Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling ( Danio rerio)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das bösartige und invasive Verhalten von Krebszellen in einem Zebrafisch-Embryomodell zu beurteilen. Diese Methode hilft Forschern festzustellen, ob Krebszellen aus einem funktionierenden Kreislaufsystem eindringen können, und modelliert so einen wichtigen Schritt in der Metastasenkaskade. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Zebrafischembryo-Modell diese Bewertung und eine kürzere Bearbeitungszeit bietet als ähnliche Experimente, die häufig an Mäusen durchgeführt werden.

Das Verfahren wird von Dr. Eric Glasgow demonstriert, der die Zebrafisch-Kernanlage an der Georgetown University leitet. Nachdem Sie Krebszellen, Reagenzien und Zebrafischembryonen gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, schließen Sie das Mikroinjektionsabgabesystem an eine Druckluftquelle an und schalten Sie die Stromquelle ein. Testen Sie den Druck, indem Sie das Fußpedal drücken.

Aus dem Nadelhalter sollte ein kurzer Luftimpuls austreten. Geben Sie 20 Milliliter 2X Tricain-Lösung in eine Injektionsplatte und stellen Sie die Platte auf einen Shaker, um sie auszugleichen. Wiederholen Sie dann die Äquilibrierung mit einem zweiten Aliquot von 2X Tricain.

Verwenden Sie dann eine Plastikpipette, um eine Gruppe von Embryonen in eine kleine Schale zu übertragen, die 2X Tricainlösung enthält. Füllen Sie die Mikroinjektionsnadel mit einer Gelladespitze mit Krebszellen auf. Legen Sie die Nadel mit dem spitzen Ende nach unten in ein Elektrodenaufbewahrungsglas, so dass sich die Zellen in der Nähe der Spitze absetzen.

Übertragen Sie 20 bis 30 anästhesierte Embryonen auf eine Injektionsplatte, indem Sie die Embryonen mit reichlich 2X Tricain in einer Plastikpipette sammeln. Lassen Sie die Embryonen an der Spitze der Pipette absetzen und stoßen Sie sie dann vorsichtig in die Wanne der Injektionsplatte aus, indem Sie die Embryonen über die gesamte Länge der Rinne verteilen. Richten Sie die Embryonen mit dem Kopf nach oben und den Bäuchen zur steilen Wand des Trogs aus.

Befestigen Sie die Nadel am Nadelhalter des Mikromanipulators. Positionieren Sie dann die Injektionsplatte unter dem Stereoskop mit der 60-Grad-Wand nach links und fokussieren Sie auf den oberen Embryo mit 25-facher Vergrößerung. Positionieren Sie den Mikromanipulator so, dass die Nadel den Embryo durchbohrt, wenn sie ausgefahren wird.

Strecken Sie dann die Nadel mit dem Öhr aus, bis sie den Embryo fast berührt. Richten Sie nun beim Blick unter das Mikroskop die Nadel auf den Embryo aus. Um die Zellen zu injizieren, stechen Sie den Embryotrog durch den Dottersack.

Drücken Sie das Fußpedal und platzieren Sie die Spitze direkt auf, aber nicht in der präkardialen Sinus. Durch die Kraft der Injektion werden die Zellen in die Herzhöhle ausgestoßen. Alternativ ermöglicht die Injektion von Zellen in den Dottersack die Untersuchung verschiedener Facetten der Gefäßinvasion, wie im Manuskript beschrieben.

Schieben Sie die Injektionsnadel mit der rechten Hand ein und wieder ein. Nehmen Sie mit der linken Hand Feineinstellungen vor, um den nächsten Embryo zu positionieren. Wenn die gesamte Platte injiziert ist, legen Sie die Nadel wieder in das Elektrodenvorratsgefäß.

Um die Embryonen in die Auffangschale zu übertragen, kippen Sie die Injektionsplatte, um die Embryonen nach unten zu ziehen, waschen Sie alle Embryonen aus dem Trog und verwenden Sie die Plastikpipette, um sie zu sammeln. Lassen Sie die Embryonen sich am Boden der Pipette absetzen und geben Sie die Embryonen dann mit einer minimalen Menge Tricain in die Aufwachschale. Inkubieren Sie die Aufwachschale eine Stunde lang bei 28 Grad Celsius, bevor Sie die lebensfähigen Embryonen von toten Embryonen und Trümmern trennen.

Inkubieren Sie das Gericht bei 33 Grad Celsius, bis es zum Einritzen bereit ist. Nach der Betäubung einer Charge von Embryonen, die gemäß dem Textprotokoll bewertet werden sollen, legen Sie eine betäubte Larve auf einen Objektträger mit Depressionsmikroskop in einem Tropfen Tricain. Richten Sie die Larven seitlich aus, um eine optimale Abbildung der Schwanzregion zu ermöglichen.

Legen Sie den Objektträger auf ein Verbundfluoreszenzmikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse. Bewerten Sie die Larven, indem Sie die Anzahl der Krebszellen zählen, die erfolgreich aus dem Gefäßsystem eingedrungen sind, indem Sie sich durch die Schwanzregion nach oben und unten fokussieren, um intakte Zellen deutlich zu erkennen. 1,5%ige Agarose-Tricain-Lösung schmelzen und auf 37 Grad Celsius bringen.

Nach der Betäubung der Embryonen wie zuvor wird der Embryo in einem Tropfen Tricainlösung auf die bildgebende Oberfläche übertragen. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die überschüssige Tricainlösung zu entfernen, wobei der Embryo auf der Bildgebungsoberfläche verbleibt. Dann einen Tropfen geschmolzene Agaroselösung über den Embryo legen.

Bevor die Agarose polymerisiert, verwenden Sie ein empfindliches Werkzeug wie eine Wimpernbürste, um den Embryo für die Bildgebung seitlich auszurichten, und achten Sie besonders darauf, dass der Embryo entlang der Bildgebungsoberfläche abgeflacht wird. Wenn der Agarosetropfen polymerisiert ist, tauchen Sie ihn in Tricainlösung. Zum Schluss wird der lebende Zebrafischembryo einer mikroskopischen Bildgebung unterzogen.

Von den sieben Brustkrebszelllinien, die in Zebrafischembryonen auf ihre vaskuläre Invasivität getestet wurden, wies die MDA-MB-231-Zelllinie bei der Beurteilung 96 Stunden nach der Injektion die größte Anzahl an extravasierten Krebszellen pro Embryo auf. Es wurde auch beobachtet, dass BT-474-Zellen leicht in die kaudale Region der Embryonen eindrangen, während andere Zelllinien wie MCF-7-, SK-BR-3- und T-47D-Zellen minimalinvasiv waren. In einem modifizierten Asay, der eine andere Injektionsstelle verwendet, wurde ein Wettbewerbsexperiment durchgeführt, bei dem zwei Populationen von MDA-MB-231-Zellen, die sich in ihrer vaskulären invasiven Fähigkeit unterscheiden, gleichzeitig in den Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert wurden.

Bei der Bewertung wurde festgestellt, dass MDA-MB-231-Zellen, die sich vor der Injektion unter konfluenten Kulturbedingungen vermehrt hatten, eine Verringerung der Intravasation in den Blutkreislauf aufwiesen und daher eine reduzierte Präsenz in der kaudalen Region der Embryonen aufwiesen. Sobald sie gemeistert sind, können die Injektionen von Zebrafischembryonen in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, strenge und konsistente Kriterien bei der Bewertung der Extravasation von Krebszellen anzuwenden.

Nach diesem Verfahren können die Ergebnisse in einem Mausmodell weiter validiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Injektionen und die Extravasation durchgeführt werden, um die vaskuläre invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrafischembryonen zu testen.