Experimentelles Protokoll zum Nachweis Cyanobakterien In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Vorhandensein mehrerer Cyanobakterienstämme in flüssigen und festen Proben mit Hilfe eines Fluoreszenz-Microarray-Immunoassays zu bestimmen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in den Bereichen Umwelt, Überwachung und Wassermanagement zu beantworten, wie z. B. das Vorhandensein von Toxinen, die Protoxine produzierende Bakterien produzieren, bevor die Blüten mit bloßem Auge sichtbar werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere Cyanobakterienstämme und mehrere Proben gleichzeitig in einem Zeitraum von drei bis vier Stunden überwacht werden können, sowohl in situ als auch im Labor.

Diese Methoden können also Einblicke in die Artenvielfalt geben. Es kann auch in anderen Bereichen eingesetzt werden, z. B. bei der Überwachung landwirtschaftlicher Anlagen, bei der Erkennung von Leben in Belastungsumgebungen oder bei der Planetenerkundung. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, keine Schwierigkeiten haben.

Wegen der Einfachheit in der Probenverarbeitung und der einfacheren Interpretation der Ergebnisse. Nach der Herstellung und Reinigung von Antikörpern gemäß dem Textprotokoll werden 100 Mikroliter DMSO in ein handelsübliches Fläschchen gegeben, das einen Farbstoff für die Markierung enthält, ein Milligramm Protein. Sobald der Farbstoff aufgelöst ist, markieren Sie die gereinigten Antikörper, indem Sie zwei Mikroliter des Farbstoffs zu 50 Mikrolitern jeder Antikörperzubereitung hinzufügen.

Die Markierungsreaktionen werden eine Stunde lang unter kontinuierlichem Rühren auf einer vibrierenden Plattform bei Raumtemperatur gehalten. Nach der Aufreinigung der markierten Antikörper gemäß dem Textprotokoll wird ein kleines Aliquot in ein Spektralphotometer geladen und die Absorption bei 280 und 650 Nanometern gemessen. Berechnen Sie die Effizienz der Etikettierung, indem Sie den Empfehlungen des Lieferanten folgen.

Um einen CYANOCHIP herzustellen, bereiten Sie 30 Mikroliter jedes gereinigten Antikörpers vor, indem Sie ein Milligramm pro Milliliter Antikörper in einem 1X-Proteindruckpuffer mit 01 % Volumen pro Volumen Tween 20 mischen. Bereiten Sie 30 Mikroliter der folgenden Drucklösungen als Kontrollen vor. 1X Proteindruckpuffer mit 01% Volumen pro Volumen von Tween 20.

Jedes Protein Ein gereinigtes Präimmunserum in einer Menge von einem Milligramm pro Milliliter in 1X Proteindruckpuffer mit 01 % Tween 20 und ein Millgramm pro Milliliter BSA und 1X Proteindruckpuffer mit 01 % Tween 20. Geben Sie 30 Mikroliter der vorbereiteten Drucklösungen pro Well in die hochwertigen 384-Well-Mikroplatten. Nachdem Sie den Druckroboter und die Objektträgersubstrate gemäß dem Textprotokoll eingerichtet haben, spotten Sie alle Antikörper und die Kontrollen in einem dreifachen Spotmuster mit einem Spotdurchmesser von etwa 180 bis 200 Mikrometern auf die Objektträger.

Verwenden Sie für die Probenahme in der Umgebung eine sterile Spritze, um ein bis 100 Milliliter Flüssigkeit zu sammeln, und konzentrieren Sie die Zellen, indem Sie die Probe durch einen Filter mit einer Porengröße von drei Mikrometern leiten. Entnehmen Sie bei Bedarf feste Proben aus Gesteinen oder Böden und bewahren Sie sie in sterilen Röhrchen auf. Die Proben können in einem kleinen Feldlabor untersucht werden.

Fügen Sie einen Milliliter Extraktionsinkubationspuffer hinzu, um die im Filter gesammelte Biomasse zurückzugewinnen, und kratzen Sie den Filter mit einem Spatel in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Mit einem tragbaren Ultraschallprozessor oder durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren aggregieren und homogenisieren diese die Probe. Wiegen Sie zusätzlich bis zu 0,5 Gramm der festen Probe in einem separaten 10-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie bis zu zwei Milliliter Extraktionspuffer hinzu.

Tauchen Sie eine Ultraschallsonde in das Rohr und beschallen Sie sie mit einem tragbaren Ultraschallprozessor oder einem anderen Ultraschallgerät. Während Sie die Probe auf Eis halten, führen Sie mindestens fünf 30-Sekunden-Zyklen bei 30 Kilohertz durch und halten Sie zwischen den Beschallungen 30 Sekunden lang an. Um einen Filtratextrakt für den Immunoassay herzustellen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einem Nylonfilterhalter mit einer Porengröße von fünf bis 20 Mikrometern gekoppelt ist, um die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zu filtrieren, um Sand, Ton und anderes grobes Material zu entfernen.

Legen Sie den Objektträger mit den Microarray-Spots nach unten auf einen 100 bis 200 Mikroliter großen Tropfen Blockierungslösung und inkubieren Sie ihn drei bis fünf Minuten lang. Nehmen Sie den Objektträger vorsichtig mit einer Pinzette mit Kunststoffspitze und unter Vermeidung der Microarray-Zonen auf. Tauchen Sie den Objektträger in eine frische Blocklösung und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang unter leichtem Rühren.

Zum Trocknen des Objektträgers legen Sie ihn in eine für Objektträger geeignete Zentrifuge und schleudern Sie ihn kurz. Richten Sie den Objektträger in einer Microarray-Hybridisierungskassette mit drei mal acht Vertiefungen gemäß den Anweisungen des Anbieters ein. Alternativ können Sie nach der Änderung des Antikörper-Druckmusters eine maßgeschneiderte Kassette einrichten, wie die hier gezeigte, oder einfach Abdeckfolien für die Einrichtung verwenden.

Nach dem Zusammenbau von Objektträger und Kassette pipettieren Sie bis zu 50 Mikroliter jedes Probenextrakts oder verdünnen Sie ihn in Extraktionsinkubationspuffer in jede Vertiefung der Kassette. Alternativ können Sie die Proben in andere Inkubationsgeräte laden oder einfach Objektträger verwenden. Pipettieren Sie als Blindkontrolle 50 Mikroliter TBSTRR-Puffer in mindestens zwei separate Vertiefungen der Kassette.

Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur und mischen Sie sie alle 15 Minuten durch Pipettieren oder inkubieren Sie sie 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Um die Microarrays zu waschen, setzen Sie die Kassette ab und klopfen Sie sie vorsichtig auf sauberes, saugfähiges Papier. Waschen Sie dann die Vertiefungen, indem Sie jeweils 150 Mikroliter Extraktionsinkubationspuffer hinzufügen, und entfernen Sie den Puffer, indem Sie wie zuvor auf saugfähiges Papier klopfen.

Wiederholen Sie die Wäsche noch dreimal. Geben Sie in jede Vertiefung 50 Mikroliter des fluoreszierenden Antikörpergemisches, das die 17 Antikörper des Anti-Cyanobakterienstamms enthält. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei Umgebungstemperatur oder 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Um die Microarrays zu waschen, setzen Sie die Kassette vorsichtig ab und klopfen Sie sie vorsichtig auf sauberes, saugfähiges Papier. Fügen Sie dann 150 Mikroliter Extraktionsinkubationspuffer hinzu, bevor Sie ihn durch Klopfen auf ein Papiertuch entfernen. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal.

Zerlegen Sie dann die Kassette und tauchen Sie den Objektträger für eine schnelle Spülung in 0,1-fache PBS-Lösung. Zentrifugieren Sie schnell wie zuvor, um den Objektträger zu trocknen. Scannen Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenzscanner auf Fluoreszenz bei maximaler Emissionsspitze für dunkelroten Fluoreszenzfarbstoff.

Nehmen Sie mehrere Bilder der Microarrays mit unterschiedlichen Scanparametern auf, indem Sie den Verstärkungswert ändern. Laden Sie abschließend das Raster, quantifizieren Sie, verarbeiten und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Der in diesem Video gezeigte CYANOCHIP-Multiplex-Immunoassay wurde verwendet, um die gleichzeitige Identifizierung der wichtigsten Süßwasser-Cyanobakterienarten zu testen, die in dieser Tabelle aufgeführt sind.

Wasserproben, die am Ufer eines Süßwasserreservoirs entnommen wurden, wurden mit dem Microarray-Assay analysiert. Die wichtigsten positiven Immunreaktionen entsprachen Antikörpern gegen planktonische Cyanobakterien, microcystis-Spezies und gegen benthische Leptolyngbya-Spezies. Niedrigere Fluoreszenzsignale wurden für planktonische Nostocales Aphanizomenon-Arten, Anabaena-Arten, Microcystis flos-aquae und die benthischen Rivularia-Arten erhalten.

Der Microarray wurde auch validiert, indem eine antarktische trockene mikrobielle Matte untersucht wurde, um das Vorhandensein von Cyanobakterienmarkern zu testen. Positive Reaktionen der Antikörper wurden auf die benthischen Cyanobakterien, Anabaena-Spezies und Leptolyngbya-Spezies hervorgerufen. Weitere positive Immunreaktionen wurden mit Antikörpern gegen planktonische Cyanobakterien wie Microcystis-Spezies, Aphanizomenon-Spezies und Planktothrix rubescens-Spezies nachgewiesen.

Schließlich wurden diese Signale von Antikörpern gegen andere benthische Spezies gewonnen, darunter Tolypothrix-Spezies und Anabaena-Spezies. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, ohne Antikörperproduktion und Nivellierung. Durch die gleichzeitige Inkubation von Probe und fluoreszierenden Antikörpern kann eine Stunde eingespart werden.

Beim Versuch dieser Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das fluoreszierende Antikörpergemisch mit seinem Antikörper in seiner optimalen Arbeitsverdünnung vorzubereiten. Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Methoden, wie optische Mikroskopie oder DNA-Extraktion und eine spezifische PCR-Amplifikation, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Bodenkonzentration oder die Art des nachgewiesenen Stammes. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern im Bereich der Umweltüberwachung den Weg ebnen, um Gewässer, in Bikulturprozessen, im Süßwassermanagement oder in mikrobiellen Ökologiestudien zu erforschen, unabhängig von der Art der Probe.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Antikörper mit Fluoreszenz markiert, Antikörper-Microarrays manipuliert, Multiplex-Immunoassays durchführt und Microarray-Immunoassay-Ergebnisse analysiert und interpretiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ultraschall gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieser Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Gehörschutzvorrichtungen oder andere spezifische Pflegemaßnahmen getroffen werden sollten.