Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Das übergeordnete Ziel dieser funktionellen genomischen Technologie ist es, die genauen genomischen Stellen zu identifizieren, die ein bestimmtes Protein in lebenden Zellen einnimmt. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Genregulation und Epigenetik zu beantworten, z. B. wie die Transkriptionsmaschinerie im Kontext des Chromatins zusammengebaut und funktioniert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die genaue genomische Position für Protein-DNA-Wechselwirkungen bei basischer Vorauflösung mit außergewöhnlich niedrigem Hintergrund aufdeckt.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Protokoll komplex ist und durchgehend Liebe zum Detail erfordert. Um Kernlysate zu beschallen, beginnen Sie damit, Harzadapter in 15-Milliliter-Polystyrolröhrchen zu legen, die Kernextrakte enthalten. Beschallen Sie die Lysate in einem eiskalten Wasserbad bei mittlerer Leistung für 30 Sekunden an und 30 Sekunden aus für insgesamt zwei 15-minütige Sitzungen.

Um die Beschallungsergebnisse zu überprüfen, übertragen Sie zwei 10-Mikroliter-Proben aus jedem Röhrchen in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Dann kehren Sie die Vernetzung um, indem Sie die erste 10-Mikroliter-Probe mit 10 Mikrolitern TE-RNase A und 0,2 Mikrolitern Proteinase K kombinieren.Inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann vier Mikroliter 6X Xylol-DNA-Farbstoff hinzu.

Bewahren Sie die Vernetzung der zweiten 10-Mikroliter-Probe auf, indem Sie zwei Mikroliter 6X-Xylol-DNA-Farbstoff hinzufügen. Lassen Sie beide Proben etwa 30 bis 45 Minuten lang auf einem 1,5%igen Agarosegel bei 140 Volt laufen, bis der Bromphenolfarbstoff in letzterem drei Viertel des Weges durch das Gel erreicht hat. Wenn die Beschallung erfolgreich war, werden die beschallten Lysate in zwei Milliliterröhrchen mit 150 Mikrolitern 10 % Triton X-100 überführt und zum Mischen vortexiert.

Pelletieren Sie das unlösliche Chromatin und die Ablagerungen, indem Sie die beschallten Lysate 10 Minuten lang bei 20.000 g bei vier Grad Celsius drehen. Übertragen Sie dann die Überstände in neue Zwei-Milliliter-Röhrchen. Lagern Sie die Proben unbegrenzt bei minus 80 Grad Celsius.

Kombinieren Sie für jede Chromatin-Immunpräzipitation oder ChIP-Reaktion 1,5 Milliliter beschallte Extrakte mit Antikörper-Bead-Konjugaten in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhren über Nacht auf einem Mini-Röhrenrotator bei einer Geschwindigkeit von neun bei vier Grad Celsius. Überprüfen Sie nach einigen Minuten, ob die Proben nicht auslaufen und sich richtig mischen.

Am nächsten Tag drehen Sie die Röhrchen ganz kurz herunter, um die Flüssigkeit in den Verschlüssen zu sammeln, und legen Sie die Röhrchen für eine Minute auf ein Magnetgestell. Aspirieren Sie dann den Extrakt. Geben Sie 0,75 Milliliter RIPA-Puffer in jedes Röhrchen.

Nehmen Sie dann die Röhrchen aus dem Magnetgestell und drehen Sie sie zum Mischen mehrmals um. Setzen Sie nach einer kurzen Drehung die Röhren wieder auf den Magneten und saugen Sie den Überstand an. Geben Sie nach dem letzten Waschen 0,75 Milliliter 10 Millimolar Tris HCL in jedes Röhrchen.

Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Magnetgestell und drehen Sie die Proben mehrmals um, um sie zu mischen. Nach einer kurzen Drehung legen Sie die Röhrchen wieder auf das Gestell und saugen den Überstand an. Nachdem Sie die Polier- und Detaillierungsreaktionen gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben, füllen Sie die Berechnungen des Ligationsmastermixes aus.

Machen Sie dann die Ligaturmischung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis und pipettieren Sie, um die Lösung zu mischen. Geben Sie mit den Probenröhrchen auf dem Magnetgestell jeweils 48 Mikroliter P7-Ligations-Mastermix und zwei Mikroliter eines anderen Adapterindex zu jedem der Probenharze. Inkubieren Sie die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 25 Grad Celsius für zwei Stunden.

Nachdem Sie die Proben gewaschen und die Phy 29-Nick-Reparatur und Kinase-Reaktionen gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben, füllen Sie die Berechnungen des Lambda-Exonuklease-Mastermixes aus und stellen Sie die Lambda-Exonuklease-Mischung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis her. Geben Sie 50 Mikroliter Lambda-Exonuklease-Mischung zu jedem Probenharz, während Sie sich noch auf dem Magnetgestell befinden. Anschließend werden die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubiert.

Nach dem Aspirieren der letzten Wäsche, wie im Textprotokoll beschrieben, führen Sie die RecJf-Nukleasereaktion durch, indem Sie die RecJf-Mastermix-Berechnungen ausfüllen und die RecJf-Mischung auf Eis herstellen. Geben Sie 50 Mikroliter des RecJf-Mixes zu jedem Probenharz auf dem Magnetgestell. Anschließend werden die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubiert.

Bereiten Sie nach dem Aspirieren der letzten Wäsche den ChIP-Elutionspuffer und den Proteinase-K-Mastermix vor und geben Sie 200 Mikroliter der Lösung zu jedem Probenharz. Inkubieren Sie die Proben in einem ThermoMixer bei dreimal g bei 65 Grad Celsius über Nacht mit einem beheizten Deckel, um Kondensation zu vermeiden. Am nächsten Tag die Proben kurz drehen und die Röhrchen für eine Minute auf das Magnetgestell legen.

Dann werden 200 Mikroliter Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern TE-Puffer überführt. Füllen Sie nach der DNA-Extraktion, der primären P7-Extension und den ATL-Reaktionen die Master-Mix-Berechnungen der P5-Adapter-Ligationstabelle aus und stellen Sie den Ligations-Master-Mix auf Eis her. Geben Sie 20 Mikroliter der Ligationsmischung zu jeder Probe und pipettieren Sie sie von Probe zu Mischung.

Anschließend werden die Proben in einem Thermocycler zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius inkubiert. Führen Sie die DNA-Reinigung und -Quantifizierung gemäß dem Textprotokoll durch. Wie hier gezeigt, lohnt es sich, Zeit in die Optimierung der Beschallungsbedingungen zu investieren, um hochwertige Chromatinextrakte zu erhalten, die DNA-Fragmente zwischen 100 und 500 Basenpaaren liefern.

Und der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassay wird verwendet, um zu überprüfen, ob die beschallten Extrakte intakte Protein-DNA-Vernetzungen enthalten, die sich in einer Superverschiebung von DNA-Fragmenten zeigen. Zur Beurteilung des Hintergrundsignals wird routinemäßig ein Mock-ChIP ohne Antikörper in der Reaktion durchgeführt. Eine hochwertige ChIP-Exo-Bibliothek liefert im Vergleich zu einer ChIP-seq-Bibliotheksvorbereitung nur sehr wenig Hintergrund in der Mock-Probe.

Hier ist eine Bioanalyse-Bewertung einer ChIP-exo-Bibliothek zu sehen. Die Analyse stellt die Größenverteilung der Bibliothek genau sicher und erkennt kontaminierende Adapterdimere, die mit 125 Basenpaaren laufen. Dieses Panel veranschaulicht die glatte Verteilung von stranggetrennten ChIP-exo-Tag mit fünf Prime-Ns für Polymerase II, TFIIB und TBP am humanen RPS12-Gen in proliferierenden K562-Zellen.

In dieser Abbildung sind durchschnittliche ChIP-exo-Muster relativ zu den transkriptionellen Startstellen proteinkodierender Gene dargestellt. Die wichtigsten Peakorte für TBP, TFIIB und Polymerase II in der zusammengesetzten Grafik spiegeln die genomische Organisation von humanen Transkriptionsinitiationskomplexen wider. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Genregulation, um molekulare Details der subnukleären Struktur in der Assymmetrie in Hefe zu erforschen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie RNase Seek Expression Profiling durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, z. B. ob ein bestimmter Faktor die Expression eines nahe gelegenen Gens beeinflusst. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die Master-Mix-Tabellen für alle enzymatischen Schritte sorgfältig auszufüllen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Karzinogenen und anderen ätzenden Stoffen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten. Nach diesem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine hochwertige ChIP-exo-Bibliothek vorbereiten.