Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die zuverlässige Identifizierung lebender dopaminerger Neuronen in Mittelhirnkulturen durch Tyrosinhydroxlase-gesteuerte eGFP-Expression, Einzelzellernte und RNA-Sequenzierungsbibliotheksgenerierung. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Parkinson und Drogenabhängigkeit zu beantworten, da sie es ermöglicht, Genexpressions- und elektrophysiologische Assays an identifizierten lebenden dopaminergen Neuronen in Kultur durchzuführen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Möglichkeit bietet, lebende und nicht fixierte dopaminerge Neuronen in primären ventralen mesencephalen Kulturen zuverlässig zu identifizieren.

Den ersten Teil des Verfahrens wird Charlene Kim, eine Technikerin aus dem Labor von Henry Lester, vorführen. Beginnen Sie damit, den Kopf eines Mausembryos mit einer Pinzette zu stabilisieren, die fest auf der Schnauze sitzt, so dass die Rückenfläche zugänglich ist. Mit einer Pinzette, die man in der anderen Hand hält, die Hautschicht und den Schädel kurz vor dem Kamm des Mesencephalons zusammendrücken und die Haut und den Schädel entlang der Mittellinie caudelly zurückziehen.

Platzieren Sie die Pinzette um den Kamm, mit einer Spitze zwischen der Rinde und dem Mesoncephalon und der anderen über dem Kleinhirn. Kneifen und entfernen Sie das gesamte Mittelhirn. Platzieren Sie das Mittelhirn in einer Petrischale mit kaltem HBSS unter einem Präpariermikroskop.

Drehen Sie unter dem Präpariermikroskop das Hirnsegment um, so dass nun die ventrale Seite zugänglich ist. Es sind nun vier Quadranten sichtbar. Entfernen Sie alle Hirnhäute und Gefäße, indem Sie die Hirnhäute vorsichtig mit einer Pinzette greifen und nach oben vom Gehirn weg ziehen.

Als nächstes platzieren Sie eine Zange mit einer Pinzette in den Ventrikel ungefähr in der Mitte des Segments. Um das Mittelhirn zu trennen, kneifen Sie dorsal und kneifen Sie dann medial auf jeder Seite. Nehmen Sie die unteren beiden Quadranten, indem Sie auf beiden Seiten seitliche Schnitte machen.

Der ventrale tegmentale Bereich und die Substantia nigra pars compacta befinden sich im ventralen unteren Abschnitt, der dicht erscheint. Legen Sie das präparierte Gewebe, das sowohl VTA als auch SNC enthält, in frisches HBSS in einen separaten Bereich der Petrischale. Nachdem Sie alle Gehirnsegmente seziert haben, verwenden Sie eine Pinzette und ein Skalpell mit der Nummer 11, um jeden Mittelhirnabschnitt in etwa gleich große Stücke zu vierteln.

Verwenden Sie dann eine P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung, um alle geviertelten Mittelhirnsegmente in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Nachdem Sie das Gewebe abgesetzt und das HBSS entfernt haben, fügen Sie 500 Mikroliter Papainlösung hinzu. In einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad 15 Minuten lang inkubieren.

Nach der Inkubation verwenden Sie eine P1000-Spitze mit breiter Bohrung, um nur die Mittelhirnsegmente in ein Ein-Milliliter-Aliquot DNase I-Lösung zu überführen, und lassen Sie die Segmente am Boden des Röhrchens absetzen. Übertragen Sie dann nur die Mittelhirnsegmente in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Kaltstopplösung. Ersetzen Sie die zweite Spülung durch einen Milliliter frischer Stopplösung und pipettieren Sie mit einer P1000-Pipettenspitze siebenmal auf und ab, um die Zellen zu verreiben.

Unterlegen Sie dann die Zellsuspension, indem Sie langsam 200 Mikroliter 4%ige BSA-Lösung in den Boden des Röhrchens pipettieren. Nach einer Zentrifugation bei 280 x g für sechs Minuten wird der Überstand mit einem P1000 aspiriert und die Zellen in einem Milliliter Plattierungsmedium resuspendiert. Führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer durch und verdünnen Sie dann die Zellsuspension auf 1000 Zellen pro Mikroliter mit Plattierungsmedium.

120 Mikroliter der Zellsuspension werden unmittelbar nach dem Aspirieren von Laminin auf mit Poly-D-Lysin, Poly-L-Ornithin und Laminin beschichtete Kulturschalen aufgetragen, um sicherzustellen, dass die Beschichtung nicht austrocknet und eine unebene Oberfläche bildet. Dann, nach einer Stunde Inkubation, geben Sie vorsichtig drei Milliliter Kulturmedium in einen nicht besiedelten Bereich der Kulturschale, um die Zerstörung der Zellen zu minimieren. Spülen Sie die Kulturschale nach dreiwöchiger Kultivierung mit zwei Millilitern RNase-freiem Dulbecco's PBS aus.

Entfernen Sie das DPBS. Dann für die Ernte durch einen Milliliter frisches DPBS ersetzen. Verwenden Sie das GFP-Filterset und das 40X-Objektiv an einem inversen Epifluoreszenzmikroskop, um fluoreszierende TH-positive Neuronen in den Kulturen zu identifizieren.

Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette über das Zellsoma zu halten. Verwenden Sie dann einen Kunststoffschlauch, der an der seitlichen Öffnung des Mikropipettenhalters befestigt ist, um sanft zu saugen, um das Neuron in die Glasmikropipette zu aspirieren. Entfernen Sie sofort die Mikropipette mit der Zelle aus der Badelösung und legen Sie die Spitze in eine 0,2-Millimeter-PCR-Röhrchensammlung mit Reaktionspuffer.

Brechen Sie die Spitze gegen die Seite des Rohrs in der Nähe des Bodens. Platzieren Sie dann eine sterile 21-Gauge-Spritzennadel auf der Rückseite der Mikropipette und üben Sie Druck aus, um die restliche Flüssigkeit aus der abgebrochenen Spitze der Mikropipette auszustoßen. Zentrifugieren Sie das Entnahmeröhrchen fünf Sekunden lang mit einer Desktop-Mikrozentrifuge und frieren Sie es dann in Trockeneis ein.

Während Sie im PCR-Schrank mit Reagenzien auf Eis oder auf einem Kühlblock arbeiten, bereiten Sie den ersten Stamm-Mastermix plus 10 % zusätzliches Volumen bei Raumtemperatur vor. Und ein Mikroliter mit drei Prime-Primern, ein und ein Mikroliter quantifizierte RNA-Spikes in die Probe. Anschließend inkubieren Sie die Probe drei Minuten lang bei 72 Grad Celsius im Thermocycler und legen Sie die Proben dann direkt auf das PCR-Kühlrack.

Geben Sie anschließend 5,5 Mikroliter des vorbereiteten Mastermixes in das Reaktionsröhrchen in einem PCR-Kühlgestell und mischen Sie durch leichtes Pipettieren. Nachdem das Röhrchen fünf Sekunden lang zentrifugiert wurde, inkubieren Sie es in einem Thermocycler, der auf die jetzt auf dem Bildschirm angezeigten Parameter eingestellt ist. Um die cDNA des ersten Strangs zu reinigen, fügen Sie der Probe 25 Mikroliter wirbelnder magnetischer Kügelchen bei Raumtemperatur hinzu.

Mischen Sie, indem Sie das gesamte Volumen mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren. Dann acht Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, damit die cDNA an die Kügelchen binden kann. Legen Sie dann die Proben und magnetischen Kügelchen auf die magnetische Trennvorrichtung, bis die Flüssigkeit vollständig klar erscheint und keine Kügelchen mehr im Überstand vorhanden sind.

Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Drehen Sie die Probe fünf Sekunden lang, um die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens aufzufangen. Legen Sie die Proben für 30 Sekunden auf die magnetische Trennvorrichtung.

Entfernen Sie dann mit der P10-Pipettierer alle verbleibenden Überstände, sodass nur die Kügelchen mit gebundener DNA übrig bleiben. Fügen Sie 50 Mikroliter des ds-cDNA-PCR-Mastermixes hinzu und führen Sie dann das PCR-Programm für die Zweitstrangsynthese durch, um die doppelsträngige cDNA zu erhalten. Dieses Histogramm zeigt die Anzahl der proteinkodierenden Gene, die in dopaminergen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsbibliotheken nachgewiesen wurden, die aus TH-eGFP-positiven Zellen in Fragmenten pro Kilobase Transkript pro Million kartierter Reads erzeugt wurden.

6.000 bis 8.000 Proteingene wurden in den Einzelzellbibliotheken nachgewiesen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in vier bis fünf Wochen durchgeführt werden, einschließlich der Zeit für die Ableitung der Zellen, die Reifung der Zellen in Kultur, die Zellernte und die Schritte zur Bibliotheksgenerierung, die Sequenzierung der Bibliotheken und die vorläufige Analyse. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, einen RNAse-freien Arbeitsbereich für die Generierung der RNA-Suchbibliothek und die Zellernte zu haben, sterile Techniken während der Zellkultivierung beizubehalten und Pipetten mit entsprechend großem Durchmesser für die Einzelzellernte herzustellen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines Abzugshaubes, die Vermeidung von Haut- und Augenkontakt, das Halten von Hitze und offenen Flammen sowie das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzkleidung immer getroffen werden sollten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Genexpression und Gennetzwerkanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. wie sich medikamentöse Behandlungen auf die Proteinexpression in dopaminergen Zellen auswirken.