Name: In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie die in-vitro-Differenzierung von humanen CD4+ FOXP3+ induzierten regulatorischen T-Zellen aus naiven CD4+ T-Zellen mit einem TGF-β-Protokoll. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Phänotypisierung für immunologische Forschung.

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Nina Nagel ist dankbar für ihre technische Unterstützung während des Videodrehs und der experimentellen Vorbereitung. Wir danken Eva-Maria Weiss für die Hilfe beim intrazellulären FOXP3-Färbeprotokoll und Elisabeth Suri-Payer und Nina Oberle für die Etablierung des nTreg-Isolierprotokolls. Matilda Eriksson und Peri Noori werden für die Leitung des Labors ausgezeichnet. 
Finanzierung: A.S. wurde durch ein Marie Curie Intra European Fellowship im Rahmen des 7. Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft, die Dr. Åke Olsson Stiftung und KI Forschungsstiftungen unterstützt; A.S. und J.T. wurden durch ein CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular Disease) Stipendium unterstützt, J.T. wurde unterstützt von Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance und Stockholm County Council.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die robuste Induktion von menschlichen CD4 + FOXP3 + iTregs von menschlichen naiven CD4 + T - Zellen. Es enthält ein neues Protokoll , das wir vor kurzem beschrieben, eine Kombination aus TGF-β unter Verwendung ATRA und Rapamycin, für die Induktion von iTregs mit überlegener in vitro suppressive Funktion 22. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen, ist ein weiterer Vorteil der Induktion verschiedener iTreg Populationen parallel von untersc...

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatorischen T - Zellen (Tregs) unterdrücken andere Immunzellen und sind kritische Vermittler der peripheren Toleranz, die Verhütung von Autoimmun- und übermäßige Entzündung 1. Die Bedeutung der Treg wird von der menschlichen Krankheit immunodysregulation Polyendokrinopathie Enteropathie X-chromosomal-Syndrom (IPEX), in dem Verlust von Treg aufgrund von Mutationen in der `Master&#39; Treg Transkriptionsfaktor forkhead Feld P3 (FOXP3) führt zu schweren systemischen Autoimmunerkrankung exemplifiziert, tödlich in einem frühen Alter. Allerdings wirken Tregs als zweischneidiges Schwert in das Immunsystem , wie sie auch Antitumor - Immunität in bestimmten Einstellungen 2 behindern. Die therapeutische Beeinflussung von Treg Anzahl und Funktion ist deshalb Gegenstand zahlreicher klinischer Untersuchungen. Bei Krebs Erschöpfung der Tregs kann wünschenswert sein , und einige Erfolg klinischer Ansätze fördert die weitere Forschung 3. In Autoimmun- und Entzündungserkrankungen, zusätzlich zu den therapeutischen Wirkungen von Treg in seveNeueste in-Man - Studien von Adoptiv Treg Transfer ral Maus Krankheitsmodelle, um zu verhindern Graft - versus -host Erkrankung (GvHD) 4 - 7 und die Sicherheit zu bewerten bei Typ - 1 - Diabetes 8 zeigten vielversprechende Ergebnisse zu behandeln. Natürlich vorkommende Treg (nTregs) Thymus abgeleitete tTregs umfassen und peripher induzierte pTregs, mit nicht-redundanten wesentlichen Funktionen in die Aufrechterhaltung der Gesundheit von 9 bis 11. Allerdings sind nTreg Zahlen begrenzt, die komplementären Ansatz zur Induktion Tregs (iTregs) in vitro aus naiven T - Zell - Vorläufer 12 ermutigend. Noch Stabilität iTregs, vermutlich aufgrund des Fehlens von Demethylierung in der sogenannten Treg-spezifischen demethylierten Bereich (TSDR) im FOXP3 Genlocus 13 bleibt ein Problem und einige Studien zeigen , dass Treg in vivo induziert 14 stabiler sind. Bis heute bleibt FOXP3 das beste Protein mArker für Tregs , aber es ist nicht absolut spezifisch , weil die menschliche konventionellen CD4 + CD25 - T - Zellen transient Zwischenstufen FOXP3 auf 15,16 Aktivierung auszudrücken. Obwohl erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung der Regulation der Foxp3-Expression erzielt wurden, bleibt noch viel vor allem in menschlichen Zellen in Bezug auf die Induktion, Stabilität und Funktion von FOXP3 entdeckt zu werden. Trotz der Unterschiede zu nTregs, in vitro induzierten FOXP3 + CD4 + T - Zellen können als Modellsystem verwendet werden , um molekulare Mechanismen der FOXP3 Induktion zu studieren und als Ausgangspunkt zu entwickeln Protokolle in die Zukunft , die für die Erzeugung von iTregs ermöglichen , die mehr sind ähnlich wie in vivo erzeugt Tregs, die für Adoptivtransfer - Strategien in der Zukunft anwendbar sein könnte. Es gibt keine `Gold Standard&#39; Protokoll für die menschliche iTregs induzieren und aktuellen Protokolle auf nachahmt Treg-induzierenden Bedingungen in vivo entwickelt basiert: Interleukin 2 (IL-2) Und β - Wachstumsfaktor (TGF-β) Signalisierungs Transformation für FOXP3 Induktion in vivo entscheidend 17 und all-trans - Retinsäure (ATRA) - , die in vivo durch darmassoziierten dendritischen Zellen produziert wird - verwendet wird , häufig FOXP3 Induktion zu verbessern in vitro 18-21. Wir haben zusätzliche menschliche Treg-induzierende Protokolle Butyrat 22, einen Darmmikrobiota gewonnenen Fettsäure kurzkettigen mit entwickelt , die vor kurzem murine Treg Induktion 23,24 zu erhöhen wurde gezeigt. Wir stellten auch vor kurzem ein neues Protokoll für die Erzeugung von iTregs mit überragender Unterdrückungsfunktion in vitro durch eine Kombination von TGF-β mit ATRA und 22 Rapamycin, letztere eine klinisch zugelassenen mammalian target of Rapamycin (mTOR) sein Inhibitor, der bekannt ist , zu fördern FOXP3 Wartung während der menschlichen Treg Expansion 25,26. Diese Methode beschreibt die reproduzierbarvitro - Erzeugung von humanen CD4 + FOXP3 + iTregs eine Reihe von verschiedenen Bedingungen verwendet, und deren anschließende Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie und quantitative reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) protokollspezifische Muster der Expression von FOXP3 und andere Treg Signatur - Moleküle zu offenbaren solche wie CD25, CTLA-4, EOS, sowie Unterdrückung von IFN-γ und SATB1 Ausdruck 22. Die erzeugten Zellpopulationen können für funktionelle Assays verwendet werden, unterdrückende Aktivität in Bezug auf oder für molekulare Studien, entweder allgemeine FOXP3 Regulierer über oder Effekte für bestimmte Verbindungen wie Butyrat oder Rapamycin zu studieren. Ein weiteres Verständnis der molekularen Mechanismen Treg Differenzierung der Fahrt ist sehr relevant für zukünftige therapeutische Ansätze für Autoimmun- oder Krebs gezielt Moleküle in Treg Generation und Funktion beteiligt Ziel.

<table><tbody><tr><td>All-trans-Retinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-human Foxp3-APC Klon 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-humane CD25-Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-humaner CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-humaner CD28-Antikörper, LEAF gereinigt&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD3-Antikörper, LEAF gereinigt&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45RO PE-Klon UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD4-PerCP-Klon SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD8-eFluor 450 (Klon OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CTLA-4 (CD152), Klon BNI3, mIgG2ak, Brilliant Violet 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IFN-g FITC-Klon 4S. B3; mIgG1k eBiowissenschaften</td><td></td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A-haltige Lösung: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029 cDNA-Synthesekit</td><td></td></tr><tr><td>: SuperScript VILO (Reverse Transkriptase) cDNA-Synthesekit</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Dichtezentrifugationsmedium: Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99,7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, hitzeinaktiviertes</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 oder 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Färbepuffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Achtung: Enthält Paraformaldehyd. Kann auch in einem kombinierten Kit mit Antikörper gekauft werden; 77-5774-40 Anti-Human-Foxp3-Färbeset APC-Klon: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>humanes naives CD4-T-Zell-Isolationskit II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Humanserumalbumin 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin aus Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 K Isotypkontrolle APC Klon: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 K Isotypsteuerung FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2a Isotypkontrolle, Brillantviolett 421, Klon MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette Kunststoff, einzeln verpackt</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-Myristat-13-acetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-2, CF</td><td>R& D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Isolationskit: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Mittel;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T-Zell-Kulturmedium: X-Vivo 15 Medium, mit Gentamicin + Phenolrot</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressionsassay, FOXP3 (beste Abdeckung) & nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; Assay-ID: Hs01085834_m1</td><td>Achtung: enthält Paraformaldehyd</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (beste Abdeckung)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; Assay-ID: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Achtung: enthält Paraformaldehyd</td></tr><tr><td>TaqMan Genexpression Mastermix</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differenzierung von humanen cd4 + foxp3 + induced regulatorischer t - zellen (itregs) von naïve cd4 + t - zellen unter verwendung eines tgf-β-enthaltende protokoll

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind ein integraler Bestandteil der peripheren Toleranz, unterdrücken Immunreaktionen gegen Selbststrukturen und beugen so Autoimmunerkrankungen vor. Klinische Ansätze zum adoptiven Transfer von Tregs oder zur Depletion von Tregs bei Krebs sind im Gange und zeigen vielversprechende erste Ergebnisse. 
Da die Anzahl der natürlich vorkommenden Tregs (nTregs) sehr begrenzt ist, kann die Untersuchung bestimmter Treg-Merkmale mit in vitro induzierten Tregs (iTregs) vorteilhaft sein. Bisher ist der beste, wenn auch nicht absolut spezifische Proteinmarker zur Abgrenzung von Tregs der Transkriptionsfaktor FOXP3. Trotz der Bedeutung von Tregs, einschließlich der nicht-redundanten Rolle von peripher induzierten Tregs, sind die Protokolle zur Erzeugung von iTregs derzeit umstritten, insbesondere für menschliche Zellen. Dieses Protokoll beschreibt daher die in vitro Differenzierung von humanen CD4+FOXP3+ iTregs aus humanen naiven T-Zellen unter Verwendung einer Reihe von Treg-induzierenden Faktoren (TGF-β plus IL-2 nur oder deren Kombination mit Retinsäure, Rapamycin oder Butyrat) parallel. Es wird auch die Phänotypisierung dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie und qRT-PCR beschrieben. 
Diese Protokolle führen zu einer reproduzierbaren Expression von FOXP3 und anderen Treg-Signaturgenen und ermöglichen die Untersuchung allgemeiner FOXP3-Regulationsmechanismen sowie protokollspezifischer Effekte, um den Einfluss bestimmter Faktoren abzugrenzen. iTregs können verwendet werden, um verschiedene phänotypische Aspekte sowie molekulare Mechanismen der Treg-Induktion zu untersuchen. Detaillierte molekulare Studien werden durch relativ große Zellzahlen, die gewonnen werden können, erleichtert. 
Eine Einschränkung für die Anwendung von iTregs ist die relative Instabilität der FOXP3-Expression in diesen Zellen im Vergleich zu nTregs. iTregs, die durch diese Protokolle erzeugt werden, können auch für funktionelle Assays verwendet werden, wie z.B. die Untersuchung ihrer suppressiven Funktion, bei denen iTregs, die durch TGF-β plus Retinsäure und Rapamycin induziert werden, eine überlegene suppressive Aktivität zeigen. Die Suppressionsfähigkeit von iTregs kann sich jedoch von der von nTregs unterscheiden, und die Verwendung geeigneter Kontrollen ist entscheidend.

Abbildung 1 zeigt ein Schema des experimentellen Aufbaus. Figur 2 zeigt eine repräsentative Reinheitskontrolle Färbung für magnetisch isoliert naive CD4 + T - Zellen und nTregs. B ild 3A zeigt die Durchflusszytometrie Gating - Strategie und 3B zeigt repräsentative FOXP3 und CD25 - Zytometrie Anfärbungen am Tag fließen 6 der Kultur unter den angegebe...

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, humane FOXP3-positive regulatorische T-Zellen aus naiven CD4-T-Zellen in vitro zu induzieren und ihren Phänotyp zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der T-Zell-Immunologie zu beantworten, z. B. wie die regulatorische T-Zell-Differenzierung auf molekularer Ebene abläuft. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen FOXP3-positiven regulatorischen T-Zellen ermöglicht.Obwohl diese Methode Einblicke in die regulatorische T-Zell-Differenzierung liefern kann, kann sie auch modifiziert werden, um andere CD4-T-Zell-Untergruppen und andere Immunzellen von Interesse zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Isolierung von PBMC- und magnetischen Bits leicht zu verstehen sind, wenn sie gezeigt und nicht beschrieben werden. Um periphere Blut-T-Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit der Zugabe von 15 Millilitern Dichtegradientenmedium bei Raumtemperatur in fünf 50-Milliliter-Röhrchen pro Buffy-Coat und bringen Sie das endgültige Volumen des Buffy-Coats mit PBS bei Raumtempe

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

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In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll (Video) | JoVE Journal

In vitro Differenzierung von humanen CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 ⁺ T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

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