Name: In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Erfahren Sie die antimikrobielle Blaulichttherapie zur Behandlung multiresistenter Acinetobacter baumannii-Infektionen in Maus-Verbrennungsmodellen. Diese nicht-antibiotische Methode nutzt Biolumineszenz-Bildgebung zur Evaluierung.

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Diese Arbeit wurde teilweise vom Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) im Rahmen des U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT Nr. 14-1894 bis TD) und den National Institutes of Health (1R21AI109172 bis TD) unterstützt. YW wurde durch ein ASLMS Student Research Grant (BS. S02.15). Wir danken Tayyaba Hasan, PhD am Wellman Center, für ihre Co-Mentorenschaft für YW.

1. Herstellung von Bakterienkultur <ol><li> 7.5 ml Brain Heart Infusion (BHI) -Medium in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Seed A. baumannii Zellen in dem BHI - Medium und dann Inkubieren der Kultur A. baumannii in einem Orbital - Inkubator (37 ° C) für 18 h. </li><li> Zentrifugieren der Kultur von Zellen bei 3.500 × g für 5 min, um den Überstand entfernen, und wasche die Pellets in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Re-suspend der Bakterienpellets in frischem PBS und gründlich die Suspension pipettieren. </li><li> Sammeln Sie 100 ul der Bakteriensuspension und macht eine Verdünnung von 1:10 mit frischem PBS. </li><li> Übertragen der Verdünnung in ein 1,5 ml halb Mikroküvette und Messen der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600 nm). </li><li> Berechnen Sie die OD 600 nm der ursprünglichen (unverdünnt) Suspension in PBS entsprechend den gemessenen OD600 nm Wert der Verdünnung und der Verdünnungsfaktor (10). </li><li> Stellen Sie the ursprüngliche Suspension in PBS 600-nm bis OD = 0,6 (auf eine Zelldichte von 10 8 CFU / ml entspricht). </li></ol> 2. Maus - Modell der Burn - Infektion verursacht durch Biolumineszenz A. baumannii <ol><li> Verwenden erwachsene weibliche Balb / c-Mäuse im Alter von 7-8 Wochen und mit einem Gewicht von 17-19 g. Lassen Sie die Mäuse für mindestens 3 Tage vor Beginn des Experiments an die Laborbedingungen akklimatisiert. Pflegen Sie die Mäuse in einem 12 h Licht / Dunkel - Zyklus unter einer Raumtemperatur von 21 ℃ und gibt ihnen Nahrung und Wasser ad libitum. </li><li> Anesthetize die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin eines Cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). leicht berühren die Palpebra jeder Maus mit einem Wattestäbchen; ein Fehlen des palpebralen Reflexes schlägt eine geeignete Narkosetiefe. Deckt die Maus Augen mit VET Salbe auf die Augen vor dem Austrocknen während der Anästhesie zu verhindern. </li><li> Shave die Mäuse auf der Rückseite so viel Haut wie möglich zu belichten durch Verwendung eines 50-Blatt Haarschneider. </li><li> Setzen Sie den Deckel einer 35 mm-Petrischale unter den Bäuchen der Mäuse in einer relativ horizontalen Position mit dem Rücken zu halten. </li><li> Boil Wasser in einem 250 ml Becherglas (80% gefüllt) unter Verwendung einer 10&quot; x 10&quot; , 220 VAC Heizplatte. Tauchen einen Messingblock (1 cm x 1 cm Querschnitt) in den Becher bis zum thermischen Gleichgewicht mit dem Wasser erreicht ist. Thermische Äquilibrierung dauert in der Regel &lt;5 min und wird durch den erneuten Sieden des Wassers im Becherglas angegeben. </li><li> Vor der Brandverletzung zu schaffen, verwalten präemptive Analgetika (eine subkutane Injektion von 0,1 mg / kg Buprenorphin) zur Schmerzlinderung. </li><li> Zehn Minuten nach der präemptive Analgetika, drücken Sie vorsichtig den beheizten Messingblock auf die rasierte Fläche auf der Rückseite der Mäuse für 7 s Brandwunden zu induzieren. HINWEIS: Um die thermische Schädigung des Arbeitspersonal, trägt wärmebeständige Handschuhe, wenn die Durchführung den Brennvorganges zu vermeiden. </li><li> Administrieren 0,5 ml steriler Kochsalzlösung durch subcutaneous Injektion zu verhindern Austrocknung. </li><li> Fünf Minuten nach der Induktion der thermischen Verletzung, beimpfen 50 &amp; mgr; l der Bakteriensuspension mit 5 x 10 6 CFU in PBS auf die Maus Verbrennungen mit einer Pipette. Durch Bewegen einen sterilen Baumwolltupfer in einer Zick-Zack-Bewegung auf der Haut, schmieren die Aliquote auf den Verbrennungen so gleichmäßig wie möglich um die Bakterienzellen in dem verbrannten Bereich zu verteilen. </li><li> Unmittelbar nach dem bakteriellen Inokulation Biolumineszenz-Bildgebung für die infizierte Verbrennungen zuführen, wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Platzieren Sie die Mäuse auf einem wasserbeheizten chirurgisches Bett (37 ° C, Wiederherstellungsbereich), bis die Mäuse vollständig von der Anästhesie erholt haben. Haus der Mäuse mit einer maximalen Anzahl von 5 pro Käfig in einem Biosafety Level-2 Tierraum. </li><li> Verabreichen Analgetika (subkutane Injektion von 0,1 mg / kg Buprenorphin) zweimal täglich für die ersten drei Tage nach der Brandverletzung. </li></ol> 3. Antimikrobielle Blau - Licht - Therapie für A. &amp; #160; baumannii Infektion bei Mäusen <ol><li> Starten Sie abl Therapie bei 24 h nach Bakterieninokulation. </li><li> Verwenden, um eine Leuchtdiode (LED) mit einer Spitzenemission bei 415 nm für die abl-Bestrahlung. Die LED auf einem Kühlkörper Mount in Mäusen 18 thermische Effekte auf dem bestrahlten Bereich zu verhindern. Fix die LED auf eine optische Haltestange mit Clip-Anschlüssen der LED zu ermöglichen, nach oben und unten. </li><li> Schalten Sie die Energie / Energiezähler und drücken Sie die Taste Wellenlänge 415 nm zu wählen. Setzen Sie den Strom- / Energiezähler den Hintergrund (Umgebungslicht) zu subtrahieren. </li><li> Setzen Sie die Strom- / Energiezähler direkt unter der LED. Tragen Sie blaues Licht Schutzbrille. Schalten Sie das LED-Licht und stellen den Abstand zwischen der LED-Öffnung (eine Linse, die das Licht von der LED konvergiert) und dem Lichtsensor (2 cm Durchmesser) der Strom- / Energiezähler, so dass der Lichtfleck bedeckt den gesamten Bereich der der Lichtsensor. </li><li> Sorgfältig Melodie der LED-Treiber und das Lesen des powe aufzeichnenr / Energiezähler. Berechnen der Bestrahlungsstärke nach dem Lesen: Bestrahlungsstärke = Lese (W) / Fläche (cm 2) ist . Stellen Sie die Bestrahlungsstärke der LED bis 100 mW / cm2 durch die LED-Treiber-Tuning. </li><li> Schalten Sie die LED. Den Abstand zwischen der LED-Apertur und dem Lichtsensor der Leistung / Energiezähler. </li><li> Anesthetize die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin eines Cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). Ein Fehlen des palpebralen Reflexes schlägt eine geeignete Narkosetiefe. </li><li> Dividieren zufall die Mäuse in eine abl-behandelten Gruppe (n = 10) und eine unbehandelte Kontrollgruppe (n = 10). </li><li> Für die abl-behandelten Gruppe, decken die Augen von Mäusen mit einer Aluminiumfolie übermäßiges Licht zu vermeiden. Platzieren Sie die Maus Verbrennungen direkt unter der LED, mit dem Deckel einer 35-mm-Petrischale unter dem Maus Abdomens ihren Rücken in einer horizontalen Position zu halten. </li><li> Ersetzen die Leistungs- / Energiezähler in Schritt 3.5 erwähnt mit einer Maus auf einem quadratischen di PetriSch. Stellen Sie die Höhe der Maus wieder in eine Position, wo der Abstand zwischen der LED-Öffnung und der Oberfläche der Maus burn ist gleich die zwischen der LED-Öffnung und dem Pegel des Lichtsensors der Strom- / Energiezähler (wie in Schritt diskutiert 3.5). </li><li> Bestrahlen der infizierten Verbrennungen bei einer Strahlungsintensität von 100 mW / cm 2. Liefern abl in Dosen von 72 J / cm 2 bis zu einer Gesamtdosis von 360 J / cm 2 erreicht ist (beispielsweise 0, 72, 144, 216, 288 und 360 J / cm 2). Nach jeder Lichtdosis, führen Biolumineszenz-Bildgebung für die Mäuse, wie in Abschnitt 4 besprochen. </li><li> Für die unbehandelte Kontrollgruppe, Biolumineszenz-Bildgebung der Maus Verbrennungen zuführen, wie in Abschnitt 4 beschrieben, wobei die gleichen Zeitintervalle, wie für die abl-behandelten Gruppe verwendet. </li><li> Vor der Wiederherstellung der Mäuse, legen Sie die Mäuse auf dem Wasser heizt chirurgische Bett Wärmeverlust und Unterkühlung zu verhindern. Beachten Sie die Aktivität und die Augenlidreflexe der Mäuse bis zur Genesung. Nach The Erholung der Mäuse, beherbergen sie 2-3 pro Käfig. </li><li> Nach Abl-Therapie, Biolumineszenz-Bildgebung durchführt, wie in Abschnitt 4, täglich für die ersten 3 Tage und dann an wechselnden Tagen diskutierten die zeitliche bio-Belastung von Infektionen in Mäusen zu überwachen. </li></ol> 4. Biolumineszenz-Bildgebung von Infektionen bei Mäusen <ol><li> Bild der Mäuse ein Schwachlichtabbildungssystem , das eine verstärkte ladungsgekoppeltes Bauelement - Kamera 19, eine Kamerasteuereinrichtung, eine Probenkammer, und einen Bildprozessor umfasst. </li><li> Anesthetize die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin eines Cocktail (100 mg / kg - 20 mg / kg). leicht berühren die Augenlid der Mäuse mit einem Wattestäbchen; ein Fehlen des palpebralen Reflexes schlägt eine geeignete Narkosetiefe. </li><li> Starten Sie die Live-Imaging-Software. In der Systemsteuerung, das angezeigt wird, klicken Sie auf Initialisieren. Warten, bis sich die Farbe des Temperatur-Box grün wird, das anzeigt, dass die Temperatur der Stufein der Probenkammer hat 37 ° C erreicht. </li><li> Platzieren Sie die Mäuse auf der Bühne (37 ° C) in der Probenkammer des Bildgebungssystems, mit den infizierten Verbrennungen direkt unter der Kamera. HINWEIS: Die Biolumineszenz der Bakterien könnte verringern, wenn die Verbrennungen trocken werden. Daher ist es empfehlenswert, bevor die Abbildung der Maus brennt mit PBS zu befeuchten. </li><li> In der Systemsteuerung, setzen Sie ein Häkchen neben „Lumineszenz“. Wählen Sie „Automatische Belichtung“, so dass die Belichtungszeit für die Bildgebung wird durch die Live-Imaging-Software auf der Biolumineszenz Intensität optimal angepasst werden. </li><li> Wählen Sie &quot;C&quot; aus der &quot;Field of View&quot; Drop-Down-Liste. Wählen Sie die „Scan im mittleren Bereich“ Option die Software bestimmt die Brennweite zu lassen. Setzen Sie ein Häkchen neben Overlay. </li><li> Klicken Sie auf „Erfassen“, um das Bild zu erfassen. In der „Bild bearbeiten Etikett“ -Box, klicken Sie auf „OK“; ein „Bildfenster“ und „Toll Palette“ erscheinen. </li><li> Set Auto ROI Parameter für die automatische Auswahl. </li><li> Quantifizierung der Biolumineszenz - Intensität als relative Lumineszenz - Einheiten (RLU) und zeigt die Biolumineszenz in einer Falschfarbenskala von rosa Bereich (intensivsten) bis blau ( am wenigsten intensiv) 19, 20. </li><li> Berechnen der Überlebensfraktion der Bakterien in Maus Verbrennungen an Stellen unterschiedlicher Zeit basierend auf Biolumineszenz Intensitätsanalyse. Der Überlebensanteil von Bakterien zu einem gegebenen Zeitpunkt der Biolumineszenz = Intensität zu diesem Zeitpunkt / die Biolumineszenz gemessene Intensität gemessen unmittelbar vor abl Belichtungs 17. </li></ol> 5. Euthanasie der Mäuse <ol><li> Die Endpunkte des Experiments sind wie folgt: (a) Auflösung der Infektion, wie durch den Verlust der Biolumineszenz nachgewiesen, wie durch Bildgebung bestimmt; (B) Auftreten von systematische Infektionen, wie durch die Verbreitung von Biolumineszenz außerhalb des verbrannten angegeben sindein; (C) Verlust von ≥15% des Körpergewicht im Vergleich zu normalen altersangepassten Mäusen oder das Leid von Schmerzen und Leiden, wie durch das Fehlen einer Reaktion auf manuelle Stimulation angegeben, Immobilität, die Unfähigkeit, zu essen oder zu trinken. Während der Studie, wenn wir in eine Situation kommen, wo wir nicht sicher sind, ob eine Maus vollständig den Status der moribund erreicht hat, wie nach unserer Definition umrissen, und / oder sind wir nicht sicher, ob wir es einschläfern müssen, werden wir einen CCM Veterinärpersonal kontaktieren für einen Aktionsplan; (D) sonst die Mäuse werden 30 Tage nach dem Beginn der Studie eingeschläfert. </li><li> Verlagern die Mäuse in geschlossenen Käfigen speziell für Euthanasie und die Mäuse euthanize von Kohlendioxid (CO 2) komprimiertes Gas in den Käfigen zu liefern. <ol><li> Öffnen des CO 2 -Tank oder Ventilregler den Gasstrom einzuleiten. Stellen Sie sicher, dass der Regler den richtigen psi liest (Pfund pro Quadratzoll), basierend auf Anweisungen von der Einheit geschrieben, und stellen Sie die Wiedergulator auf den richtigen psi je nach Bedarf, in der Regel nicht höher als 5 psi. </li><li> Füllen Sie langsam. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte nicht mehr als 30% der Kammer / Käfig Volumen pro min (, für eine Rattenkäfig, ~ 7,5 L / min für eine typische Maus Käfig, ~ 2 L / min) verdrängen. </li><li> Wartezeit von ca. 3-5 min für das Tier zu stoppen, zu bewegen oder zu atmen; Die Augen sollten festgelegt und erweitert werden. Ausschalten CO 2 -Tank oder Regulierventil die Strömung von CO 2 zu stoppen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Herz durch das Gefühl der Brust zwischen Daumen und Zeigefinger nicht zu schlagen ist. Stellen Sie sicher, dass es keine Blinkreflex ist der Augapfel durch Berühren. <ol><li> Wenn es ein Herzschlag oder Lidschlussreflexes ist, wiederholen Sie die Euthanasie Prozess oder eine Schere verwenden, um die Brusthöhle zu öffnen, einen Pneumothorax zu schaffen (das Tier muss vor der Durchführung dieses Verfahrens zu einem toe pinch nicht reagieren). </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Abl ist ein neues Verfahren zur Behandlung von Infektionen. Seit seinem Wirkungsmechanismus von der Chemotherapie völlig anders ist, ist es eher eine Physiotherapie. Das Mittel, das die antimikrobielle Wirkung vermittelt ist blaue Licht-Bestrahlung (400-470 nm). Mit der Entwicklung von blauen LEDs, gewannen wir den Zugang zu einem effektiven und einfachen lichtbasierten antimikrobiellen Ansatz für MDR-Infektionen. In diesem Protokoll haben wir die Entwicklung eines Mausmodell von burn - Infe...

Brennen Infektionen, die wegen der Haut thermischer Verletzungen häufig gemeldet werden, weiterhin 1 eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität. Das Management von Burn - Infektionen wurde durch die zunehmende Auftreten von multiresistenten (MDR) Bakterienstämmen 2 aufgrund des massiven Einsatz von Antibiotika weiter beeinträchtigt. Ein wichtiger MDR Gram-negative Bakterien ist Acinetobacter baumannii, die bekanntlich mit den jüngsten Kampfwunden in Verbindung gebracht werden und ist beständig gegen fast alle verfügbaren Antibiotika 3. Die Anwesenheit von Biofilmen an dem verletzten Foci wird 4 berichtet, 5 und wird angenommen , dass die Toleranz gegenüber Antibiotika und Wirtsabwehr 6, 7, persistente Infektionen verursacht 8, 9 zu verstärken. Daher ist es eine pressing benötigt für die Entwicklung von alternativen Behandlungen. In der angekündigten Nationalen Strategie vor kurzem für die Bekämpfung von Antibiotika-resistenten Bakterien hat die Entwicklung alternativer Therapeutika gegen Antibiotika als eine Aktion von der Regierung der Vereinigten Staaten 10 zur Kenntnis genommen. Licht basierende antimikrobielle Ansätze, wie der Name schon sagt, erfordern Lichtbestrahlung mit oder ohne andere Mittel. Diese Ansätze schließen antimikrobielle Photodynamischen Therapie (aPDT), UV-C (UVC) Bestrahlung und antimikrobielle blaues Licht (abl). In früheren Studien haben sie vielversprechende Wirksamkeit bei der Abtötung von MDR Bakterienstämmen 11, 12, 13 gezeigt. Unter den drei lichtbasierte Ansätze hat abl Aufmerksamkeit auf sich gezogen in den letzten Jahren zunehmend aufgrund ihrer intrinsischen antibakterielle Eigenschaften ohne die Verwendung von Photosensibilisatoren 14. in comparIson zu aPDT beinhaltet abl nur die Verwendung von Licht, während aPDT eine Kombination von Licht und Photosensibilisator erfordert. Daher ist abl einfach und kostengünstig 14. Im Vergleich zu UVC wird abl glaubt viel weniger zytotoxische und genotoxisch seine Wirtszellen 15. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit von Abl zur Behandlung von Verbrennungen Infektionen durch MDR A. baumannii in einem Mausmodell verursacht zu untersuchen. Wir verwenden Biolumineszenz-pathogene Bakterien neue Mausmodelle von Burn-Infektionen zu entwickeln, die der nicht-invasive Überwachung der bakteriellen Belastung in Echtzeit ermöglichen. Im Vergleich zu der traditionellen Methode der Körperflüssigkeit / Gewebe - Probennahme und anschließende Plattieren und Koloniezählung 16, liefert diese Technik eines genauen Ergebnisse. Der Prozess der Gewebeprobenentnahme kann eine andere Quelle von experimentellen Fehler einzuführen. Da die bakterielle ist Lumineszenzintensität zu dem entspre linear proportionalPonding 17 CFU Bakterien, können wir das Überleben der Bakterien nach einer bestimmten Dosis der Bestrahlung mit Licht direkt messen. Durch die Überwachung kann die bakterielle Belastung in lebenden Tieren, das Licht Behandlung in Echtzeit empfängt, die Kinetik der Bakterienabtötung charakterisiert wird eine deutlich reduzierte Anzahl von Mäusen.

<table><tbody><tr><td>IVIS&nbsp;</td><td>PerkinElmer Inc, Waltham, MA</td><td>IVIS Lumina Series III</td><td>Präklinische in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>Leuchtdiode LED</td><td>VieLight Inc, Toronto, Kanada&nbsp;</td><td>415 nm</td><td>Lichtquelle für Beleuchtung</td></tr><tr><td>Leistungs-/Energiemessgerät</td><td>Thorlabs, Inc., Newton, NJ</td><td>PM100D</td><td>Lichtbestrahlungsstärkedetektor</td></tr><tr><td>Maus&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories, Wilmington, MA</td><td>BALB/c</td><td>Alter 7-8 Wochen, 17-19 g Gewicht</td></tr><tr><td>Acinetobacter baumannii&nbsp; </td><td>Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX</td><td>Klinisches Isolat</td><td>Engineered Luminesscent</td></tr><tr><td>Stamm Insulinspritzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>BD Lo-Dose U-100 Insulinspritzen zur</td></tr><tr><td>Injektion Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>721016</td><td>0,9% Natriumchloridphosphat</td></tr><tr><td>gepufferte Kochsalzlösung, 1x Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384&nbsp;</td><td>Ein Standard-Phosphatpuffer, der in vielen biomolekularen Verfahren verwendet wird</td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusion</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11059</td><td>Bakterienkulturmedium</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td>Für Bakteriensuspensionszentrifuge</td></tr><tr><td>Benchtop Inkubierte Orbital Shakers</td><td>Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH&nbsp;</td><td>Incu-Shaker Mini</td><td>Für die Kultivierung von</td>Bakterien-Impfschleifen</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-605&nbsp; &nbsp;</td><td>Zum Verschmieren von bakteriellem Inoclum auf der Brandoberfläche von Mäusen</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Redi-Tip Pipettenspitzen, 1-200 & Mikro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-502</td><td>Pipettenspitzen</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Zentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-220</td><td>Für die Trennung von Bakteriensuspensionen</td></tr><tr><td>Messingblock</td><td>Kleinteile, Inc., Miami, FL</td><td>10 mm x 10 mm&nbsp;</td><td>Zur Entstehung von Verbrennungen bei Mäusen</td></tr><tr><td>Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Handschuhe</td><td>Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY</td><td>PBI83514&nbsp;</td><td>Hitzebeständige Handschuhe</td></tr><tr><td>Greiner Schalen</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>P5112-740EA</td><td>35 mm &mal; 10 mm</td></tr><tr><td>Corning Digital Heizplatte</td><td>Cole-Parmer Instrument Company, LLC</td><td>UX-84301-65</td><td>10" x 10", 220 VAC, zum Kochen von Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>Maus/Ratte Thin Line Wasserbeheiztes Operationsbett</td><td>E-Z Systems</td><td>EZ-211</td><td>Verhindert Wärmeverlust und Unterkühlung während der</td></tr><tr><td>Operation Tierarztsalbe</td><td>S& K Pharma, GmbH</td><td>Kerato Biciron 5%, Augensalbe Augensalbe</td><td>zur Vorbeugung von Augentrockenheit</td></tr></tbody></table>

in - vivo - untersuchung von antimicrobial blau lichttherapie für multiresistente acinetobacter baumannii brennen infektionen biolumineszenz - bildgebung

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Brennen Infektionen weiterhin eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität. Das zunehmende Auftreten von mehrfach arzneimittelresistenten (MDR) Bakterien ist das häufige Versagen der traditionellen Antibiotika-Behandlungen geführt. Alternative Therapien sind dringend zu bekämpfen MDR Bakterien benötigt. Ein innovativer nicht-Antibiotikum Ansatz, antimikrobielle blaues Licht (abl) hat vielversprechende Wirksamkeit gegen MDR-Infektionen gezeigt. Der Wirkmechanismus von Abl ist noch nicht gut verstanden. Es wird allgemein angenommen , dass natürlich endogenes Photosensibilisator Chromophore in Bakterien (beispielsweise eisenfreien Porphyrinen, Flavine, etc.) auftritt durch Abl angeregt werden, die wiederum zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch einen photochemischen Prozeß erzeugt. Im Gegensatz zu anderen lichtbasierten antimikrobiellen Ansatz, antimikrobiellen Photodynamischen Therapie (aPDT), Abl Therapie erfordert nicht die Beteiligung eines exogenen photosensitizer. Alles was es braucht zu übernehmen ist die Bestrahlung mit blauem Licht; daher ist es einfach und kostengünstig. Die abl-Rezeptoren sind die endogenen zellulären Photosensibilisatoren in Bakterien, anstatt die DNA. Somit wird angenommen, dass viel weniger abl genotoxisch sein, Zellen als ultraviolett-C (UVC) Bestrahlung Host, die DNA-Schäden direkt in Wirtszellen verursacht. In diesem Beitrag stellen wir ein Protokoll , um die Wirksamkeit der abl - Therapie für MDR Acinetobacter baumannii Infektionen in einem Mausmodell der Brandverletzung zu bewerten. einen angelegten Biolumineszenz-Stammes Durch den Einsatz konnten wir das Ausmaß der Infektion in Echtzeit in lebenden Tieren nicht-invasiv überwachen. Diese Technik ist auch ein wirksames Instrument für die räumliche Verteilung von Infektionen bei Tieren zu überwachen.

Die A. baumannii Belastung , die wir verwenden , ist ein klinisches Isolat MDR, wie zuvor berichtete , 12, 17. Der Bakterienstamm wurde Biolumineszenz durch die Transfektion von luxCDABE Opera 11 hergestellt. 1A zeigt die aufeinanderfolgenden Bilder bakterielle Lumineszenz aus einer repräsentativen Maus infizierten brennen mit 5 x 10 6 A. baumannii und...

Infektionen, die durch multiresistente (MDR) Bakterienstämme verursacht werden, haben sich zu einer ernsthaften Bedrohung für die öffentliche Gesundheit entwickelt, die die Entwicklung alternativer Therapeutika erforderlich macht. Wir stellen ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit einer antimikrobiellen Blaulichttherapie (aBL) bei MDR-Acinetobacter baumannii-Infektionen bei Mausverbrennungen unter Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung zu bewerten.

In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirksamkeit der antimikrobiellen Blaulichttherapie bei multiresistenten Acinetobacter baumannii-Infektionen bei Verbrennungen von Mäusen zu beobachten. Dieses Protokoll kann uns bei der Beantwortung wichtiger Fragen im Bereich des lichtbasierten antimikrobiellen Ansatzes helfen, z. B. ob antimikrobielles blaues Licht bei der Beseitigung lokalisierter Bakterieninfektionen wirksam ist. Einschließlich derjenigen, die durch multiresistente Stämme näher kommen.Der Hauptvorteil von antimikrobiellem blauem Licht besteht darin, dass es sich um einen nicht-antibiotischen Ansatz ohne die Beteiligung eines exogenen Photosensibilisators handelt und wahrscheinlich nicht schädlich für Wirtszellen und -gewebe ist. Die Implikationen der Technik erstrecken sich auf die Therapie multiresistenter bakterieller Infektionen, da antimikrobielles blaues Licht pathogene Bakterien unabhängig von ihren arzneimittelresistenten Mustern abtötet. Obwohl diese Methode einen Einblick in die antimikrobielle Wirkung von blauem Licht auf Acinetobacter baumannii-Brandinfektionen geben kann, kann sie auch auf andere Arten von lokalisierten Infektionen angewendet werden, die durch andere Bakterienarten verursacht werden.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir den Einsatz einfacher lichtbasierter antimikrobieller Ansätze gegen multiresistente lokalisierte Infektionen untersuchten. Nachdem Sie eine Maus betäubt haben, verwenden Sie gemäß dem Textprotokoll einen Haarschneider, um die Maus auf dem Rücken zu rasieren, um so viel Haut wie möglich freizulegen. Platzieren Sie dann den Deckel einer 35 Millimeter großen Petrischale unter dem Bauch der Maus, um den Rücken in einer relativ horizontalen Position zu halten.Verwenden Sie eine 10 x 10 Zoll große 220-VAC-Heizplatte, um Wasser in einem 150-Milliliter-Becherglas zu kochen. Tauchen Sie einen Messingblock in das Becherglas, bis das thermische Gleichgewicht mit dem Wasser erreicht ist. Verabreichen Sie vor der Entstehung der Verbrennungsverletzung eine subkutane Injektion von präventiven Analgetika zur Schmerzlinderung.Drücken Sie 10 Minuten später mit Thermohandschuhen den erhitzten Messingblock sieben Sekunden lang vorsichtig auf die rasierte Stelle auf der Rückseite der Maus, um Brandwunden auszulösen. Um eine Flüssigkeitszufuhr zu verhindern, verabreichen Sie 0,5 Milliliter sterile Kochsalzlösung durch subkutane Injektionen. Fünf Minuten nach der Induktion der thermischen Verletzung wird mit einer Pipette 50 Mikroliter Bakteriensuspension mit fünfmal 10 bis sechster KBE und PBS auf die Verbrennungen der Maus geimpft.Schmieren Sie dann mit einem sterilen Wattestäbchen in einer Zickzackbewegung auf die Haut das Aliquot auf die Verbrennungen, um die Bakterienzellen im verbrannten Bereich so gleichmäßig wie möglich zu verteilen. Führen Sie unmittelbar nach der Inokulation eine Biolumineszenz-Bildgebung durch, indem Sie die Live-Bildgebungssoftware starten. Klicken Sie in der Systemsteuerung auf Initialisieren.Warten Sie dann, bis die Farbe des Temperaturfeldes grün wird, was anzeigt, dass die Temperatur des Tisches in der Probenkammer 37 Grad Celsius erreicht hat. Platzieren Sie die betäubte Maus auf dem warmen Tisch in der Probenkammer mit den infizierten Verbrennungen direkt unter der Kamera. Setzen Sie als Nächstes in der Systemsteuerung ein Häkchen neben lumineszierend.Wählen Sie dann die automatische Belichtung, damit die Belichtungszeit für die Bildgebung von der Live-Bildgebungssoftware basierend auf der Biolumineszenzintensität optimiert wird. Wählen Sie C aus der Dropdown-Liste "Ansichtsfeld" aus. Wählen Sie die Option für den mittleren Bereich aus, damit die Software die Brennweite bestimmt.Setzen Sie dann ein Häkchen neben das Overlay. Klicken Sie nun auf Erfassen, um das Bild aufzunehmen. Klicken Sie dann im Feld Bildbeschriftung bearbeiten auf OK.Ein Bildfenster und eine Werkzeugpalette werden angezeigt. Legen Sie die Parameter für den automatischen ROI für die automatische Auswahl fest. 24 Stunden nach der bakteriellen Infektion verwenden Sie zur Durchführung einer antimikrobiellen Blaulichttherapie Clip-Verbinder, um die LED an einem optischen Stützstab zu befestigen, damit sich die LED auf und ab bewegen kann.Nachdem das Energiemessgerät eingeschaltet und die Wellenlänge von 415 Nanometern ausgewählt wurde, platzieren Sie das Energiemessgerät direkt unter der LED. Schalten Sie mit einer Blaulichtschutzbrille das LED-Licht ein und stellen Sie den Abstand zwischen der LED-Blende und dem Lichtsensor des Energiemessers so ein, dass der Lichtfleck den gesamten Bereich des Lichtsensors abdeckt. Stimmen Sie den T-cube-LED-Treiber sorgfältig ab und zeichnen Sie den Messwert des Energiezählers auf.Berechnen Sie die Bestrahlungsstärke entsprechend dem Messwert. Stellen Sie die Bestrahlungsstärke der LED auf 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter ein, indem Sie den T-cube LED-Treiber einstellen. Schalten Sie dann die LED aus und messen Sie den Abstand zwischen der LED-Apertur und dem Lichtsensor des Power-Energy-Meters.Nach der Betäubung der Mäuse teilen die Tiere gemäß dem Textprotokoll nach dem Zufallsprinzip in eine mit antimikrobiellem Blaulicht oder aBL behandelte Gruppe und eine unbehandelte Kontrollgruppe ein. Verwenden Sie für die aBL-behandelte Gruppe Aluminiumfolie, um die Augen der Mäuse zu bedecken, um eine übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden. Platzieren Sie die Mäuseverbrennungen direkt unter der LED mit dem Deckel einer 35 Millimeter großen Petrischale unter dem Mäusebauch, um den Rücken in einer horizontalen Position zu halten.Ersetzen Sie als Nächstes die Energieanzeige durch eine Maus auf einer quadratischen Petrischale. Stellen Sie dann die Höhe der Maus wieder auf eine Position ein, in der der Abstand zwischen der LED-Blende und der Oberfläche der Mausverbrennung gleich dem Abstand zwischen der LED-Blende und dem Lichtsensor des Energiemessers ist. Bestrahlen Sie die infizierten Verbrennungen mit einer Bestrahlungsstärke von 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter.Verabreichen Sie aBL in Aliquoten von 72 Joule pro Quadratzentimeter, bis die Gesamtdosis von 360 Joule pro Quadratzentimeter erreicht ist. Führen Sie nach jeder Lichtdosis eine Biolumineszenz-Bildgebung der Verbrennungen der Maus durch, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Für die unbehandelte Kontrollgruppe ist eine Biolumineszenz-Bildgebung der Verbrennungen der Maus in den gleichen Zeitintervallen durchzuführen, die für die ABL-behandelte Gruppe verwendet wurden.Der Bakterienstamm A.baumannii wurde durch die Transfektion des luxCDABE opera biolumineszierend gemacht. Diese Abbildung zeigt aufeinanderfolgende bakterielle Lumineszenzbilder von einer repräsentativen Mausverbrennung, die mit fünfmal 10 bis sechstem A.baumannii infiziert war und 24 Stunden nach der bakteriellen Inokulation 360 Joule pro Quadratzentimeter aBL ausgesetzt war. Wie in diesem Panel gezeigt, wurde die bakterielle Lumineszenz nach einer Exposition von 360 Joule pro Quadratzentimeter aBL nahezu eliminiert.Hier ist eine Grammfärbung des histologischen Schnitts einer repräsentativen Probe von Mäusehaut zu sehen, die 24 Stunden nach der Inokulation entnommen wurde und das Vorhandensein von A.baumannii-Biofilmen auf der Oberfläche der infizierten Verbrennung zeigt. Dieses Diagramm veranschaulicht die Dosis-Wirkungs-Kurve der mittleren bakteriellen Lumineszenz von Mausverbrennungen, die mit fünfmal 10 bis zum sechsten A.baumannii infiziert und 24 Stunden nach der bakteriellen Inokulation mit aBL behandelt wurden. Um eine Inaktivierung von A.baumannii mit drei logarithmischen Basen 10 bei Mäuseverbrennungen zu erreichen, waren etwa 360 Joule pro Quadratzentimeter aBL erforderlich.Die bakterielle Lumineszenz der Verbrennungen von Mäusen, die nicht mit aBL in Berührung kamen, blieb während eines gleichen Zeitraums nahezu unverändert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, Zugang zu Biolumineszenzstämmen von Bakterien zu erhalten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der lichtbasierten antimikrobiellen Therapie, um den Einsatz von antimikrobiellem blauem Licht ohne exogenen Photosensibilisator gegen lokalisierte bakterielle Infektionen, einschließlich solcher, die durch multiresistente Stämme verursacht werden, zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie antimikrobielles blaues Licht zur Vorbeugung und Behandlung lokalisierter Infektionskrankheiten einsetzen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit sichtbarem Licht und pathogenen Bakterien äußerst gefährlich sein kann.Und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Laborhandschuhen und einer leicht geschützten Schutzbrille sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung...

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

Wir zeigen, dass eine entwickelte biomedizinischen Vorrichtung mit kontinuierlicher oder gepulster sichtbaren Laser basierende Behandlung, die mit Antibiotika (Gentamycin), führt zu einer statistisch signifikanten synergistischen Effekt führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit...

Die synergistische Wirkung von sichtbarem Licht und Gentamycin auf<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismen

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung...

Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Quelle: Valentine, M. E. et al., Erzeugung von In-Frame-Gen-Deletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Anwendung eines biolumineszenzbasierten Bildgebungsansatzes zur Überwachung bakterieller Infektionen in einem Live-Mausmodell. Sequentielle biolumineszente und Röntgenbildgebung ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und anatomische Lokalisierung der Infektion, die...

Echtzeitbildgebung bakterieller Infektionen in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Quelle: Wang, Y., et al. In vivo Untersuchung der antimikrobiellen Blaulichttherapie für multiresistente Acinetobacter baumannii-Brandinfektionen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt, wie man eine Verbrennungsinfektion in einem Mausmodell etabliert, indem man einen erhitzten Messingblock anwendet, gefolgt von pathogenem bakteriellem Inokulum. Die Bakterien besiedeln die freiliegende extrazelluläre Matrix und bilden einen Biofilm, der in vivo Studien zu...

Etablierung eines Mausmodells von Brandinfektionen mit pathogenen Bakterien

Quelle: Wang, Y., et al. In vivo Untersuchung der antimikrobiellen Blaulichttherapie für multiresistente Acinetobacter baumannii-Brandinfektionen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Bildgebung von Brandwundinfektionen bei Mäusen, die mit Acinetobacter baumannii geimpft sind und ein biolumineszentes Operon tragen. Es zeigt, wie die Oxidation von luciferase-katalysierten Substraten Licht proportional zur bakteriellen Last erzeugt und so...

Biolumineszenzbildgebung von Acinetobacter baumannii-infizierten Brandwunden bei Mäusen

Quelle: Wang, Y., et al. In vivo Untersuchung der antimikrobiellen Blaulichttherapie für multiresistente Acinetobacter baumannii-Brandinfektionen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Behandlung von Brandwundinfektionen, die durch biolumineszente, arzneimittelresistente Bakterien bei Mäusen mit Blaulichttherapie verursacht werden, gefolgt von Biolumineszenzbildgebung zur Überwachung der Behandlungswirksamkeit.

Blaulichttherapie bei arzneimittelresistenten bakteriellen Infektionen in Brandwunden in einem Mausmodell

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung  von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Ein 405-nm-Blaulicht-LED-Gerät zeigt eine antimikrobielle Wirksamkeit gegen eine Vielzahl von Wundkrankheitserregern, wenn es an einem kollagenbasierten synthetischen Hautmodell untersucht wird. Dieser vereinfachte In-vitro-Ansatz bietet eine reproduzierbare und ethisch praktikable Alternative für die Frühphasenbewertung lichtbasierter antimikrobieller Therapien.

Untersuchung eines Blaulicht-LED-Geräts zur Unterdrückung von Wundkrankheitserregern mittels eines kollagenbasierten synthetischen Hautmodells

Erfahren Sie die antimikrobielle Blaulichttherapie zur Behandlung multiresistenter Acinetobacter baumannii-Infektionen in Maus-Verbrennungsmodellen. Diese nicht-antibiotische Methode nutzt Biolumineszenz-Bildgebung zur Evaluierung.

In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung (Video) | JoVE Journal

In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung

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