Name: Impfen Anopheles gambiae Mosquitoes mit Perlen der Melanisierung Immunantwort zu induzieren und Messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Lernen Sie die Inokulationstechnik zur Stimulation der Melanisierungsreaktion bei Anopheles gambiae. Diese Methode ermöglicht die quantitative Messung der Immunantwort und liefert Einblicke in die ökologische Immunologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde durch die Finanzierung der Universität Neuenburg ermöglicht. Wir bedanken uns bei allen Schülern, die bei der Verbesserung dieser Technik mitgeholfen haben, namentlich bei unserem Kollegen Kevin Thievent. Wir bedanken uns auch bei den Mitgliedern des Thomas-Labors, die ihr Labor zur Verfügung gestellt haben. Wir bedanken uns bei Janet Teeple für ihre Hilfe bei der Mückenzucht. Wir möchten uns auch bei Loyal Hall im Labor von Pr. Tom Baker für seine Hilfe bei der Vorbereitung der Mikrokapillarglasröhren bedanken.

1. Kochsalzlösung für die Injektion und Dissection <ol><li> Bereiten Sie die Salzlösung durch Zugabe von NaCl, KCl und CaCl 2 zu destilliertem Wasser 1,3 mM NaCl zu erhalten, 0,5 mM KCl und 0,2 mM CaCl 2 bei pH = 6,8. </li><li> 1 ml 0,1% Methylgrün Lösung auf 99 ml der Kochsalzlösung die transparenten Kügelchen zu färben. Dies ist die 0,001% Methylgrün &quot;Injektionslösung&quot;. </li><li> Dann werden 5 ml 0,1% Methylgrün Lösung zu 45 ml der Salzlösung. Diese 0,01% Methylgrün &quot;dissection Lösung&quot; ist 10mal konzentrierter in Methylgrün die Färbung der Kügelchen und deren Beobachtung während der Dissektion zu erleichtern. HINWEIS: Filter sterilisieren den Puffer, falls erforderlich. </li></ol> 2. Kapillar-Vorbereitung <ol><li> Wärme-Pull - Rohre Mikrokapillare Glas mit einer sehr feinen Spitze etwas größer als die kleinste Kügelchen (φ = 40 &amp; mgr; m) 42 zu erhalten. </li><li> Offene und eindjust jede Kapillare, indem die Spitze mit einer Pinzette zu brechen oder durch die Spitze Absägen. </li></ol> 3. Mosquito aufrichten <ol><li> Hinten A. gambiae bei 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% relative Luftfeuchtigkeit und eine 0.12 Stunden Licht: Dunkel - Zyklus. Halten erwachsenen Weibchen und geben ihnen den Zugang zu einer 10% igen Zuckerlösung. </li></ol> 4. Bead Auswahl mit dem Kapillar <ol><li> Gießen 0,009 g negativ geladenen Kügelchen (40-120 &amp; mgr; m im Durchmesser) in einer 5 cm Petrischale und 5 ml Injektionslösung 30 Minuten im Voraus. HINWEIS: Das Ziel ist der Farbstoff zu lassen, um die Perlen Farbe Perlen Auswahl für die Injektion zu erleichtern. Autoclave die Perlen, wenn sie eine sterile Glas nicht kommen. </li><li> Verwendung einer Kapillare in einer Glühbirne Kapillarpipette montiert, visuell wählen die kleinste bead in 0,1 &amp; mgr; l der Salzlösung unter einem binokularen Mikroskop. HINWEIS: Wenn Sie gleichzeitig mehrere Perlen Impfen, wählen drei Perlen aus einem Gesamtvolumen von 0,1 ul.</li></ol> 5. Mosquito Handhabung und Inokulation <ol><li> Unter Verwendung eines Insekten Absauger, platzieren Sie jede Mücke in einem 50-ml-Tube. </li><li> Kühlen Sie jede Mücke kurz durch das Rohr in zerstoßenem Eis legen (2-5 min). </li><li> Legen Sie eine Mücke auf der rechten Seite unter dem Binokular. </li><li> Unter einem Stereomikroskop, impfen die Mücke mit der Kapillare fest durch die linke Seite der Brusthöhle Kutikula Piercing und dann die Flüssigkeit und den Wulst zu injizieren. HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht wie möglich an die Mücke, indem die Kapillare als senkrecht die Flugmuskeln zu beschädigen. </li><li> Entfernen Sie die Kapillare. </li><li> Mit Feder Entomologie Pinzette, legen jedes Weibchen einzeln in einem 180 ml Kunststoffbecher mit Moskitonetz bedeckt; geben ihnen den Zugang zu einer 10% igen Zuckerlösung. HINWEIS: Vorsicht ist mit der Zuckerlösung erforderlich, da die Mücke auf Zuckerlösung Tropfen stecken bleiben. </li></ol> 6. MosquitoDissection und Bead Fotografie <ol><li> Überprüfen Sie, ob die Mücken am Leben 24 Stunden nach der Impfung sind. Wenn ja, überprüfen Sie ihren Zustand und halten nur die Mücken, die fähig sind zu fliegen. </li><li> Frieren Sie diese Mücken bei -20 ° C. HINWEIS: Sie können mehrere Tage bis Monate vor Dissektion gehalten werden, wenn nötig. </li><li> Entfernen Sie die Moskitos Flügel Pinzette unter dem Binokular auf das 32-fache Vergrößerung verwendet wird. Befestigen Sie die Flügel auf Glasobjektträger mit durchsichtigem Klebeband. Schreiben Sie den Code unten für jede einzelne Mücke verwendet. </li><li> Setzen Sie die Glasobjektträger in einem Scanner und scannen sie bei 1.200 dpi. HINWEIS: Überprüfen Sie, dass der Code für jede einzelne Mücke lesbar ist. </li><li> Auf einem Glasobjektträger und in Sezieren Lösung, verwenden Pinzette den Thorax aus dem Kopf und Bauch zu trennen. </li><li> Öffnen Sie den Thorax mit einer Pinzette die Perlen zu holen. HINWEIS: Perlen, die auf den Bauch nicht bewegen, sind nicht in Kontakt miteinander und die meisten von ihnen schweben frei in ter Hämolymphe. Achten Sie darauf, nicht den Wulst mit der Zange zu brechen, als ein nicht-melanisierten Wulst hart sein kann zu finden. Warten Sie 1 bis 5 min für Perlen Farbe zu erhalten. </li><li> Übertragen Sie die Perlen in einem Tropfen Dissektion Lösung auf einem Glasobjektträger, bevor Sie das Bild. HINWEIS: Keine Notwendigkeit, die Perlen zu waschen. </li><li> Mit einem Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet, nehmen Sie ein digitales Bild von jedem Wulst an einer Standardbeleuchtung Einstellung und 400-facher Vergrößerung. HINWEIS: Die Beleuchtung zwischen den verschiedenen Bilder nicht ändern ihren Vergleich zu ermöglichen. </li></ol> 7. Bildanalyse: Bead Melanisierung <ol><li> Öffnen Sie die Bildanalyse-Software. Klicken Sie auf &quot;Datei&quot; und dann auf &quot;Öffnen&quot; eine Perle Bild zu finden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;zu analysieren.&quot; Klicken Sie auf &quot;Set-Messungen.&quot; Markieren Sie das &quot;bedeuten Grauwert&quot; in der Gruppe &quot;Set-Messungen&quot; Fenster. </li><li> Klicken Sie auf das Kreis-Auswahl-Werkzeug-Symbol. Wählen Sie den Wulst Umfang; bleiben inSeite der Wulst und vermeiden Sie den leuchtenden Halo umgeben. </li><li> Klicken Sie auf das &quot;analysieren&quot; -Menü. Klicken Sie auf &quot;Messen&quot;. Erhalten des mittleren Grauwert und die Größe der Querschnittsfläche der Sicke. <ol><li> Um den melanization Wert jeder Perle zu erhalten, führen Sie die folgende Operation einen Rechner oder Rechner-Software: &quot;256 - Grauwert bedeuten.&quot; Die melanization Maßnahme ist ein Wert zwischen 0 und 256, wobei 0 ein völlig weißes Bild darstellt. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+immune+responses+to+human+and+rodent+Plasmodium+parasite+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species.</a> PLoS pathog. 2 (6), e52(2006).</li>
<li>Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERSPECTIVE%3A+Principles+of+ecological+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Appl%22%5BJournal%5D)">PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology.</a> Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).</li>
<li>Crompton, P. D., Moebius, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Immunity+in+Man+and+Mosquito%3A+Insights+into+Unsolved+Mysteries+of+a+Deadly+Infectious+Disease%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*.</a> Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EVOLUTIONARY+ECOLOGY+OF+INSECT+IMMUNE+DEFENSES%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES.</a> Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).</li>
<li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+phagocytosis+and+melanization+of+bacteria+and+Plasmodium+sporozoites+by+hemocytes+of+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J+parasito%22%5BJournal%5D)">Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti.</a> J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).</li>
<li>Carissimo, G., Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+immunity+of+Anopheles+gambiae+is+highly+compartmentalized%2C+with+distinct+roles+for+RNA+interference+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota.</a> PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).</li>
<li>Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanization+immune+responses+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+parasito%22%5BJournal%5D)">Melanization immune responses in mosquito vectors.</a> Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).</li>
<li>Collins, F., Sakai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+of+a+Plasmodium-refractory+strain+of+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Science. 234 (4776), 607-610 (1986).</li>
<li>Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+immune+responses+to+Sephadex+beads%3A+Involvement+of+anti-Plasmodium+factors+in+regulating+melanization%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization.</a> Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).</li>
<li>Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+metabolism+regulates+reproduction+and+parasite+melanization+in+the+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito.</a> PloS one. 9 (1), e84865(2014).</li>
<li>Cerenius, L., Söderhäll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophenoloxidase-activating+system+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno+Rev%22%5BJournal%5D)">The prophenoloxidase-activating system in invertebrates.</a> Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).</li>
<li>Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proPO-system%3A+pros+and+cons+for+its+role+in+invertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Immuno%22%5BJournal%5D)">The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity.</a> Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).</li>
<li>Moret, Y., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoret%2C+Y+%22Survival+for+immunity%3A+the+price+of+immune+system+activation+for+bumblebee+workers%22">Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers</a>. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).</li>
<li>Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Larval+Nutrition%2C+Adult+Body+Size%2C+and+Adult+Temperature+on+the+Ability+of+Anopheles+gambiae%28Diptera%3A+Culicidae%29+to+Melanize+Sephadex+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads.</a> J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).</li>
<li>Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Mosquito+Age+and+Reproductive+Status+on+Melanization+of+Sephadex+Beads+in+Plasmodium-Refractory+and+-Susceptible+Strains+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae.</a> J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).</li>
<li>Schwartz, A., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanization+of+Plasmodium+falciparum+and+C-25+Sephadex+Beads+by+Field-Caught+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+from+Southern+Tanzania%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania.</a> J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).</li>
<li>Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+melanization+responses+of+Armigeres+subalbatus+against+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads.</a> J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).</li>
<li>Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+immune+responses+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22J+insect+physiol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).</li>
<li>Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overloading+the+immunity+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae+with+multiple+immune+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vector%22%5BJournal%5D)">Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges.</a> Parasite Vector. 9 (1), 210(2016).</li>
<li>Lazzaro, B. P., Rolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danger%2C+Microbes%2C+and+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Danger, Microbes, and Homeostasis.</a> Science. 332 (6025), 43-44 (2011).</li>
<li>Arrighi, R. B. G., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+GPI+toxin%3A+a+common+foe+for+man+and+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+trop%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito.</a> Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).</li>
<li>Michel, K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+immunity+against+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Mosquito immunity against Plasmodium.</a> Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%3A+comparative+and+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics.</a> J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).</li>
<li>Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+and+functional+genomics+of+the+innate+immune+system+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).</li>
<li>Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+RNAi+is+the+major+innate+immune+pathway+controlling+arbovirus+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Future+microbiol%22%5BJournal%5D)">Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission.</a> Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).</li>
<li>Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+dissecting+mosquito+innate+immune+responses+to+arbovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection.</a> J Gen Virol. , (2009).</li>
<li>Schwartz, A., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cost+of+immunity+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti+depends+on+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+evol+biol%22%5BJournal%5D)">The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation.</a> J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).</li>
<li>Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+correlation+between+melanization+and+antibaterial+immune+responses+in+a+natural+population+of+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Evolution. 58 (10), 2377(2004).</li>
<li>Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+immunosuppression+by+a+malaria+parasite+in+its+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).</li>
<li>Sacks, D., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+innate+immunity+by+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+immunol%22%5BJournal%5D)">Evasion of innate immunity by parasitic protozoa.</a> Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).</li>
<li>Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+protozoan+parasites+evade+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Parasito%22%5BJournal%5D)">How protozoan parasites evade the immune response.</a> Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).</li>
<li>Damian, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+immune+evasion+and+exploitation%3A+reflections+and+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections.</a> Parasitology. 115, S169-S175 (1997).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+immune+evasion%3A+a+momentous+molecular+war%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+ecol+evol%22%5BJournal%5D)">Parasite immune evasion: a momentous molecular war.</a> Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+defence%2C+parasite+evasion+strategies+and+their+relevance+for+%26%2334%3Bmacroscopic+phenomena%26%2334%3B+such+as+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for &#34;macroscopic phenomena&#34; such as virulence.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).</li>
<li>Stearns, S. C., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+phenotypic+plasticity+in+life+history+traits-+predictions+of+reaction+norms+for+age+and+size+at+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity.</a> Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).</li>
<li>Stearns, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-history+tactics%3A+a+review+of+the+ideas%5BTitle%5D)+AND+%22Q+rev+biol%22%5BJournal%5D)">Life-history tactics: a review of the ideas.</a> Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).</li>
<li>Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+Reveals+Maintenance+Cost+of+Humoral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity.</a> Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).</li>
<li>Sheldon, B. C., Verhulst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+immunology%3A+costly+parasite+defences+and+trade-offs+in+evolutionary+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Ecol+Evo%22%5BJournal%5D)">Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology.</a> Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).</li>
<li>Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+causes+and+consequences+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Ecol+Evol+S%22%5BJournal%5D)">Evolutionary causes and consequences of immunopathology.</a> Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).</li>
<li>Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implications+of+immunopathology+for+parasite+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The implications of immunopathology for parasite evolution.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).</li>
<li>Cator, L. J., George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BManipulation%26%2334%3B+without+the+parasite%3A+altered+feeding+behaviour+of+mosquitoes+is+not+dependent+on+infection+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">34;Manipulation&#34; without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711(2013).</li>
<li>Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+maternal+effects+after+stimulation+of+the+melanization+response+in+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).</li>
<li>Paskewitz, S., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Plasmodium+refractory+and+susceptible+strains+of+Anopheles+gambiae+to+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+comp+immunol%22%5BJournal%5D)">Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads.</a> Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Diese Injektionstechnik ist nützlich, um die melanization Reaktion in Mücken zu stimulieren und zu studieren. Zum Beispiel, hier untersuchten wir die Wirkung der Immunstimuli Last. Der entscheidende Schritt in diesem Verfahren ist, um richtig die Mücke impfen. Jede übermäßige Schäden an den Flugmuskeln oder die Mücke selbst kann die Mücke von der Fütterung zu verhindern oder sie kann vor der Dissektion töten. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, um die Mücken auf Eis lange genug zu halten, sie...

Insekten verlassen sich auf Immunreaktionen , sich gegen Parasiten zu schützen und Krankheitserreger von 1 bis 3 , die 4 durch ihre Kutikula oder ihre midgut Epithel verletzen. In Mücken, sind diese Reaktionen wirksam gegen Bakterien 5, Viren 6, Filariosen 7 und Malariaparasiten 1,8,9. In Mücken, ein Schlüsselimmunantwort ist die Verkapselung von Fremdpartikeln mit Melanin 10. - 12.. Diese Einkapselung kann in der Mitteldarms oder in der Hämolymphe passieren System zirkulierenden 10 bis 12. Diese melanization Antwort ist das Ergebnis der pro-Phenoloxidase 10 kaskadieren - 12, und es kann zum Tod der Parasiten oder deren Phagozytose führen. Bei erwachsenen Mücken, wo die Anzahl der Hämozyten Zellen beschränkt ist, ist Melanisierung eine humorale Antwort, wie gegen Plasmodium Parasiten oder Filariosen 7.In einigen anderen Insekten ist es direkt die hemocytes Zellen, die sich um den Parasiten sammelt sie 7 bis melanize. Außerdem ist Melanin auch wichtig für mehrere andere physiologische Prozess , wie die Eierproduktion und Hautwunden 7 heilen. Die Stimulation von Immunantworten wird als Werkzeug benutzt , um studieren Insekten Immunität in mehreren landwirtschaftlichen und öffentlichen Gesundheit Modellsysteme 13-18. 16,19 - Es ist in Anopheles gambiae Mücken, die Hauptvektor von Malaria in Afrika, zu studieren Wirt-Parasit - Interaktionen 14 verwendet. Diese Techniken basieren auf der Fähigkeit der Insekten - Parasiten mit ihren Mustererkennungsrezeptoren (PRR) 2 zu erkennen. Stechmücken können auch andere Moleküle mit ihren biology wie pathogen-associated molecular Muster (PAMPs) oder erkennen ihre eigenen geschädigter Zellen durch die Freisetzung von Kollagen und Nukleinsäuren stören detektieren. Die Mücke Immunzelle23 - s wie die Hämocyten werden zur Detektion 20 verwendet. Die wichtigsten Immunsignalwege sind Imd, Toll, JAK / STAT - 24 und Ribonukleinsäure - Interferenz (RNAi) 25,26. Sowohl Toll und Imd Wege beeinflussen die melanization Reaktion und Interaktion mit der pro-Phenoloxidase Kaskade 10 bis 12. Das Standardwerkzeug verwendet, um die melanization Antwort stimulieren ist die Impfung einer Mücke mit einer kleinen Perle in die Hämolymphe der Brusthöhle. Der Grad der Melanin - Verkapselung kann dann 19 gemessen werden , nachdem der Wulst durch die Dissektion der Mücke abruft. In den meisten Studien wurde nur eine Perle pro Mücke injiziert 15,16,27, aber mehr Perlen Injektion möglich ist, um 19 die Grenzen der melanization Antwort zu studieren. Diese Kügelchen injiziert unter Verwendung einer Injektionslösung (physiologische Serum) Störung der Moskito Physiologie zu begrenzen unddie Austrocknung der Mücke 15,16,27. Ein Farbstoff wird zu dieser Lösung gegeben bead Auswahl zu erleichtern. Es ist das gleiche für die Dissektion Lösung verwendet , um den Wulst 15,16,27 abzurufen. Der Vorteil von Insekten mit nicht pathogenen Stimuli Inokulieren ist die Fähigkeit, auf die direkte Wirkung auf die Immunantwort zu konzentrieren. Es gibt keine komplizieren Effekte aufgrund von Parasiten Pathogenität 28, Immunsuppression 29-31 oder Immunevasion 31-34. Außerdem werden die Folgen der Stimulationen auf andere Lebensgeschichte Züge, wie Langlebigkeit oder Fruchtbarkeit, ebenfalls untersucht. So Forscher evolutionäre Ökologie studieren können solche Werkzeuge 2,35,36 erfordern. Zum Beispiel Immunherausgefordert Hummeln haben eine verkürzte Lebensdauer unter Hunger. Ähnliche negative Auswirkungen von Immun Stimulationen und Einsätze haben in verschiedenen Invertebraten Modellen beobachtet, die häufig in einer kurzen ergeber Lebensdauer oder weniger Fortpflanzungserfolg 13,27,37. Solche Studien können in unterschiedlichen Umgebungen 2,4,38 durchgeführt werden. Immunität Anregende ist auch für diejenigen von Interesse direkt auf Immunopathologie 39,40 konzentriert. Dieses Protokoll basiert auf der Inokulation von Kügelchen mit Moskitos die Melanisierung Antwort zu stimulieren und direkt die Menge an Melanin zu messen. Dies ermöglicht eine quantitative und qualitative Untersuchung der melanization Reaktion in verschiedenen experimentellen Bedingungen. Solch ein Werkzeug zur Stimulation anderer Immunreaktionen, wie die antibakterielle Reaktion Bakterien verlängert werden 41 Hitze abgetöteten. Es kann auch in vielen ökologischen Einstellungen durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Mikrokapillarglasröhrchen GB120TF-10</td><td>science-products.com</td><td>GB120TF-10</td><td>http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html</td></tr><tr><td>Microcaps Kapillarpipettenkolben</td><td>Drumond</td><td>1-000-9000</td><td></td></tr><tr><td>negativ geladen Sephadex CM C-25 Kügelchen</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland</td><td>C25120 SIGMA</td><td>brauchen wenige, um zu starten</td></tr><tr><td>Methylgrün</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323829 ALDRICH</td><td>benötigen wenige, um</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Opensource</td><td></td><td>Version 1.47f7 oder höher</td></tr> zu starten</tbody></table>

impfen<em&gt; anopheles gambiae</em&gt; mosquitoes mit perlen der melanisierung immunantwort zu induzieren und messen

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Die Stimulation der Immunantwort ist ein übliches Werkzeug in Invertebraten-Studien, die die Wirksamkeit und die Mechanismen der Immunität zu untersuchen. Diese Stimulation basiert auf der Injektion von nicht-pathogene Partikel in Insekten, da die Partikel durch das Immunsystem erkannt werden, und wird die Produktion von Immun Effektoren induzieren. Wir konzentrieren uns hier auf die Stimulation der Melanisierung Reaktion in der Mücke Anopheles gambiae. Die melanization Reaktion führt zur Verkapselung von Fremdpartikeln und Parasiten mit einer dunklen Schicht von Melanin. mit Mikrokapillare Glasröhren Um diese Reaktion zu stimulieren, Mücken sind mit Perlen in der Brusthöhle impft. Dann, nach 24 Stunden werden die Mücken seziert die Perlen zu holen. Der Grad der Melanisierung des Wulstes gemessen Bildanalyse-Software. Beads nicht die pathogene Wirkung von Parasiten haben oder ihre Fähigkeit, die Immunantwort zu entziehen oder zu unterdrücken. Diese Injektionen sind ein Weg, um Measure Immun Wirksamkeit und die Auswirkungen der Immunstimulationen auf andere Lebensgeschichte Züge, wie Fruchtbarkeit oder Langlebigkeit. Es ist nicht genau das gleiche wie direkt Wirt-Parasit-Wechselwirkungen zu studieren, aber es ist ein interessantes Tool, Immunität und seine evolutionäre Ökologie zu studieren.

<html> Stechmücken nicht alle melanize die Perlen in der gleichen Weise, wie einige Perlen weniger mit Melanin bedeckt waren als andere (Abbildung 1). Tatsächlich blieben einige Perlen wegen eines Mangels an melanization blau, während andere völlig dunkel waren (Abbildung 1). Der Melanisierung Wert wurde durch lineare Interpolation auf einen Wert zwischen 0 standardisiert (was zu einem blauen und unmelanized bead entsprach) und 100 (entsprechend einer dun...

Durch die Inokulation mit Kügelchen ermöglicht die beschriebene Technik die Stimulation der Melanisierungsreaktion der Mücken im Hämolymph-Kreislaufsystem. Die Menge an Melanin, die die Kügelchen bedeckt, kann nach der Dissektion als Maß für die Immunantwort gemessen werden.

Impfen<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Mosquitoes mit Perlen der Melanisierung Immunantwort zu induzieren und Messen

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Das übergeordnete Ziel dieser Impftechnik ist es, die Immunantwort der Mücke zu stimulieren und die Melanisierungsreaktion zu messen. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der ökologischen Immunologie zu beantworten, einschließlich der genetischen Grundlagen für die Kosten der menschlichen Reaktion und des Einflusses von Umweltfaktoren. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Immunisierungsreaktion geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die antivirale oder antibakterielle Reaktion in anderen wirbellosen Systemen.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Insektenschäden, die die Injektion verursachen kann, Schwierigkeiten haben. Fügen Sie einen Milliliter 0,1%ige Methylgrünlösung zu 99 Millilitern der Kochsalzlösung hinzu, um die transparenten Kügelchen zu färben. Dies ist die 0,001%ige methylgrüne Injektionslösung.Fügen Sie dann fünf Milliliter 0,1%ige Methylgrünlösung zu 45 Millilitern der Kochsalzlösung hinzu. Diese 0,01%ige Methylgrün-Dissektionslösung ist 10-mal stärker in Methylgrün konzentriert, um die Färbung der Kügelchen und ihre Beobachtung während der Dissektion zu erleichter

inoculating-anopheles-gambiae-mosquitoes-with-beads-to-induce-measure

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Anopheles stephensi Mücken sind Vektoren für Malaria bewohnen Indien und ganz Asien. Dieses Video zeigt die Technik für die Durchführung microinjections dieser Art mit Transgene, dass Widerstand gegen die Malaria, die Mücke wird zu verleihen. Ein großer Teil der Methodik in diesem Video gezeigt, ist für die Mikroinjektion Techniken anderer Mückenarten.

Injektion eines. stephensi Embryonen zu generieren Malaria-resistenter Moskitos

In diesem Video demonstrieren wir die Verabreichung des Gene-Drive-Konstrukts in den Embryo der Anopheles gambiae Mücke durch die Mikroinjektionstechnik des Embryos. Dieses Verfahren ermöglicht die Integration des gelieferten DNA-Konstrukts durch homologe Rekombination in die Keimbahnzellen, um eine transformierte Mückenpopulation zu erzeugen.

Mikroinjektion von Mückenembryonen: Eine Technik zur Verabreichung exogener DNA in das Eigelb des Embryos von Anopheles gambiae, um Keimbahnmutationen zu erzeugen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Immunisierung eines Mausmodells mit lebenden abgeschwächten Sporozoiten. Die strahlengedämpften  Plasmodium-Sporozoiten werden in die dorsale Seite des Ohrs der Maus injiziert. Nach Injektionen an mehreren Stellen auf beiden Ohren kann sich die Maus erholen.

Intradermale Immunisierung mit lebenden abgeschwächten Sporozoiten in einem Mausmodell

Koinfektion beim Menschen ist in vitro schwer zu replizieren. Humane Malariaparasiten können jedoch problemlos in vitro kultiviert werden, ebenso wie frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut, die auf natürliche Weise mit HIV infiziert sind. Dies stellt ein hervorragendes Modell dar, um frühe Immunantworten auf Malariaparasiten im Rahmen einer HIV-Koinfektion zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Isolierung myeloischer Zellen aus der Maushaut und der Drainage von Lymphknoten nach intradermaler  Injektion von Plasmodium-Sporozoiten. Die Durchflusszytometrie der gesammelten Zellen bietet einen zuverlässigen Assay zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion der Haut und der Drainage von Lymphknoten auf den Parasiten.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Wir beschreiben ein Mausmodell der experimentellen zerebralen Malaria und zeigen, wie entzündliche und mikrovaskuläre Pathologien in vivo mit Hilfe der Magnetresonanztomographie verfolgt werden können.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Mikroinjektionstechniken sind unerlässlich, um exogene Gene in die Genome von Moskitos einzuführen. Dieses Protokoll erklärt eine Methode, die vom James-Labor verwendet wird, um DNA-Konstrukte in Anopheles gambiae-Embryonen zu mikroinjizieren, um transformierte Moskitos zu erzeugen.

Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Lernen Sie die Inokulationstechnik zur Stimulation der Melanisierungsreaktion bei Anopheles gambiae. Diese Methode ermöglicht die quantitative Messung der Immunantwort und liefert Einblicke in die ökologische Immunologie.

Impfen

Weitere Videos entdecken