Name: Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Lernen Sie die ChIP-exo-Methode zur Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Basenpaar-Präzision. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in Genregulation und Epigenetik.

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Wir danken dem Venters Lab und Mitgliedern der Abteilung für Molekulare Physiologie und Biophysik für hilfreiche Diskussionen. Besonderer Dank geht an Frank Pugh für seine Anleitung, sein Mentoring und seine vielen aufschlussreichen Diskussionen über die Feinheiten von ChIP-exo, während ich als Postdoktorand in seinem Labor tätig war.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<html> Wir präsentieren eine funktionelle Genom Protokoll die genaue Bindungsstelle für Chromatin-interagierende Proteine ​​in einer unvoreingenommenen, genomweite Weise in der Nähe von Basenpaar-Auflösung zu bestimmen. Der wichtigste Schritt in der Nähe von Basenpaar Abbildungsauflösung zu erreichen, ist die Exonuclease-Behandlung des ChIP angereicherte DNA während der Immunopräzipitat auf dem magnetischen Harz bleibt. Vordergründig könnte Proteinkomplexe möglicherweise blockieren in vivo Fußabdrucks eines beli...

Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist eine leistungsfähige Methode Mechanismen der Genregulation zu untersuchen, indem selektiv für die DNA-Fragmente zu bereichern, die in lebenden Zellen mit einem bestimmten Protein in Wechselwirkung treten. Nachweisverfahren von ChIP angereicherte DNA - Fragmente haben sich weiterentwickelt , wie die Technologie verbessert, von der Erfassung eines einzelnen Locus (Standard ChIP-qPCR) zur Hybridisierung an Oligonukleotid - Mikroarrays (ChIP-Chip) auf Hochdurchsatz - Sequenzierung (ChIP-seq) 1. Obwohl ChIP-seq weit verbreitete Anwendung, Chromatin Heterogenität und unspezifischer DNA-Wechselwirkungen Datenqualität gesehen haben, was zu falsch-positive erschwert und ungenau Mapping. Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelte Dr. Frank Pugh dem Chip-exo - Methode 2. Das hervorstechendste Merkmal von ChIP-exo ist, dass es eine 5 &#39;zu 3&#39; Exonuklease enthält, effektiv Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen Footprinting. Im Ergebnis erreicht der Chip-exo-Methodik höhere Auflösung, größeren Dynamikbereich von detection und unteren Hintergrundgeräusche. Obwohl ChIP-exo technisch schwer zu meistern ist als ChIP-seq ist es weithin angenommen wird , wie Studien einzigartige , ultrahochauflösende Einblicke mit verschiedenen biologischen Systemen 3-8 gewinnen wollen. Tatsächlich ChIP-exo wurde auf Bakterien, Hefe, Maus, Ratte und menschlichen Zellsysteme erfolgreich eingesetzt. Als Beweis für das Prinzip wurde ChIP-exo ursprünglich verwendet , um die genaue Bindungsmotiv für eine Handvoll von Hefe - Transkriptions zu identifizieren 2 Faktoren ab . Die Technik wurde auch in Hefe verwendet , um die Organisation des Transkriptions Präinitiationskomplex zu studieren, und subnucleosomal Struktur verschiedener Histone 9,10 zu dechiffrieren. In jüngerer Zeit, Leveraged wir ChIP-exo benachbarten TFIIB und Pol II an menschlichen Promotoren Bindungsereignisse zu lösen, und zeigte , dass weit verbreitete divergente Transkription entsteht aus verschiedenen Initiations 11 - Komplexe. Der Workflow hier präsentiert wird optimiert und streamlined für Säugetier ChIP-exo (Abbildung 1). Erstens leben primäre oder Gewebekulturzellen mit Formaldehyd behandelt in vivo Protein-DNA - Wechselwirkungen durch eine kovalente Vernetzungs zu erhalten. Die Zellen werden lysiert und Chromatin abgeschert ~ 100-500 Basenpaar Größe Fragmente. ChIP dann reichert selektiv für DNA an das Protein von Interesse vernetzt Fragmente. An diesem Punkt ChIP-seq-Bibliotheken werden typischerweise hergestellt, die von Natur aus begrenzt die Detektionsauflösung auf die durchschnittliche Fragmentgröße von wenigen hundert Basenpaaren. Jedoch ChIP-exo überwindet diese Einschränkung durch die linken und rechten 5&#39;-DNA Grenzen der Protein-DNA-Vernetzungsstelle mit Lambda-Exonuklease Trimmen. Sequencing Bibliotheken werden dann aus Exonuklease verdaut DNA konstruiert, wie unten beschrieben. Die resultierenden verschachtelten 5 &#39;Grenzen stellen eine in vivo Footprint des Protein-DNA - Interaktion (Abbildung 1, Schritt 14) und werden durch Hochdurchsatz - Sequenzierung nachgewiesen. Although der Chip-exo-Methodik mehr beteiligt als ChIP-seq ist, Übergänge zwischen den meisten Schritten erfordert einfache Perle Waschen, die Probenverlust und experimentelle Variabilität minimiert. Wichtig ist, dass da ChIP-exo ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, jede Probe, die mit ChIP-seq sollte auch erfolgreich sein, mit ChIP-exo erfolgreich ist. Die in - vivo - Fußabdrucks von Protein-DNA - Wechselwirkungen mit ChIP-exo Ergebnisse in einer grundlegend unterschiedliche Datenstruktur von ChIP-seq. Obwohl häufig vorkommend ChIP-seq Anrufern ChIP-exo-Daten angewendet werden kann, die präzisesten Spitzen Anrufe zu erhalten, empfehlen wir die Bioinformatik Tools, die speziell mit der einzigartigen Struktur von ChIP-exo-Daten im Auge behalten. Dazu gehören Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla und ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyd, methanolfrei, 10 x 10 ml Ampullen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Abschnitt 3</td></tr><tr><td>Vollständiger Proteasehemmer-Cocktail (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Abschnitte 4, 8</td></tr><tr><td>Bioruptor-Ultraschallgerät</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Abschnitt 5</td></tr><tr><td>15 ml Polystyrolröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>Abschnitt 5</td></tr><tr><td>MagSepharose Protein G Xtra Kügelchen</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Abschnitt 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1,5 ml Seitliches magnetisches Gestell</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Abschnitte 6-17, 22</td></tr><tr><td>Mini-Röhrchen-Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Abschnitte 7, 22</td></tr><tr><td>T4 DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Abschnitt 9</td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>Abschnitt 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x Reaktionspuffer 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Abschnitte 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Abschnitte 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>Abschnitte 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Abschnitte 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Abschnitte 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Abschnitte 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo minus</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Abschnitte 10, 20</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Abschnitte 11, 21</td></tr><tr><td>&Phi;-29 DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Abschnitte 12, 19</td></tr><tr><td>10x &phi;-29 Puffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Abschnitte 12, 19</td></tr><tr><td>Lambda-Exonuklease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>Abschnitt 14</td></tr><tr><td>10x Lambda-Puffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Abschnitt 14</td></tr><tr><td>RecJf Exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Sektion 15</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Life Science</td><td>03115828001</td><td>Sektion 16</td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Roche Life Science</td><td>010901393001</td><td>Sektion 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligase Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>Sektion 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (clean up) Kügelchen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Abschnitt 22</td></tr><tr><td>Q5 Heißstart DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Abschnitt 23</td></tr><tr><td>5x Q5-Puffer (5x PCR-Puffer)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Abschnitt 23</td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Abschnitt 25</td></tr><tr><td>Qubit-Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Abschnitt 26</td></tr><tr><td>Optisch klare Qubit-Röhrchen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Abschnitt 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Abschnitt 26</td></tr></tbody></table>

der chip-exo-methode: ermittlung von protein-dna-wechselwirkungen mit near-basenpaar precision

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist ein unverzichtbares Werkzeug in den Bereichen Epigenetik und Genregulation, die spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen isoliert. ChIP gekoppelt Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird allgemein die genomische Lage von Proteinen zu bestimmen, die mit Chromatin in Wechselwirkung treten. Allerdings ChIP-seq wird durch eine relativ geringe Abbildungsauflösung von mehreren hundert Basenpaaren und hohen Hintergrundsignal behindert. Der Chip-exo-Methode ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, die auf sowohl Auflösung und Rauschen wesentlich verbessert. Der Hauptunterschied der ChIP-exo-Methodik ist die Einarbeitung von lambda-Exonuclease-Verdauung in der Bibliothek Vorbereitungsarbeitsablauf, um effektiv die linke Standfläche und rechts 5 &#39;DNA-Grenzen des Protein-DNA-Vernetzungsstelle. Der Chip-exo-Bibliotheken werden dann einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Die resultierenden Daten können genutzt werden, um eine einzigartige und extrem hochauflösende Einblicke in die funktionelle Organisation of das Genom. Hier beschreiben wir die ChIP-exo-Methode, die wir optimiert und rationalisiert für Säugetier-Systeme der nächsten Generation Sequenzierung-durch-Synthese-Plattform.

Die folgenden Abbildungen zeigen repräsentative Ergebnisse aus dem Chip-exo-Protokoll hier vorgestellt. Im Gegensatz zu herkömmlichen ChIP-seq Methodologien mit wenigen enzymatischen Schritten, ChIP-exo erfordert elf sequentiell abhängigen enzymatischen Reaktionen (Abbildung 1). Somit muss darauf geachtet werden bei jedem Schritt unternommen werden, um sicherzustellen, dass jede Reaktionskomponente seiner jeweiligen Reaktions Mastermix zugesetzt wird. Wir empfehlen, eine...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um eine Auflösung nahe der Basenpaarauflösung von Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erreichen. Dies wird durch eine Exonuklease-Behandlung von DNA-Fragmenten erreicht, die selektiv durch Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP-exo) angereichert sind, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung.

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Das übergeordnete Ziel dieser funktionellen genomischen Technologie ist es, die genauen genomischen Stellen zu identifizieren, die ein bestimmtes Protein in lebenden Zellen einnimmt. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Genregulation und Epigenetik zu beantworten, z. B. wie die Transkriptionsmaschinerie im Kontext des Chromatins zusammengebaut und funktioniert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die genaue genomische Position für Protein-DNA-Wechselwirkungen bei basischer Vorauflösung mit außergewöhnlich niedrigem Hintergrund aufdeckt.Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Protokoll komplex ist und durchgehend Liebe zum Detail erfordert. Um Kernlysate zu beschallen, beginnen Sie damit, Harzadapter in 15-Milliliter-Polystyrolröhrchen zu legen, die Kernextrakte enthalten. Beschallen Sie die Lysate in einem eiskalten Wasserbad bei mittlerer Leistung für 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus für insgesamt zwei 15-minütige Sitzungen.Um die Beschallungsergebnisse zu überprüfen, übertragen Sie zwei 10-Mikroliter-Proben aus jedem Röhrchen in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann kehren Sie die Vernetzung um, indem Sie die erste 10-Mikroliter-Probe mit 10 Mikrolitern TE-RNase A und 0,2 Mikrolitern Proteinase K kombinieren.Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann vier Mikroliter 6X Xylol-DNA-Farbstoff hinzu.Bewahren Sie die Vernetzung der zweiten 10-Mikroliter-Probe auf, indem Sie zwei Mikroliter 6X-Xylol-DNA-Farbstoff hinzufügen. Lassen Sie beide Proben etwa 30 bis 45 Minuten lang auf einem 1,5%igen Agarosegel bei 140 Volt laufen, bis der Bromphenolfarbstoff in letzterem drei Viertel des Weges durch das Gel erreicht hat. Wenn die Beschallung erfolgreich war, werden die beschallten Lysate in zwei Milliliterröhrchen mit 150 Mikrolitern 10 % Triton X-100 überführt und zum Mischen vortexiert.Pelletieren Sie das unlösliche Chromatin und die Ablagerungen, indem Sie die beschallten Lysate 10 Minuten lang bei 20.000 g bei vier Grad Celsius drehen. Übertragen Sie dann die Überstände in neue Zwei-Milliliter-Röhrchen. Lagern Sie die Proben unbegrenzt bei minus 80 Grad Celsius.Kombinieren Sie für jede Chromatin-Immunpräzipitation oder ChIP-Reaktion 1,5 Milliliter beschallte Extrakte mit Antikörper-Bead-Konjugaten in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhren über Nacht auf einem Mini-Röhrenrotator bei einer Geschwindigkeit von neun bei vier Grad Celsius. Überprüfen Sie nach einigen Minuten, ob die Proben nicht auslaufen und sich richtig mischen.Am nächsten Tag drehen Sie die Röhrchen ganz kurz herunter, um die Flüssigkeit in den Verschlüssen zu sammeln, und legen Sie die Röhrchen für eine Minute auf ein Magnetgestell. Aspirieren Sie dann den Extrakt. Geben Sie 0,75 Milliliter RIPA-Puffer in jedes Röhrchen.Nehmen Sie dann die Röhrchen aus dem Magnetgestell und drehen Sie sie zum Mischen mehrmals um. Setzen Sie nach einer kurzen Drehung die Röhren wieder auf den Magneten und saugen Sie den Überstand an. Geben Sie nach dem letzten Waschen 0,75 Milliliter 10 Millimolar Tris HCL in jedes Röhrchen.Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Magnetgestell und drehen Sie die Proben mehrmals um, um sie zu mischen. Nach einer kurzen Drehung legen Sie die Röhrchen wieder auf das Gestell und saugen den Überstand an. Nachdem Sie die Polier- und Detaillierungsreaktionen gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben, füllen Sie die Berechnungen des Ligationsmastermixes aus.Machen Sie dann die Ligaturmischung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis und pipettieren Sie, um die Lösung zu mischen. Geben Sie mit den Probenröhrchen auf dem Magnetgestell jeweils 48 Mikroliter P7-Ligations-Mastermix und zwei Mikroliter eines anderen Adapterindex zu jedem der Probenharze. Inkubieren Sie die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 25 Grad Celsius für zwei Stunden.Nachdem Sie die Proben gewaschen und die Phy 29-Nick-Reparatur und Kinase-Reaktionen gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben, füllen Sie die Berechnungen des Lambda-Exonuklease-Mastermixes aus und stellen Sie die Lambda-Exonuklease-Mischung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis her. Geben Sie 50 Mikroliter Lambda-Exonuklease-Mischung zu jedem Probenharz, während Sie sich noch auf dem Magnetgestell befinden. Anschließend werden die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubiert.Nach dem Aspirieren der letzten Wäsche, wie im Textprotokoll beschrieben, führen Sie die RecJf-Nukleasereaktion durch, indem Sie die RecJf-Mastermix-Berechnungen ausfüllen und die RecJf-Mischung auf Eis herstellen. Geben Sie 50 Mikroliter des RecJf-Mixes zu jedem Probenharz auf dem Magnetgestell. Anschließend werden die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubiert.Bereiten Sie nach dem Aspirieren der letzten Wäsche den ChIP-Elutionspuffer und den Proteinase-K-Mastermix vor und geben Sie 200 Mikroliter der Lösung zu jedem Probenharz. Inkubieren Sie die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 65 Grad Celsius über Nacht mit einem beheizten Deckel, um Kondensation zu vermeiden. Am nächsten Tag die Proben kurz drehen und die Röhrchen für eine Minute auf das Magnetgestell legen.Dann werden 200 Mikroliter Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern TE-Puffer überführt. Füllen Sie nach der DNA-Extraktion, der primären P7-Extension und den ATL-Reaktionen die Master-Mix-Berechnungen der P5-Adapter-Ligationstabelle aus und stellen Sie den Ligations-Master-Mix auf Eis her. Geben Sie 20 Mikroliter der Ligationsmischung zu jeder Probe und pipettieren Sie sie von Probe zu Mischung.Anschließend werden die Proben in einem Thermocycler zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius inkubiert. Führen Sie die DNA-Reinigung und -Quantifizierung gemäß dem Textprotokoll durch. Wie hier gezeigt, lohnt es sich, Zeit in die Optimierung der Beschallungsbedingungen zu investieren, um hochwertige Chromatinextrakte zu erhalten, die DNA-Fragmente zwischen 100 und 500 Basenpaaren liefern.Und der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassay wird verwendet, um zu überprüfen, ob die beschallten Extrakte intakte Protein-DNA-Vernetzungen enthalten, die sich in einer Superverschiebung von DNA-Fragmenten zeigen. Zur Beurteilung des Hintergrundsignals wird routinemäßig ein Mock-ChIP ohne Antikörper in der Reaktion durchgeführt. Eine hochwertige ChIP-Exo-Bibliothek liefert im Vergleich zu einer ChIP-seq-Bibliotheksvorbereitung nur sehr wenig Hintergrund in der Mock-Probe.Hier ist eine Bioanalyse-Bewertung einer ChIP-exo-Bibliothek zu sehen. Die Analyse stellt die Größenverteilung der Bibliothek genau sicher und erkennt kontaminierende Adapterdimere, die mit 125 Basenpaaren laufen. Dieses Panel veranschaulicht die glatte Verteilung von stranggetrennten ChIP-exo-Tag mit fünf Prime-Ns für Polymerase II, TFIIB und TBP am humanen RPS12-Gen in proliferierenden K562-Zellen.In dieser Abbildung sind durchschnittliche ChIP-exo-Muster relativ zu den transkriptionellen Startstellen proteinkodierender Gene dargestellt. Die wichtigsten Peakorte für TBP, TFIIB und Polymerase II in der zusammengesetzten Grafik spiegeln die genomische Organisation von humanen Transkriptionsinitiationskomplexen wider. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Genregulation, um molekulare Details der subnukleären Struktur in der Assymmetrie in Hefe zu erforschen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie RNase Seek Expression Profiling durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, z. B. ob ein bestimmter Faktor die Expression eines nahe gelegenen Gens beeinflusst. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die Master-Mix-Tabellen für alle enzymatischen Schritte sorgfältig auszufüllen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Karzinogenen und anderen ätzenden Stoffen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten. Nach diesem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine hochwertige ChIP-exo-Bibliothek vorbereiten.

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Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) ist eine Methode...

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

In diesem Video demonstrieren wir die Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Identifizierung von Proteinbindungsstellen an spezifischen Regionen der genomischen DNA von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch die selektive Immunpräzipitation von proteingebundenen Chromatinfragmenten. Diese Methode hilft, das Zusammenspiel mehrerer regulatorischer Proteine zu untersuchen, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die an der Genregulation beteiligt sind.

Chromatin-Immunpräzipitation zur Identifizierung von Zielprotein-Bindungsstellen auf genomischer DNA

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Dieses Video Artikel beschreibt ein in vitro-Mikroarray-basierte Methode, um die Gen-Targets und Bindungsstellen für Zweikomponentensystem Antwortregulatoren bestimmen.

DNA-Affinitäts-gereinigten Chip (DAP-Chip)-Methode, um Gene für bakterielle Ziele fest, Zwei-Komponenten-Systeme Regulatory

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Die Wechselwirkung eines ATP-abhängigen Chromatin-Remodelers mit einem DNA-Liganden wird mittels CD-Spektroskopie beschrieben. Die induzierten Konformationsänderungen an einem Genpromotor, die durch die erzeugten Peaks analysiert werden, können verwendet werden, um den Mechanismus der transkriptionellen Regulation zu verstehen.

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

CUT&amp;RUN und seine Varianten können verwendet werden, um die Proteinbelegung auf Chromatin zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Proteinlokalisation auf Chromatin mit Hilfe von einzelligem uliCUT&amp;RUN bestimmt werden kann.

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Lernen Sie die ChIP-exo-Methode zur Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Basenpaar-Präzision. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in Genregulation und Epigenetik.

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

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