Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

Dieses Protokoll wurde ursprünglich von Dr. Gary Bunker und seinen Kollegen veröffentlicht und ermöglicht die lange Dichte und die hohe Reinheit von embryonalen Hippocampus-Neuronen, indem die Neuronen über einer glialen Fitter-Schicht suspendiert werden. Dieses Ergebnis ist bei den Pan Gefahren unserer anderen Hippocampus entscheidende Ergebnisse, denn es ermöglicht Neuronen bei geringen Dichten mit wenig kontaminierenden Gliazellen zu wachsen. Dieses Ergebnis ist daher ideal für die hochauflösende Bildgebung und das Funktionieren von Typografie und reifen Neuronen in Kultur.

Die Nachreifung dieses Protokolls sollte die Adaption durch neues Leben beschleunigen, da es mehrere Schlüsselzustände während des Verfahrens gibt, die schwer zu beschreiben sind, so dass es Sie mitnimmt. Dieses Protokoll besteht aus drei unabhängigen Populationen, die für die Kultivierung hochwertiger primärer Neuronen erforderlich sind. Zu diesen Prozessen gehören die Kultivierung von Gliazellen, das Erstellen und Beschichten von Deckgläsern und die Aufbereitung von Nervenzellen des Hippocampus.

Zu Beginn sollte frühes postnatales kortikales Gewebe der Ratte entnommen werden, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Obwohl hier nicht direkt gezeigt, ist zu beachten, dass der später in diesem Protokoll gezeigte Dissektionsschritt nahezu identisch mit denen ist, die für die kortikale Dissektion verwendet werden. Aus diesem Grund werden relevante Schritte während der Hippocampus-Dissektion hervorgehoben, die weiter unten in diesem Video gezeigt wird.

Beginnen Sie mit Schritt sechs des schriftlichen Protokolls, entfernen Sie das HBSS aus dem gesammelten kortikalen Gewebe und hacken Sie das Gewebe dann mit einer Schere so fein wie möglich. Geben Sie genügend HBSS in das gehackte Gewebe, um die Gewebestücke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, und bringen Sie dann das Gesamtvolumen durch Zugabe von HBSS auf 12 Milliliter. Fügen Sie jeweils 1,5 Milliliter 2,5%iges Trypsin und 10 Milligramm pro Milliliter DNA-Lösung hinzu, invertieren Sie sie, um sie zu mischen, und inkubieren Sie die resultierende Mischung dann 12 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Zerreiben Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit einer Pasteurpipette aus Glas und inkubieren Sie es dann weitere drei Minuten im Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass sich alle Gewebestücke am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, und filtrieren Sie dann den Überstand in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 5 Millilitern BGS. Geben Sie 13,5 Milliliter HBSS und 1,5 Milliliter 2,5 Trypsin in das Röhrchen, das die restlichen unverdauten Gewebestücke enthält, invertieren Sie es, um es zu mischen, und inkubieren Sie es dann weitere 10 Minuten im Wasserbad.

Nach der Inkubation zerreiben Sie das umbenennende Gewebe 10 bis 15 Mal und filtrieren Sie es dann in das Röhrchen, das das ursprüngliche Filtrat enthält. Spülen Sie anschließend den Filter, indem Sie weitere 3 Milliliter BGS durch ihn leiten. Zu diesem Zeitpunkt kann das Filtrat in mehrere Röhrchen aufgeteilt werden, um sowohl das Ausbalancieren als auch das Aufwirbeln des Pellets in den Zellen zu vereinfachen.

Zentrifugieren Sie die Suspensionen sechs Minuten lang bei 130 g. Beachten Sie, dass der Boden des Pellets aufgrund des Vorhandenseins von Blutbestandteilen leicht rötlich erscheint. Entfernen Sie die Überstände und geben Sie dann 1 Milliliter Gliamedium in jedes Röhrchen, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Übertragen Sie die Teile jedes Pellets, die nicht dieses rötliche Aussehen haben, in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie bis zu 2 Milliliter Gliamedium pro Welpe hinzu, um das kombinierte Gewebe wieder zu suspendieren, und überführen Sie jeweils 2 Milliliter der Suspension in 18 Milliliter vorgewärmtes Gliamedium in einem 75 Zentimeter großen Kulturkolben. Inkubieren Sie den Kolben in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2. Am Tag nach der Aussaat der Zellen wird das Medium in jedem Kolben auf frisches Gliamedium umgestellt.

Beachten Sie, dass die Kultur zu diesem Zeitpunkt eine Mischung aus Astrozyten und anderen Nicht-Zielzelltypen sein wird. Um Nicht-Astrozyten-Zelltypen zu entfernen, müssen die Kolben etwa vier Tage nach der Aussaat kräftig gerührt werden. Spülen Sie dazu die Kolben mit HBSS, geben Sie dann 10 Milliliter frisches HBSS in jeden Kolben und schütteln Sie jeden fünf bis 10 Mal kräftig.

Saugen Sie das HBSS ab und spülen Sie es noch zweimal mit HBSS ab. Fügen Sie dann 20 Milliliter Gliamedium hinzu und stellen Sie die Kolben wie zuvor in den Inkubator zurück. Es ist zu beachten, dass dies zwar kräftig ist, die für die Kultur gewünschten Astrozyten jedoch stark an der Kolbenoberfläche haften.

Um die Astrozytenkulturen zu erhalten, wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche auf frisches Gliamedium, bis es zusammenfließt. Sobald die Zellen zusammenfließen, können sie für die zukünftige Verwendung eingefroren werden, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Glia muss mindestens 14 Tage vor Beginn der Neuronenkultur in Schalen plattiert werden, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Tauchen Sie die Deckschichten in konzentrierte Salpetersäure und beschallen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Seien Sie vorsichtig, da die konzentrierte Salpetersäure extrem ätzend ist. Beachten Sie auch, dass einige Labore es vorziehen, die Deckgläser über Nacht mit keramischen Färbegestellen in Salpetersäure einzuweichen.

Entsorgen Sie die Salpetersäure vorsichtig im chemischen Abzug gemäß den institutionellen Richtlinien und spülen Sie dann die Deckgläser dreimal mit entionisiertem Wasser ab. Tauchen Sie die Deckgläser in Wasser und beschallen Sie sie erneut 30 Minuten lang. Entfernen Sie anschließend das Wasser und spülen Sie die Deckgläser weitere drei Mal aus.

Tauchen Sie die Deckgläser in 50 Milliliter Wasser und autoklavieren Sie sie. Entfernen Sie in einer sterilen Laminar-Flow-Haube das Wasser und fügen Sie 20 bis 30 Milliliter Ethanol zum Spülen hinzu. Fügen Sie weitere 20 bis 30 Milliliter Ethanol hinzu und geben Sie dann die Deckgläser und das Ethanol in eine 100-Millimeter-Petrischale.

Übertragen Sie die Farbträger mit einer stumpfen Pinzette auf 60-Milliliter-Petrischale, vier bis fünf pro Schale, und lassen Sie sie dann an der Luft trocknen, indem Sie die Deckgläser an den Rand der Schale lehnen. Sobald das Ethanol verdampft ist, bringen Sie die Deckgläser wieder in die horizontale Position. Schmelzen Sie 10 Gramm Paraffin in einer hitzebeständigen Glasflasche und halten Sie es bei etwa 150 bis 200 Grad Celsius.

Die ideale Temperatur kann einige Anpassungen erfordern, und falsche Temperaturen können zu Schwierigkeiten bei der Herstellung der richtigen Größe von Paraffinfüßen führen. Tauchen Sie eine Pasteur-Pipette in das Paraffin und berühren Sie sie dann schnell an drei Stellen am Rand jedes Deckglases. Paraffintropfen verfestigen sich zu Kügelchen mit einer Höhe von etwa 3 bis 5 Millimetern und einem Durchmesser von 1 bis 2 Millimetern und dienen dazu, einen Raum zwischen den Neuronen auf dem Deckglas und der darunter liegenden Glia-Mono-Schicht zu schaffen.

Besorgen Sie sich Geschirr mit zuvor vorbereiteten Deckgläsern mit Paraffinfüßen. Geben Sie 200 Mikroliter Poly-L-Lysin und Boratpuffer auf die Oberfläche jedes Deckglases und lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur abgedeckt auf den Deckgläsern einwirken. Die zu beschichtende Oberfläche sollte die gleiche sein, auf der sich die Paraffinkügelchen befinden.

Bei ordnungsgemäßer Reinigung sollte sich das Poly-L-Lysin leicht verteilen und die Oberfläche des Deckglases bedecken. Waschen Sie die Einbezugsbezüge am nächsten Morgen zweimal, indem Sie sie jeweils zwei Stunden lang in sterilem Wasser einweichen. Ersetzen Sie nach der letzten Wäsche das Wasser durch 4 Milliliter Beschichtungsmedium pro Schüssel.

Beachten Sie, dass es wichtig ist, dass die Oberfläche der Deckgläser nach dem Überziehen mit Poly-L-Lysin nicht trocknen darf. Stellen Sie die Deckglasschalen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Das beschichtete Deckglas sollte mindestens 24 Stunden vor Beginn der Neuronenkultur inkubiert werden.

Entnehmen Sie eine embryonale trächtige Ratte am 18. oder 19. Tag und euthanasieren Sie sie nach einer zugelassenen Methode. Besprühen Sie die Unterseite der Ratte mit 70% Ethanol und machen Sie dann einen Mittellinienschnitt von der Schamregion bis zum Ende der Bauchhöhle. Um eine Kontamination zu vermeiden, achten Sie darauf, dass Sie bei diesem Schritt nur durch die Haut schneiden.

Sterilisieren Sie die Präparierinstrumente mit 70 % Ethanol und schneiden Sie dann durch die Bauchdecke, um die Gebärmutter freizulegen. Entferne die beiden Gebärmutterhörner und lege sie in eine sterile Schale. Entfernen Sie in einer sterilen Laminar-Flow-Haube die Gebärmutterhäute, die die Föten umgeben, enthaupten Sie sie und legen Sie die Köpfe in eine 100-Millimeter-Petrischale, die 20 Milliliter HBSS enthält.

Sezieren Sie die Gehirne und legen Sie sie sofort in eine 60-Millimeter-Petrischale, die 2 Milliliter HBSS auf Eis enthält. Sammeln Sie nur zwei bis drei Gehirne pro Schale, um ausreichend Platz für den nächsten Schritt zu haben. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop die Hirnhäute von der Mittellinie der Gehirnhälften.

Als nächstes zerlegst du die Hippocampi. Beachten Sie, dass der Hippocampus als halbmondförmige Struktur in der medialen Oberfläche der kortikalen Hemisphäre unterschieden werden kann und leicht zu entfernen ist, da er seitlich von einem Ventrikel begrenzt wird. Sobald sie befreit sind, legen Sie die Hippocampi in eine 60-Millimeter-Petrischale, die 4,5 Milliliter HBSS enthält, und bewahren Sie sie auf Eis auf.

Beachten Sie, dass die bis zu diesem Punkt unternommenen Schritte auch für die kortikale Dissektion gelten, mit dem Unterschied, dass die Kortikale im Gegensatz zu den Hippocampi beibehalten wird. Für die kortikale Dissektion wäre der nächste Schritt, den Kortex vom Rest des Gehirns zu trennen, wie hier gezeigt, und dann die Kortex und HBSS zu sammeln, wie zuvor gezeigt. Sobald das gesamte Hippocampusgewebe in HBSS gesammelt wurde, übertragen Sie es in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie 5 Milliliter 2,5%iges Trypsin hinzu und inkubieren Sie es dann 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Trypsinlösung vorsichtig mit einer Pasteurpipette und lassen Sie das Hippocampusgewebe am Boden des Röhrchens ungestört. Waschen Sie das Taschentuch zweimal, indem Sie vorsichtig 5 Milliliter HBSS hinzufügen, fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann mit einer Pasteurpipette wieder entfernen, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Boden nicht gestört wird.

Während Sie auf den zuvor gezeigten Inkubationsschritt warten, bereiten Sie zwei Varianten von flammpolierten Pipetten für die Dissoziation des Gewebes vor. Setzen Sie dazu die Spitze der Pasteurpipette aus Glas kurz einer Flamme aus und untersuchen Sie dann die Spitze der Pipette. Für die erste Variante wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Ränder der Pipettenspitze geglättet sind, der Durchmesser jedoch unverändert bleibt.

Für die zweite wiederholen Sie den Vorgang, bis die Ränder geglättet sind und der Spitzendurchmesser um etwa die Hälfte reduziert wurde. Es ist wichtig, zu üben, den idealen Durchmesser zu finden, um sicherzustellen, dass das Gewebe dissoziiert wird, um einzelne Zellen zu erhalten, ohne diese Zellen dabei zu beschädigen. Bringen Sie nach der zweiten Wäsche das Gesamtvolumen auf 5 Milliliter, indem Sie dem Gewebe ein ausreichendes Volumen HBSS hinzufügen.

Zerreiben Sie das Hippocampusgewebe zuerst um etwa 10 Durchgänge durch die glattkantige normale Pipette, dann mit weiteren fünf bis 10 Durchgängen durch die Pipette mit reduziertem Spitzendurchmesser. Ziel ist es, eine homogene Lösung von Zellen ohne oder mit sehr wenigen Gewebeklumpen zu erhalten. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer.

Typische Erträge liegen bei etwa 800.000 bis einer Million Zellen pro Welpe. Ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension wird in Schalen mit Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläsern in 4 Millilitern Beschichtungsmedium übertragen, um eine Beschichtungsdichte zwischen 100.000 und 500.000 Zellen pro 60-Millimeter-Schale zu erhalten, abhängig vom beabsichtigten Versuch. Stellen Sie die Gerichte in einen 37 Grad Celsius heißen 5%CO2-Inkubator.

Nach drei bis vier Stunden übertragen Sie die Deckgläser mit Neuronen, die an Schalen gebunden sind, die Gliazellen und NBG-Medium enthalten. Dies sollte so erfolgen, dass die Seite, auf der die Neuronen plattiert wurden, nach unten in Richtung der Gliazellschicht zeigt. Fügen Sie insgesamt vier oder fünf Deckgläser pro Gliaschale hinzu.

Geben Sie die Aerozele-Lösung zwei bis drei Tage nach dem Plattieren in eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren pro Schale, um das Wachstum der Gliazellen zu stoppen. Füttern Sie die Zellen einmal pro Woche, indem Sie bei jeder Fütterung 2 Milliliter des alten Mediums durch 2,5 Milliliter frisches Medium ersetzen. Das zusätzlich zugesetzte Medium soll die Verdunstung im Laufe der Zeit ausgleichen.

Und nur ein Teil des Mediums wird verändert, um eine gleichmäßige Konditionierung des Mediums durch die Gliazellen zu gewährleisten. Diese Kulturen sind in der Regel mindestens einen Monat lang gesund. Die Neuronen wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann in primären Antikörpern für die Fluoreszenzbildgebung inkubiert.

Wie die Tau- und MAP2-Immunfärbungen zeigen, entwickeln diese Neuronen eine ausgedehnte Baumbildung mit gut entwickelten Axonen und Dendriten. Reife Neuronen entwickeln auch synaptische Dornen, wie durch die selektive Lokalisation von Drebrin One identifiziert, die in engem Gegensatz zu präsynaptischen Spezialisierungen stehen, wie sie durch Synapse in einer Immunstatisierung identifiziert wurden. Diese primären Neuronen eignen sich gut für funktionelle und strukturelle Untersuchungen von Neuronen und Synapsen, einschließlich Untersuchungen der Signaltransduktion, der neuronalen Polarität, des subzellulären Transports sowie der Synapsenentwicklung und -plastizität, um nur einige zu nennen.

Dieses Video soll zum Verständnis und zur genauen Ausführung mehrerer wichtiger Schritte dieses Protokolls beitragen. Die korrekte Einhaltung des beschriebenen Verfahrens sollte zu einer gesunden, langdichten Neuronenkultur mit ausgedehnter Baumbildung und morphologisch und funktionell gut entwickelten Synapsen führen.