Name: In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie die in-vitro-Differenzierung von humanen CD4+ FOXP3+ induzierten regulatorischen T-Zellen aus naiven CD4+ T-Zellen mit einem TGF-β-Protokoll. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Phänotypisierung für immunologische Forschung.

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Nina Nagel ist dankbar für ihre technische Unterstützung während des Videodrehs und der experimentellen Vorbereitung. Wir danken Eva-Maria Weiss für die Hilfe beim intrazellulären FOXP3-Färbeprotokoll und Elisabeth Suri-Payer und Nina Oberle für die Etablierung des nTreg-Isolierprotokolls. Matilda Eriksson und Peri Noori werden für die Leitung des Labors ausgezeichnet. 
Finanzierung: A.S. wurde durch ein Marie Curie Intra European Fellowship im Rahmen des 7. Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft, die Dr. Åke Olsson Stiftung und KI Forschungsstiftungen unterstützt; A.S. und J.T. wurden durch ein CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular Disease) Stipendium unterstützt, J.T. wurde unterstützt von Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance und Stockholm County Council.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die robuste Induktion von menschlichen CD4 + FOXP3 + iTregs von menschlichen naiven CD4 + T - Zellen. Es enthält ein neues Protokoll , das wir vor kurzem beschrieben, eine Kombination aus TGF-β unter Verwendung ATRA und Rapamycin, für die Induktion von iTregs mit überlegener in vitro suppressive Funktion 22. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen, ist ein weiterer Vorteil der Induktion verschiedener iTreg Populationen parallel von untersc...

CD4 + CD25 + FOXP3 + regulatorischen T - Zellen (Tregs) unterdrücken andere Immunzellen und sind kritische Vermittler der peripheren Toleranz, die Verhütung von Autoimmun- und übermäßige Entzündung 1. Die Bedeutung der Treg wird von der menschlichen Krankheit immunodysregulation Polyendokrinopathie Enteropathie X-chromosomal-Syndrom (IPEX), in dem Verlust von Treg aufgrund von Mutationen in der `Master&#39; Treg Transkriptionsfaktor forkhead Feld P3 (FOXP3) führt zu schweren systemischen Autoimmunerkrankung exemplifiziert, tödlich in einem frühen Alter. Allerdings wirken Tregs als zweischneidiges Schwert in das Immunsystem , wie sie auch Antitumor - Immunität in bestimmten Einstellungen 2 behindern. Die therapeutische Beeinflussung von Treg Anzahl und Funktion ist deshalb Gegenstand zahlreicher klinischer Untersuchungen. Bei Krebs Erschöpfung der Tregs kann wünschenswert sein , und einige Erfolg klinischer Ansätze fördert die weitere Forschung 3. In Autoimmun- und Entzündungserkrankungen, zusätzlich zu den therapeutischen Wirkungen von Treg in seveNeueste in-Man - Studien von Adoptiv Treg Transfer ral Maus Krankheitsmodelle, um zu verhindern Graft - versus -host Erkrankung (GvHD) 4 - 7 und die Sicherheit zu bewerten bei Typ - 1 - Diabetes 8 zeigten vielversprechende Ergebnisse zu behandeln. Natürlich vorkommende Treg (nTregs) Thymus abgeleitete tTregs umfassen und peripher induzierte pTregs, mit nicht-redundanten wesentlichen Funktionen in die Aufrechterhaltung der Gesundheit von 9 bis 11. Allerdings sind nTreg Zahlen begrenzt, die komplementären Ansatz zur Induktion Tregs (iTregs) in vitro aus naiven T - Zell - Vorläufer 12 ermutigend. Noch Stabilität iTregs, vermutlich aufgrund des Fehlens von Demethylierung in der sogenannten Treg-spezifischen demethylierten Bereich (TSDR) im FOXP3 Genlocus 13 bleibt ein Problem und einige Studien zeigen , dass Treg in vivo induziert 14 stabiler sind. Bis heute bleibt FOXP3 das beste Protein mArker für Tregs , aber es ist nicht absolut spezifisch , weil die menschliche konventionellen CD4 + CD25 - T - Zellen transient Zwischenstufen FOXP3 auf 15,16 Aktivierung auszudrücken. Obwohl erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung der Regulation der Foxp3-Expression erzielt wurden, bleibt noch viel vor allem in menschlichen Zellen in Bezug auf die Induktion, Stabilität und Funktion von FOXP3 entdeckt zu werden. Trotz der Unterschiede zu nTregs, in vitro induzierten FOXP3 + CD4 + T - Zellen können als Modellsystem verwendet werden , um molekulare Mechanismen der FOXP3 Induktion zu studieren und als Ausgangspunkt zu entwickeln Protokolle in die Zukunft , die für die Erzeugung von iTregs ermöglichen , die mehr sind ähnlich wie in vivo erzeugt Tregs, die für Adoptivtransfer - Strategien in der Zukunft anwendbar sein könnte. Es gibt keine `Gold Standard&#39; Protokoll für die menschliche iTregs induzieren und aktuellen Protokolle auf nachahmt Treg-induzierenden Bedingungen in vivo entwickelt basiert: Interleukin 2 (IL-2) Und β - Wachstumsfaktor (TGF-β) Signalisierungs Transformation für FOXP3 Induktion in vivo entscheidend 17 und all-trans - Retinsäure (ATRA) - , die in vivo durch darmassoziierten dendritischen Zellen produziert wird - verwendet wird , häufig FOXP3 Induktion zu verbessern in vitro 18-21. Wir haben zusätzliche menschliche Treg-induzierende Protokolle Butyrat 22, einen Darmmikrobiota gewonnenen Fettsäure kurzkettigen mit entwickelt , die vor kurzem murine Treg Induktion 23,24 zu erhöhen wurde gezeigt. Wir stellten auch vor kurzem ein neues Protokoll für die Erzeugung von iTregs mit überragender Unterdrückungsfunktion in vitro durch eine Kombination von TGF-β mit ATRA und 22 Rapamycin, letztere eine klinisch zugelassenen mammalian target of Rapamycin (mTOR) sein Inhibitor, der bekannt ist , zu fördern FOXP3 Wartung während der menschlichen Treg Expansion 25,26. Diese Methode beschreibt die reproduzierbarvitro - Erzeugung von humanen CD4 + FOXP3 + iTregs eine Reihe von verschiedenen Bedingungen verwendet, und deren anschließende Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie und quantitative reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) protokollspezifische Muster der Expression von FOXP3 und andere Treg Signatur - Moleküle zu offenbaren solche wie CD25, CTLA-4, EOS, sowie Unterdrückung von IFN-γ und SATB1 Ausdruck 22. Die erzeugten Zellpopulationen können für funktionelle Assays verwendet werden, unterdrückende Aktivität in Bezug auf oder für molekulare Studien, entweder allgemeine FOXP3 Regulierer über oder Effekte für bestimmte Verbindungen wie Butyrat oder Rapamycin zu studieren. Ein weiteres Verständnis der molekularen Mechanismen Treg Differenzierung der Fahrt ist sehr relevant für zukünftige therapeutische Ansätze für Autoimmun- oder Krebs gezielt Moleküle in Treg Generation und Funktion beteiligt Ziel.

<table><tbody><tr><td>All-trans-Retinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-human Foxp3-APC Klon 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-humane CD25-Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-humaner CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-humaner CD28-Antikörper, LEAF gereinigt&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD3-Antikörper, LEAF gereinigt&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45RO PE-Klon UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD4-PerCP-Klon SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD8-eFluor 450 (Klon OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CTLA-4 (CD152), Klon BNI3, mIgG2ak, Brilliant Violet 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IFN-g FITC-Klon 4S. B3; mIgG1k eBiowissenschaften</td><td></td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A-haltige Lösung: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029 cDNA-Synthesekit</td><td></td></tr><tr><td>: SuperScript VILO (Reverse Transkriptase) cDNA-Synthesekit</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Dichtezentrifugationsmedium: Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99,7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, hitzeinaktiviertes</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 oder 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Färbepuffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Achtung: Enthält Paraformaldehyd. Kann auch in einem kombinierten Kit mit Antikörper gekauft werden; 77-5774-40 Anti-Human-Foxp3-Färbeset APC-Klon: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>humanes naives CD4-T-Zell-Isolationskit II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Humanserumalbumin 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin aus Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 K Isotypkontrolle APC Klon: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 K Isotypsteuerung FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2a Isotypkontrolle, Brillantviolett 421, Klon MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette Kunststoff, einzeln verpackt</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-Myristat-13-acetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-2, CF</td><td>R& D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Isolationskit: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Mittel;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T-Zell-Kulturmedium: X-Vivo 15 Medium, mit Gentamicin + Phenolrot</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Genexpressionsassay, FOXP3 (beste Abdeckung) & nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4331182; Assay-ID: Hs01085834_m1</td><td>Achtung: enthält Paraformaldehyd</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (beste Abdeckung)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351370; Assay-ID: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Achtung: enthält Paraformaldehyd</td></tr><tr><td>TaqMan Genexpression Mastermix</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differenzierung von humanen cd4 + foxp3 + induced regulatorischer t - zellen (itregs) von naïve cd4 + t - zellen unter verwendung eines tgf-β-enthaltende protokoll

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind ein integraler Bestandteil der peripheren Toleranz, unterdrücken Immunreaktionen gegen Selbststrukturen und beugen so Autoimmunerkrankungen vor. Klinische Ansätze zum adoptiven Transfer von Tregs oder zur Depletion von Tregs bei Krebs sind im Gange und zeigen vielversprechende erste Ergebnisse. 
Da die Anzahl der natürlich vorkommenden Tregs (nTregs) sehr begrenzt ist, kann die Untersuchung bestimmter Treg-Merkmale mit in vitro induzierten Tregs (iTregs) vorteilhaft sein. Bisher ist der beste, wenn auch nicht absolut spezifische Proteinmarker zur Abgrenzung von Tregs der Transkriptionsfaktor FOXP3. Trotz der Bedeutung von Tregs, einschließlich der nicht-redundanten Rolle von peripher induzierten Tregs, sind die Protokolle zur Erzeugung von iTregs derzeit umstritten, insbesondere für menschliche Zellen. Dieses Protokoll beschreibt daher die in vitro Differenzierung von humanen CD4+FOXP3+ iTregs aus humanen naiven T-Zellen unter Verwendung einer Reihe von Treg-induzierenden Faktoren (TGF-β plus IL-2 nur oder deren Kombination mit Retinsäure, Rapamycin oder Butyrat) parallel. Es wird auch die Phänotypisierung dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie und qRT-PCR beschrieben. 
Diese Protokolle führen zu einer reproduzierbaren Expression von FOXP3 und anderen Treg-Signaturgenen und ermöglichen die Untersuchung allgemeiner FOXP3-Regulationsmechanismen sowie protokollspezifischer Effekte, um den Einfluss bestimmter Faktoren abzugrenzen. iTregs können verwendet werden, um verschiedene phänotypische Aspekte sowie molekulare Mechanismen der Treg-Induktion zu untersuchen. Detaillierte molekulare Studien werden durch relativ große Zellzahlen, die gewonnen werden können, erleichtert. 
Eine Einschränkung für die Anwendung von iTregs ist die relative Instabilität der FOXP3-Expression in diesen Zellen im Vergleich zu nTregs. iTregs, die durch diese Protokolle erzeugt werden, können auch für funktionelle Assays verwendet werden, wie z.B. die Untersuchung ihrer suppressiven Funktion, bei denen iTregs, die durch TGF-β plus Retinsäure und Rapamycin induziert werden, eine überlegene suppressive Aktivität zeigen. Die Suppressionsfähigkeit von iTregs kann sich jedoch von der von nTregs unterscheiden, und die Verwendung geeigneter Kontrollen ist entscheidend.

Abbildung 1 zeigt ein Schema des experimentellen Aufbaus. Figur 2 zeigt eine repräsentative Reinheitskontrolle Färbung für magnetisch isoliert naive CD4 + T - Zellen und nTregs. B ild 3A zeigt die Durchflusszytometrie Gating - Strategie und 3B zeigt repräsentative FOXP3 und CD25 - Zytometrie Anfärbungen am Tag fließen 6 der Kultur unter den angegebe...

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, humane FOXP3-positive regulatorische T-Zellen aus naiven CD4-T-Zellen in vitro zu induzieren und ihren Phänotyp zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der T-Zell-Immunologie zu beantworten, z. B. wie die regulatorische T-Zell-Differenzierung auf molekularer Ebene abläuft. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen FOXP3-positiven regulatorischen T-Zellen ermöglicht.Obwohl diese Methode Einblicke in die regulatorische T-Zell-Differenzierung liefern kann, kann sie auch modifiziert werden, um andere CD4-T-Zell-Untergruppen und andere Immunzellen von Interesse zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Isolierung von PBMC- und magnetischen Bits leicht zu verstehen sind, wenn sie gezeigt und nicht beschrieben werden. Um periphere Blut-T-Zellen zu isolieren, beginnen Sie mit der Zugabe von 15 Millilitern Dichtegradientenmedium bei Raumtemperatur in fünf 50-Milliliter-Röhrchen pro Buffy-Coat und bringen Sie das endgültige Volumen des Buffy-Coats mit PBS bei Raumtemperatur auf 180 Milliliter.Kippen Sie dann ein Röhrchen mit Dichtegradientenmedium zur Seite und schichten Sie langsam etwa 35 Milliliter verdünntes Blut auf das Dichtegradientenmedium, ohne die Lösungen zu mischen. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Übertragen Sie dann die weißen PBMC-Schichten zwischen dem Dichtegradienten und den Plasmaphasen aus jedem Röhrchen in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie das PBMC mit 200 Millilitern frischem PBS und suspendieren Sie die Pellets in vollständigem Medium, um die peripheren Blutmonozyten durch plastische Adhärenz zu erschöpfen. Nach dem Sammeln der schwimmenden Zellen wird das PBMC dreimal in bis zu 50 Millilitern frischem PBS gewaschen und das endgültige Pellet in 40 Mikrolitern Isolationspuffer mit vier Grad Celsius und 10 Mikrolitern naiver CD4-positiver T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail pro einmal 10 bis zu den siebten Zellen durch gründliches Mischen erneut suspendiert. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius, waschen Sie dann die Zellen mit 40 Millilitern PBS und suspendieren Sie das Pellet in 80 Mikrolitern Isolationspuffer und 20 Mikrolitern Anti-Biotin-Mikrokügelchen pro einmal 10 bis zu den siebten Zellen für eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius.Während die Zellen inkubieren, setzen Sie eine LS-Säule auf einen Magneten und äquilibrieren Sie sie mit drei Millilitern Isolationspuffer, waschen Sie dann die Zellen in 50 Millilitern PBS und suspendieren Sie das Pellet wieder in drei Millilitern frischem Isolationspuffer. Geben Sie nun die Zellen in die Säule und sammeln Sie den naiven CD4-positiven T-Zell-haltigen Durchfluss in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn die Säule aufhört zu tropfen, spülen Sie das Röhrchen mit zwei Millilitern Isolationspuffer und übertragen Sie die Wäsche in die Säule.Nach dem letzten Waschen pelletieren Sie die magnetisch sortierten T-Zellen durch Zentrifugation, gefolgt von zwei Wäschen in 15 Millilitern Medium, was zu einer mehr als 94%reinen naiven CD4-positiven T-Zellpopulation führt. Um regulatorische T-Zellen zu induzieren, geben Sie 50 Mikroliter der entsprechenden Stimuli in die entsprechenden Vertiefungen einer Anti-CD3-beschichteten 96-Well-Platte. Füllen Sie dann die leeren Vertiefungen, einschließlich der Randvertiefungen, mit 200 Mikrolitern PBS und wärmen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid vor.Passen Sie die Konzentration der ruhenden naiven T-Zellen auf 2,2 bis 2,6 mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter Dichte in 37 Grad Celsius Medium an und fügen Sie 50 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung hinzu. Wenn alle Zellen ausgesät sind, wickeln Sie die Platte zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie ein und legen Sie die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator. Nach zwei bis drei Tagen sollten kleine Ansammlungen von proliferierenden Zellen, die zu späteren Zeitpunkten zu größeren Ansammlungen entstehen, lichtmikroskopisch sichtbar werden.Nach vier bis sechs Tagen wechselt das Medium von leicht orange zu gelblich, und die gehäuften Zellpellets sind mit bloßem Auge sichtbar. Um die Expression von Zelloberflächenmarkern zu bewerten, verwenden Sie eine Pipette, um die Zellen in jeder Vertiefung wieder zu suspendieren, und übertragen Sie die Zellen in eine neue 96-Well-U-Bodenplatte, wobei eine Vertiefung um jede Vertiefung herum frei bleibt, um eine Spillover-Kontamination während des stehenden Prozesses zu verhindern. Wenn alle Zellen übertragen wurden, zentrifugieren Sie die Platte und entsorgen Sie den Überstand.Lassen Sie den Teller kopfüber auf einem saugfähigen Papier liegen, klopfen Sie einmal auf den Teller und drehen Sie ihn sofort mit der richtigen Seite nach oben. Wirbel, um die Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit wieder zu suspendieren. Geben Sie dann 25 Mikroliter oberflächenstehende Vormischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln.Waschen Sie die Vertiefungen am Ende der Inkubation zweimal in 200 Mikrolitern PBS, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen nach jedem Waschen wieder, wie gerade gezeigt. Führen Sie dann eine Viabilitäts- und intrazelluläre Färbung für FOXP3 und andere interessante Marker durch. In diesen Diagrammen ist die Durchflusszytometrie-Gating-Strategie für CD25-positive CD4-positive FOXP3-positive regulatorische T-Zellen dargestellt.Bei der In-vitro-Stimulation regulieren die meisten Zellen CD25 hoch, dessen Expression in Gegenwart von Rapamycin reduziert wird. Erst unter Zugabe von induzierbaren Treg-Faktoren wird eine klare Population von FOXP3-positiven Zellen mit intrazellulären Proteinexpressionsniveaus deutlich, die so hoch sind wie die eines natürlich vorkommenden Tregs. Tatsächlich zeigt jede induzierte Treg-Bedingung ein spezifisches und reproduzierbares Muster der Zellproliferation.TGF beta induziert eine leichte Zunahme der Proliferation und all-trans-Retinsäure erhöht die T-Zellproliferation dramatisch, während die Zugabe von Rapamycin zu den Kulturen die Größe des Zellclusters stark reduziert. Die QRT-PCR-Analyse von induzierten Tregs zeigt, dass die FOXP3-mRNA-Expression in allen induzierten Treg-Kulturen höher ist als in kontrollstimulierten Zellen, wobei mit Rapamycin behandelte induzierte Tregs die geringsten Konzentrationen an FOXP3-mRNA der induzierten Treg-Kulturen aufweisen. Darüber hinaus wird beobachtet, dass die FOXP3-mRNA-Expression in natürlich vorkommenden Tregs höher ist als die einer der induzierbaren regulatorischen T-Zellpopulationen.Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der T-Zell-Immunologie den Weg, um die molekularen Mechanismen der Treg-Bildung und -Funktion bei gesunden Spendern oder bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder Krebs zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane naive CD4-positive T-Zellen isoliert und wie man die resultierenden NUs zu regulatorischen T-Zellen differenziert und phänotypisiert. Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut oder Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann.Daher sollten bei der Durchführung dieser Verfahren Vorsichtsmaßnahmen wie die Vorbehandlung, das Tragen aller Impfungen, das Tragen von Schutzkleidung und die ordnungsgemäße Abfallentsorgung berücksichtigt werden.

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In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll (Video) | JoVE Journal

In vitro Differenzierung von humanen CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 ⁺ T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

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