Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

Dieses Protokoll wurde ursprünglich von Dr. Gary Bunker und seinen Kollegen veröffentlicht und ermöglicht die langdauernde Kultur von embryonalen hippokampalen Neuronen mit hoher Dichte und Reinheit, indem die Neuronen über einer glialen Filterlage suspendiert werden. Dieses Ergebnis ist von entscheidender Bedeutung für unsere weiteren Untersuchungen des Hippocampus, da es den Neuronen ermöglicht, bei geringer Dichte zu wachsen, mit nur wenigen verunreinigenden Gliazellen. Es eignet sich daher ideal für hochauflösende Bildgebung und funktionelle Analysen der Morphologie sowie reifer Neuronen in Kultur.

Die Nachreifung dieses Protokolls sollte die Einarbeitung durch neue Anwender beschleunigen, da mehrere Schlüsselphasen des Verfahrens schwer zu beschreiben sind und das Protokoll daher Schritt für Schritt begleitet. Dieses Protokoll umfasst drei unabhängige Schritte, die für die Kultivierung hochwertiger primärer Neuronen erforderlich sind. Diese Prozesse beinhalten die Kultur von Gliazellen, die Herstellung und Beschichtung von Deckgläsern sowie die Aufbereitung von hippocampalen Nervenzellen.

Zunächst sollte früh postnatales kortikales Rattengewebe wie im schriftlichen Protokoll beschrieben gewonnen werden. Obwohl hier nicht direkt dargestellt, ist darauf hinzuweisen, dass die später in diesem Protokoll gezeigten Dissektionsschritte nahezu identisch mit denen sind, die für die Kortikalisdissektion verwendet werden. Aus diesem Grund werden relevante Schritte während der später in diesem Video gezeigten Hippocampus-Dissektionsprozedur hervorgehoben.

Beginnend mit Schritt sechs des schriftlichen Protokolls, entfernen Sie das HBSS aus dem gesammelten kortikalen Gewebe und zerkleinern Sie das Gewebe anschließend so fein wie möglich mit einer Schere. Geben Sie so viel HBSS zu dem zerkleinerten Gewebe hinzu, dass die Gewebestücke in ein 50-Milliliter-Konischglas überführt werden können, und stellen Sie dann das Gesamtvolumen durch Zugabe von HBSS auf 12 Milliliter ein. Fügen Sie jeweils 1,5 Milliliter 2,5 %iger Trypsinlösung und 10 Milligramm pro Milliliter DNA-Lösung hinzu, invertieren Sie das Gefäß zum Mischen und inkubieren Sie die resultierende Mischung 12 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Homogenisieren Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit einer Glas-Pasteurpipette und inkubieren Sie es anschließend weitere drei Minuten im Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass alle Gewebestücke am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, und filtrieren Sie dann den Überstand in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das 5 Milliliter BGS enthält. Geben Sie 13,5 Milliliter HBSS und 1,5 Milliliter 2.5&trypsin zu dem Röhrchen mit den verbleibenden Stücken unverdauten Gewebes hinzu, drehen Sie es zum Mischen um und inkubieren Sie es weitere 10 Minuten im Wasserbad.

Nach der Inkubation das verbleibende Gewebe 10 bis 15 Mal triturieren und anschließend in das Röhrchen mit dem ursprünglichen Filtrat filtern. Danach den Filter durch Zugabe von weiteren 3 Milliliter BGS ausspülen. An diesem Punkt kann das Filtrat auf mehrere Röhrchen aufgeteilt werden, um sowohl das Auswuchten als auch die erneute Suspension des Zellpellets zu vereinfachen.

Zentrifugieren Sie die Suspensionen sechs Minuten lang bei 130 × g. Nach der Zentrifugation ist der Boden des Pellets aufgrund von Blutbestandteilen leicht rötlich gefärbt. Entfernen Sie die Überstände und geben Sie dann 1 Milliliter Glialmedium in jedes Röhrchen, wobei Sie darauf achten sollten, das Pellet nicht aufzuwirbeln. Überführen Sie die Anteile jedes Pellets, die nicht diese rötliche Färbung aufweisen, in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie bis zu 2 Milliliter Glialmedium pro Tier, um das kombinierte Gewebe erneut in Suspension zu bringen, und überführen Sie jeweils 2 Milliliter der Suspension in 18 Milliliter vorgewärmtes Glialmedium in einer 75 Quadratzentimeter großen Kulturflasche. Inkubieren Sie die Flasche in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Am Tag nach der Aussaat wechseln Sie das Medium in jeder Flasche in frisches Glialmedium.

Beachten Sie, dass die Kultur zu diesem Zeitpunkt eine Mischung aus Astrozyten und anderen Nicht-Zielzelltypen darstellt. Um Nicht-Astrozyten-Zelltypen zu entfernen, müssen die Kolben etwa vier Tage nach der Aussaat kräftig geschüttelt werden. Dazu spülen Sie die Kolben mit HBSS aus, geben dann 10 Milliliter frisches HBSS in jeden Kolben und schütteln jeden Kolben fünf bis zehn Mal kräftig.

Entfernen Sie das HBSS durch Aspiration und spülen Sie zweimal erneut mit HBSS. Geben Sie anschließend 20 Milliliter Glialmedium hinzu und stellen Sie die Kolben wie zuvor in den Inkubator zurück. Beachten Sie, dass trotz dieser intensiven Behandlung die für die Kultur gewünschten Astrozyten stark an der Kolbenoberfläche haften bleiben.

Um die Astrozytenkulturen zu erhalten, wechseln Sie das Medium zweimal wöchentlich auf frisches Glialmedium, bis die Zellen konfluent sind. Sobald sie konfluent sind, können die Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll für die spätere Verwendung eingefroren werden. Die Gliazellen müssen gemäß dem schriftlichen Protokoll mindestens 14 Tage vor Beginn der Neuronenkultur in die Schalen ausgesät werden.

Legen Sie die Deckgläser in konzentrierte Salpetersäure ein und behandeln Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Ultraschall. Seien Sie vorsichtig, da die konzentrierte Salpetersäure äußerst ätzend ist. Beachten Sie außerdem, dass einige Labore es vorziehen, die Deckgläser über Nacht in Salpetersäure mit keramischen Färbehaltern einzulegen.

Entsorgen Sie die Salpetersäure sorgfältig gemäß den institutionellen Vorschriften in der chemischen Abzugshaube und spülen Sie die Deckgläser anschließend dreimal mit entionisiertem Wasser ab. Tauchen Sie die Deckgläser in Wasser ein und behandeln Sie sie erneut 30 Minuten lang mit Ultraschall. Danach entfernen Sie das Wasser und spülen die Deckgläser erneut dreimal ab.

Die Deckgläser in 50 Milliliter Wasser eintauchen und anschließend autoklavieren. Im sterilen Flussbrückenschrank das Wasser entfernen und 20 bis 30 Milliliter Ethanol zum Spülen hinzufügen. Weitere 20 bis 30 Milliliter Ethanol hinzufügen und dann die Deckgläser zusammen mit dem Ethanol in eine 100 Millimeter große Petrischale überführen.

Überführen Sie die Objektträger mit stumpfen Pinzetten in 60-Milliliter-Petri-Schalen, vier bis fünf pro Schale, und lassen Sie sie trocknen, indem Sie die Deckgläser an den Rand der Schale lehnen. Sobald das Ethanol verdampft ist, bringen Sie die Deckgläser in horizontale Position zurück. Schmelzen Sie 10 Gramm Paraffin in einer hitzebeständigen Glasflasche und halten Sie es bei etwa 150 bis 200 Grad Celsius.

Die ideale Temperatur kann einige Anpassungen erfordern, und falsche Temperaturen können dazu führen, dass es schwierig wird, die richtige Größe der Paraffinfüße zu erzeugen. Tauchen Sie eine Pasteur-Pipette in das Paraffin und berühren Sie dann schnell drei Stellen nahe dem Rand jeder Deckglasplatte. Die Paraffintropfen erstarrten zu Perlen mit einer Höhe von etwa 3 bis 5 Millimetern und einem Durchmesser von 1 bis 2 Millimetern und dienen dazu, einen Abstand zwischen den Neuronen auf dem Deckglas und der darunterliegenden Glia-Monoschicht zu schaffen.

Beschaffen Sie Schalen mit zuvor vorbereiteten Deckgläsern mit Paraffinfüßen. Geben Sie 200 Mikroliter Poly-l-lysin- und Boratpuffer auf die Oberfläche jedes Deckglases und lassen Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur bedeckt auf den Deckgläsern stehen. Die zu beschichtende Oberfläche sollte dieselbe sein, auf der sich die Paraffinkügelchen befinden.

Wenn die Poly-L-Lysin-Lösung ordnungsgemäß gereinigt wurde, sollte sie sich leicht ausbreiten und die Oberfläche des Deckgläschens vollständig bedecken. Am nächsten Morgen die Deckgläschen zweimal waschen, indem sie jeweils zwei Stunden in steriler Wasserlösung getaucht werden. Nach dem letzten Waschgang das Wasser durch 4 Milliliter Platingmedium pro Schale ersetzen.

Beachten Sie, dass die Oberfläche der Deckgläser nach der Beschichtung mit Poly-L-Lysin nicht austrocknen darf. Stellen Sie die Schalen mit den Deckgläsern in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Die beschichteten Deckgläser sollten mindestens 24 Stunden inkubiert werden, bevor die Neuronenkultur begonnen wird.

Besorgen Sie eine trächtige Ratte am embryonalen Tag 18 oder 19 und euthanasieren Sie sie mittels einer genehmigten Methode. Besprühen Sie die Bauchseite der Ratte mit 70 % Ethanol und führen Sie dann einen medianen Schnitt vom Schambein bis zum Ende der Bauchhöhle durch. Um Kontaminationen zu vermeiden, achten Sie darauf, dass in diesem Schritt nur die Haut durchtrennt wird.

Diebene Instrumente mit 70 % Ethanol sterilisieren, dann durch die Bauchdecke schneiden, um die Gebärmutter freizulegen. Entfernen Sie die beiden Uterushörner und legen Sie sie in eine sterile Schale. Entfernen Sie im sterilen Luftstromkasten die die Föten umgebenden Uterusmembranen, dann enthaupten Sie diese und legen die Köpfe in eine 100 Millimeter große Petrischale, die 20 Milliliter HBSS enthält.

Entnehmen Sie die Gehirne und legen Sie sie sofort in eine 60 Millimeter große Petrischale mit 2 Milliliter HBSS auf Eis. Sammeln Sie nur zwei bis drei Gehirne pro Schale, um ausreichend Platz für den nächsten Schritt zu schaffen. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop die Meningen entlang der Mittellinie der Großhirnhemisphären.

Als Nächstes werden die Hippocampi präpariert. Beachten Sie, dass sich der Hippocampus als halbmondförmige Struktur auf der medialen Oberfläche der kortikalen Hemisphäre erkennen lässt und leicht zu entfernen ist, da er lateral von einem Ventrikel begrenzt wird. Nach der Freilegung werden die Hippocampi in eine 60 Millimeter große Petrischale mit 4,5 Millilitern HBSS gegeben und auf Eis gehalten.

Beachten Sie, dass die bis zu diesem Punkt durchgeführten Schritte auch für die kortikale Dissektion gelten, mit dem Unterschied, dass die Kortizes anstelle der Hippocampi aufbewahrt werden. Bei der kortikalen Dissektion folgt als nächster Schritt die Trennung des Kortex vom restlichen Gehirn, wie hier gezeigt, und anschließend die Sammlung der Kortizes und des HBSS, wie zuvor dargestellt. Sobald das gesamte hippokampale Gewebe in HBSS gesammelt wurde, überführen Sie es in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie 5 Milliliter 2,5 %iger Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie die Trypsinlösung vorsichtig mit einer Pasteurpipette, wobei das hippocampale Gewebe am Boden des Reaktionsgefäßes ungestört bleibt. Waschen Sie das Gewebe zweimal, indem Sie vorsichtig jeweils 5 Milliliter HBSS hinzufügen, 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Flüssigkeit anschließend erneut mit einer Pasteurpipette entfernen, wobei sichergestellt werden muss, dass das Gewebe am Boden nicht gestört wird.

Während des Wartens auf den zuvor gezeigten Inkubationsschritt bereiten Sie zwei Varianten flammenglätteter Pipetten für die Gewebedissoziation vor. Dazu halten Sie die Spitze der Glas-Pasteur-Pipette kurz in eine Flamme und untersuchen anschließend die Pipettenspitze. Bei der ersten Variante wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Kanten der Pipettenspitze geglättet sind, der Durchmesser jedoch unverändert bleibt.

Wiederholen Sie dies beim zweiten Mal, bis die Kanten geglättet sind und der Spitzenaußendurchmesser etwa auf die Hälfte reduziert wurde. Es ist wichtig, zu üben, um den idealen Durchmesser zu finden, der sicherstellt, dass das Gewebe so dissoziiert wird, dass Einzelzellen entstehen, ohne diese Zellen während des Prozesses zu beschädigen. Nach dem zweiten Waschschritt wird das Gesamtvolumen auf 5 Milliliter gebracht, indem eine ausreichende Menge HBSS zum Gewebe hinzugefügt wird.

Zerstoßen Sie das Hippocampus-Gewebe zunächst durch etwa 10 Durchgänge durch die glattkantige normale Pipette und anschließend durch weitere fünf bis 10 Durchgänge durch die Pipette mit verkleinertem Spitzenquerschnitt. Ziel ist es hier, eine homogene Zellsuspension zu erhalten, die keine oder nur sehr wenige Gewebeklumpen aufweist. Bestimmen Sie die Zelldichte mithilfe eines Hämozytometers.

Typische Ausbeuten liegen bei etwa 800.000 bis eine Million Zellen pro Wurf. Überführen Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension in Schalen mit mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläsern in 4 Milliliter Ansiedlungsmedium, um eine Ansiedledichte von 100.000 bis 500.000 Zellen pro 60-Millimeter-Schale zu erreichen, abhängig vom geplanten Experiment. Stellen Sie die Schalen in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO₂.

Nach drei bis vier Stunden überführen Sie die Deckgläser mit angehefteten Neuronen in Schalen, die Gliazellen und NBG-Medium enthalten. Dies sollte so erfolgen, dass die Seite, auf der die Neuronen aufgebracht wurden, nach unten zur Gliazellschicht weist. Fügen Sie insgesamt vier oder fünf Deckgläser pro Glia-Schale hinzu.

Zwei oder drei Tage nach dem Ausplattieren die Aerocele-Lösung bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikromolar pro Platte hinzufügen, um das Wachstum der Gliazellen zu hemmen. Die Zellen einmal wöchentlich versorgen, indem bei jeder Fütterung 2 Milliliter des alten Mediums durch 2,5 Milliliter frisches Medium ersetzt werden. Das zusätzliche Medium dient der Kompensation von Verdunstungsverlusten über die Zeit.

Es wird jeweils nur ein Teil des Mediums gewechselt, um eine konsistente Konditionierung des Mediums durch die Gliazellen sicherzustellen. Diese Kulturen sind in der Regel mindestens einen Monat lang gesund. Die Neuronen wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit primären Antikörpern für die Fluoreszenzbildgebung inkubiert.

Wie die Tau- und MAP2-Immunfärbungen zeigen, entwickeln diese Neuronen eine umfangreiche Verzweigung mit gut ausgebildeten Axonen und Dendriten. Ausgereifte Neuronen bilden außerdem synaptische Dornen aus, die sich durch die selektive Lokalisation von Drebrin One identifizieren lassen und eng an präsynaptische Spezialisierungen angrenzen, wie durch die Synapsenfärbung in einer Immunfärbung nachgewiesen wurde. Diese primären Neuronen eignen sich hervorragend für funktionelle und strukturelle Untersuchungen von Neuronen und Synapsen, einschließlich Studien zur Signaltransduktion, neuronale Polarität, subzelluläre Transportvorgänge sowie Entwicklung und Plastizität von Synapsen, unter anderem.

Dieses Video soll beim Verständnis und der genauen Durchführung mehrerer wichtiger Schritte dieses Protokolls helfen. Die korrekte Einhaltung der beschriebenen Methode sollte zu einer gesunden, dichten Neuronenkultur mit umfangreicher Verzweigung sowie morphologisch und funktionell gut ausgebildeten Synapsen führen.