung (DPBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>21 G Nadel</td><td>BD PrecisionGlide Nadel</td><td>305167</td><td>100 Nadeln</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>Modell P-87</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>&nbsp; MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit für die Illumina-Sequenzierung</td><td>Clontech</td><td>634936</td><td>100 rnxs, inkl. Advantage2PCR Kit</td></tr><tr><td>Oligonukleotid (12 & Mikro; M): SMARTer IIA Oligonukleotid (12 & Mikro; m)</td><td></td><td></td><td>Aus dem SMARTer Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase (100 Einheiten)</td><td>SMARTcribe reverse Transkriptase</td><td></td><td>Aus dem SMARTer Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Grundierung 1</td><td>3' CDSIIa Grundierung&nbsp;</td><td></td><td>Aus dem SMARTer Kit</td></tr><tr><td>Primer 2</td><td>IS PCR-Primer</td><td></td><td>Aus dem SMARTer Kit</td></tr><tr><td>50x 2 Polymerase-Mix</td><td>50x Advantage 2 Polymerase-Mix</td><td></td><td>Aus dem SMARTer Kit</td></tr><tr><td>10x PCR-Puffer</td><td>10x Advantage 2 PCR-Puffer</td><td></td><td>Aus dem SMARTer Kit</td></tr><tr><td>RNA Spikes</td><td>ThermoFisher</td><td>4456740 PCR-Kühler</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rack IsoFreeze PCR-Kühler Rack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit zur Vorbereitung von DNA-Proben&nbsp;</td><td>(Illumina/Nextera) Nexter</td><td>FC-121-1030</td><td>24 Proben</td></tr><tr><td>PCR-Mastermix</td><td>Nextera PCR-Mastermix (NPM)</td><td></td><td>Aus dem Nextera-Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>PCR-Primer-Cocktail (PPC)</td><td>Nextera PCR-Primer-Cocktail (PPC)</td><td></td><td>Aus dem Nextera Kit</td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Das Qubit ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>HS DNA BioAnalyzer Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>110 rxns</td></tr><tr><td>Elektrophoresesystem&nbsp;</td><td>Agilent 2100 Bioanalysator.</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Kügelchen: Agencourt AMPure&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>RNAse Wipe: RNAse Zap Wipes</td><td>Ambion</td><td>AM9786</td><td>Größe 100 Blatt</td></tr><tr><td>Qubit ds HS Assay Kit</td><td>Molekulare Sonden</td><td>Q32854</td><td>500 Assays</td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit: Qiaquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarrohr</td> <td>(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm Außendurchmesser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige (oder gleichwertig)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierer</td><td>Illumina HiSeq-Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GENSAT Tyrosinhydroxylase-eGFP-Mausstamm&nbsp;</td><td></td><td>MMRRC Aktiennummer: 000292-UNC</td><td>Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center</td></tr></tbody></table>

zuverlässige identifikation von wohn dopaminerge neurone in mittelhirns kulturen unter verwendung von rna-sequenzierung und th-promotor getriebene egfp expression

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

<html> Bei der Parkinson-Krankheit (PD) ist weit verbreitet Verlust von Neuronen im Gehirn mit ausgeprägter Degeneration dopaminerger Neurone in der SNc, was zu Bradykinesie, Rigidität und Tremor. Die Identifizierung von lebenden dopaminergen Neuronen in der primären ventrale mesencephalen (VM) Kulturen einen fluoreszierenden Marker bietet eine alternative Möglichkeit die selektive Anfälligkeit dieser Neuronen, ohne sich auf die Immunfärbung von fixierten Zellen zu studieren. Hier isolieren wir distanzieren und Kultur Maus VM Neuronen für 3 Wochen. Wir identifizieren dann dopaminergen Neuronen in den Kulturen mit eGFP-Fluoreszenz (angetrieben von einem Tyrosin-Hydroxylase (TH) Promotor). Einzelne Neuronen werden in Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von Glasmikropipetten geerntet. Als nächstes wir die geernteten Zellen lysieren und cDNA - Synthese und Transposon-vermittelte &quot;tagmentation&quot; leiten einzelne Zelle RNA-Seq - Bibliotheken 1, 2, zu erzeugen ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 3, 4, 5. Nach dem Passieren wird eine Qualitätskontrollprüfung werden Einzelzellen-Bibliotheken sequenziert und die anschließende Analyse durchgeführt Genexpression zu messen. Wir berichten Transkriptom Ergebnisse für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Wir berichten, dass 100% der lebenden TH-eGFP-Zellen, die geerntet wurden und sequenziert wurden dopaminergen Neuronen. Diese Techniken haben weit verbreitete Anwendungen in der Neurowissenschaft und Molekularbiologie.

Hier berichten wir ein Protokoll zur Kultivierung ventralen Mesencephalon - Neuronen von einem Maus - eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase - Promotor - Sequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen und Messung ihrer RNA Transkriptom unter Verwendung von RNA-seq (Abbildung 1). Die Daten zeigten, dass 100% der TH-eGFP-positive Zellen, die geerntet wurden und dopaminergen Neuronen wurden sequenziert, basierend auf der Anwesenheit...

Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die zuverlässige Identifizierung lebender dopaminerger Neuronen in Mittelhirnkulturen durch Tyrosinhydroxlase-gesteuerte eGFP-Expression, Einzelzellernte und RNA-Sequenzierungsbibliotheksgenerierung. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Parkinson und Drogenabhängigkeit zu beantworten, da sie es ermöglicht, Genexpressions- und elektrophysiologische Assays an identifizierten lebenden dopaminergen Neuronen in Kultur durchzuführen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Möglichkeit bietet, lebende und nicht fixierte dopaminerge Neuronen in primären ventralen mesencephalen Kulturen zuverlässig zu identifizieren.Den ersten Teil des Verfahrens wird Charlene Kim, eine Technikerin aus dem Labor von Henry Lester, vorführen. Beginnen Sie damit, den Kopf eines Mausembryos mit einer Pinzette zu stabilisieren, die fest auf der Schnauze sitzt, so dass die Rückenfläche zugänglich ist. Mit einer Pinzette, die man in der anderen Hand hält, die Hautschicht und den Schädel kurz vor dem Kamm des Mesencephalons zusammendrücken und die Haut und den Schädel entlang der Mittellinie caudelly zurückziehen.Platzieren Sie die Pinzette um den Kamm, mit einer Spitze zwischen der Rinde und dem Mesoncephalon und der anderen über dem Kleinhirn. Kneifen und entfernen Sie das gesamte Mittelhirn. Platzieren Sie das Mittelhirn in einer Petrischale mit kaltem HBSS unter einem Präpariermikroskop.Drehen Sie unter dem Präpariermikroskop das Hirnsegment um, so dass nun die ventrale Seite zugänglich ist. Es sind nun vier Quadranten sichtbar. Entfernen Sie alle Hirnhäute und Gefäße, indem Sie die Hirnhäute vorsichtig mit einer Pinzette greifen und nach oben vom Gehirn weg ziehen.Als nächstes platzieren Sie eine Zange mit einer Pinzette in den Ventrikel ungefähr in der Mitte des Segments. Um das Mittelhirn zu trennen, kneifen Sie dorsal und kneifen Sie dann medial auf jeder Seite. Nehmen Sie die unteren beiden Quadranten, indem Sie auf beiden Seiten seitliche Schnitte machen.Der ventrale tegmentale Bereich und die Substantia nigra pars compacta befinden sich im ventralen unteren Abschnitt, der dicht erscheint. Legen Sie das präparierte Gewebe, das sowohl VTA als auch SNC enthält, in frisches HBSS in einen separaten Bereich der Petrischale. Nachdem Sie alle Gehirnsegmente seziert haben, verwenden Sie eine Pinzette und ein Skalpell mit der Nummer 11, um jeden Mittelhirnabschnitt in etwa gleich große Stücke zu vierteln.Verwenden Sie dann eine P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung, um alle geviertelten Mittelhirnsegmente in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Nachdem Sie das Gewebe abgesetzt und das HBSS entfernt haben, fügen Sie 500 Mikroliter Papainlösung hinzu. In einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad 15 Minuten lang inkubieren.Nach der Inkubation verwenden Sie eine P1000-Spitze mit breiter Bohrung, um nur die Mittelhirnsegmente in ein Ein-Milliliter-Aliquot DNase I-Lösung zu überführen, und lassen Sie die Segmente am Boden des Röhrchens absetzen. Übertragen Sie dann nur die Mittelhirnsegmente in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Kaltstopplösung. Ersetzen Sie die zweite Spülung durch einen Milliliter frischer Stopplösung und pipettieren Sie mit einer P1000-Pipettenspitze siebenmal auf und ab, um die Zellen zu verreiben.Unterlegen Sie dann die Zellsuspension, indem Sie langsam 200 Mikroliter 4%ige BSA-Lösung in den Boden des Röhrchens pipettieren. Nach einer Zentrifugation bei 280 x g für sechs Minuten wird der Überstand mit einem P1000 aspiriert und die Zellen in einem Milliliter Plattierungsmedium resuspendiert. Führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer durch und verdünnen Sie dann die Zellsuspension auf 1000 Zellen pro Mikroliter mit Plattierungsmedium.120 Mikroliter der Zellsuspension werden unmittelbar nach dem Aspirieren von Laminin auf mit Poly-D-Lysin, Poly-L-Ornithin und Laminin beschichtete Kulturschalen aufgetragen, um sicherzustellen, dass die Beschichtung nicht austrocknet und eine unebene Oberfläche bildet. Dann, nach einer Stunde Inkubation, geben Sie vorsichtig drei Milliliter Kulturmedium in einen nicht besiedelten Bereich der Kulturschale, um die Zerstörung der Zellen zu minimieren. Spülen Sie die Kulturschale nach dreiwöchiger Kultivierung mit zwei Millilitern RNase-freiem Dulbecco's PBS aus.Entfernen Sie das DPBS. Dann für die Ernte durch einen Milliliter frisches DPBS ersetzen. Verwenden Sie das GFP-Filterset und das 40X-Objektiv an einem inversen Epifluoreszenzmikroskop, um fluoreszierende TH-positive Neuronen in den Kulturen zu identifizieren.Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette über das Zellsoma zu halten. Verwenden Sie dann einen Kunststoffschlauch, der an der seitlichen Öffnung des Mikropipettenhalters befestigt ist, um sanft zu saugen, um das Neuron in die Glasmikropipette zu aspirieren. Entfernen Sie sofort die Mikropipette mit der Zelle aus der Badelösung und legen Sie die Spitze in eine 0,2-Millimeter-PCR-Röhrchensammlung mit Reaktionspuffer.Brechen Sie die Spitze gegen die Seite des Rohrs in der Nähe des Bodens. Platzieren Sie dann eine sterile 21-Gauge-Spritzennadel auf der Rückseite der Mikropipette und üben Sie Druck aus, um die restliche Flüssigkeit aus der abgebrochenen Spitze der Mikropipette auszustoßen. Zentrifugieren Sie das Entnahmeröhrchen fünf Sekunden lang mit einer Desktop-Mikrozentrifuge und frieren Sie es dann in Trockeneis ein.Während Sie im PCR-Schrank mit Reagenzien auf Eis oder auf einem Kühlblock arbeiten, bereiten Sie den ersten Stamm-Mastermix plus 10 % zusätzliches Volumen bei Raumtemperatur vor. Und ein Mikroliter mit drei Prime-Primern, ein und ein Mikroliter quantifizierte RNA-Spikes in die Probe. Anschließend inkubieren Sie die Probe drei Minuten lang bei 72 Grad Celsius im Thermocycler und legen Sie die Proben dann direkt auf das PCR-Kühlrack.Geben Sie anschließend 5,5 Mikroliter des vorbereiteten Mastermixes in das Reaktionsröhrchen in einem PCR-Kühlgestell und mischen Sie durch leichtes Pipettieren. Nachdem das Röhrchen fünf Sekunden lang zentrifugiert wurde, inkubieren Sie es in einem Thermocycler, der auf die jetzt auf dem Bildschirm angezeigten Parameter eingestellt ist. Um die cDNA des ersten Strangs zu reinigen, fügen Sie der Probe 25 Mikroliter wirbelnder magnetischer Kügelchen bei Raumtemperatur hinzu.Mischen Sie, indem Sie das gesamte Volumen mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren. Dann acht Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, damit die cDNA an die Kügelchen binden kann. Legen Sie dann die Proben und magnetischen Kügelchen auf die magnetische Trennvorrichtung, bis die Flüssigkeit vollständig klar erscheint und keine Kügelchen mehr im Überstand vorhanden sind.Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Drehen Sie die Probe fünf Sekunden lang, um die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens aufzufangen. Legen Sie die Proben für 30 Sekunden auf die magnetische Trennvorrichtung.Entfernen Sie dann mit der P10-Pipettierer alle verbleibenden Überstände, sodass nur die Kügelchen mit gebundener DNA übrig bleiben. Fügen Sie 50 Mikroliter des ds-cDNA-PCR-Mastermixes hinzu und führen Sie dann das PCR-Programm für die Zweitstrangsynthese durch, um die doppelsträngige cDNA zu erhalten. Dieses Histogramm zeigt die Anzahl der proteinkodierenden Gene, die in dopaminergen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsbibliotheken nachgewiesen wurden, die aus TH-eGFP-positiven Zellen in Fragmenten pro Kilobase Transkript pro Million kartierter Reads erzeugt wurden.6.000 bis 8.000 Proteingene wurden in den Einzelzellbibliotheken nachgewiesen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in vier bis fünf Wochen durchgeführt werden, einschließlich der Zeit für die Ableitung der Zellen, die Reifung der Zellen in Kultur, die Zellernte und die Schritte zur Bibliotheksgenerierung, die Sequenzierung der Bibliotheken und die vorläufige Analyse. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, einen RNAse-freien Arbeitsbereich für die Generierung der RNA-Suchbibliothek und die Zellernte zu haben, sterile Techniken während der Zellkultivierung beizubehalten und Pipetten mit entsprechend großem Durchmesser für die Einzelzellernte herzustellen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines Abzugshaubes, die Vermeidung von Haut- und Augenkontakt, das Halten von Hitze und offenen Flammen sowie das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzkleidung immer getroffen werden sollten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Genexpression und Gennetzwerkanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. wie sich medikamentöse Behandlungen auf die Proteinexpression in dopaminergen Zellen auswirken.

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Neurowissenschaften

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Dopaminerge Neuronen spielen eine wichtige regulatorische Rolle im Gehirn. Ihr Verlust wird mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. In diesem Video zeigen wir, wie Primärkulturen von zentralen dopaminergen Neuronen aus embryonalem Mausmesencephalon erzeugt werden können. Solche Kulturen sind nützlich, um die extreme Anfälligkeit dieser Neuronen gegenüber verschiedenen Belastungen zu untersuchen.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

Eine Methode zur Reaktivierung ruhender neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen wurde etabliert. Mit dieser Methode kann die Rolle systemischer Signale von gewebeintrinsischen Signalen bei der Regulation der Ruhe, des Eintritts und des Austritts neuronaler Stammzellen entkoppelt werden.

Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen

Dieses Protokoll beschreibt die Zellkultivierung menschlicher dopaminerger Neuronen im Mittelhirn, gefolgt von immunologischen Färbungen und der Generierung neuronaler phänotypischer Profile aus aufgenommenen mikroskopischen High-Content-Bildern, die die Identifizierung phänotypischer Variationen aufgrund genetischer oder chemischer Modulationen ermöglichen.

Phänotypisches Profiling von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen dopaminergen Neuronen im Mittelhirn

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Diese Studie präsentiert eine robuste Methode zur Isolierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraneinsätze, wodurch die Trennung von totalen Neuronen versus Neuriten und RNA-Reinigung ermöglicht wird. In Kombination mit RTddPCR ermöglicht der Ansatz eine absolute Quantifizierung von Low-Copy-Transkripten, was Studien zum mRNA-Transport und der lokalen Übersetzung mit hoher Sensitivität, Reproduzierbarkeit und breiter experimenteller Anwendbarkeit erleichtert.

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

Erfahren Sie, wie Sie lebende dopaminerge Neurone in Mittelhirnkulturen mithilfe von TH-getriebener eGFP-Expression und RNA-Sequenzierung zuverlässig identifizieren. Diese Methode ermöglicht Genexpressionsanalysen bei Parkinson-Forschung.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression (Video) | JoVE Journal

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

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