Medikamentöse Behandlung und In Vivo Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Embryonen transgener Medaka-Knochenreporterlinien für Arzneimitteltests und für die Live-Bildgebung des Knochenzellverhaltens nach der Induktion von Osteoporose-ähnlichen Zuständen zu verwenden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Skelettforschung zu beantworten, wie z.B. wie verschiedene Arten von Knochenzellen in vivo miteinander interagieren? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die optische Klarheit der Medaka-Larven eine Live-Abbildung des Knochen-Zell-Verhaltens in einer intakten Probe ermöglicht.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung neuartiger Therapeutika für häufige Knochenerkrankungen, da sie die Visualisierung von Langzeitwirkungen der medikamentösen Behandlung bei C2 ermöglichen. Alle in diesem Video beschriebenen Verfahren wurden von der IACUC der National University of Singapore genehmigt. Um die Embryonen in den ersten Stunden des Lichtzyklus zu entnehmen, verwenden Sie zunächst ein feinmaschiges Netz, um weibliche Erwachsene einzufangen, die eine Eizelle tragen. Lassen Sie den Fisch kurz im Netz ruhen und massieren Sie dann sanft den Bauch des Fisches, um die befruchtete Eizelle vorsichtig vom Hinterleib des Weibchens zu entfernen.

Füllen Sie 20 bis 30 Eizellen in einzelne 60-Millimeter-Petrischalen aus Kunststoff und spülen Sie die Embryonen mit einer Plastikpipette in jeder Platte mit 5 bis 10 Millilitern dänischer Lösung ab. Rollen Sie die Eier vorsichtig zu einem Knoten aus Befestigungsfäden zusammen. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Befestigungsfäden aus den befruchteten Eizellen, um einzelne Embryonen zu erhalten.

Kultivieren Sie die Embryonen dann in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator mit täglichem Mediumwechsel, um eine normale Embryonalentwicklung zu gewährleisten. Für das transgene Embryonen-Screening wird die Larve zwei Tage nach der Befruchtung oder später 20 Minuten lang bei 39 Grad Celsius einem Hitzeschock unterzogen. Verwenden Sie dann ein Stereomikroskop, das mit einer Quecksilberlampe für die Fluoreszenzbildgebung ausgestattet ist, um die ubiquitäre CFP-Expression zu identifizieren.

Am Tag 5 nach der Befruchtung kann die Expression des mCherry-Reporters in Osteoblasten der früh bildenden Schädelknochen auf beiden Seiten des hinteren Kopfes und an einer zentralen Position im ventralen Schädel beobachtet werden. Ab dem 6. Tag nach der Befruchtung kann eine robuste nlGFP-Expression in Cathepsin-positiven Zellen des Kopfes und des Schwanzes sichtbar gemacht werden. Zur Induktion eines osteoporoseähnlichen Phänotyps werden die Embryonen 9 Tage nach der Befruchtung oder später einer 1,5- bis 2-stündigen Hitzeschockbehandlung unterzogen, um eine große Anzahl von ektopischen Osteoklasten in der Rumpfregion zu induzieren.

Für die Bisphosphonatbehandlung werden zunächst 6 Medaka-Larven pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte überführt. Verwenden Sie dann eine saubere Plastikpipette, um das Fischmedium vorsichtig zu entfernen. Geben Sie etwa 0,5 Milliliter Bisphosphonat in jede Vertiefung, um alle Spuren des Mediums zu verdünnen.

Ersetzen Sie dann die Waschlösung durch 4 Milliliter frische Bisphosphonatlösung und setzen Sie die Larven mit täglichem Mediumwechsel für 2 bis 6 Tage in den Inkubator zurück. Zu einem geeigneten Versuchszeitpunkt die frisch zubereitete Knochenfärbelösung durch ein 0,2-Mikron-Sieb für den einmaligen Gebrauch filtrieren. Und inkubieren Sie die Larven in einer Verdünnung von 1 und 10 des Flecks in frischem Fischmedium für die entsprechende Färbezeit in einem 28 Grad Celsius heißen Inkubator im Dunkeln.

Am Ende der Inkubation werden die Larven mit einer sauberen Plastikpipette in frisches Fischmedium überführt und das mit Flecken kontaminierte Medium durch ein anderes Aliquot des frischen Mediums ersetzt. Wenn kein sichtbarer Fleck mehr im Medium vorhanden ist, lassen Sie die Larven vor der Bildgebung 30 bis 60 Minuten lang im Fischmedium ruhen. Für die Live-Fluoreszenzbildgebung der Medaka-Larven verwenden Sie einen Kunststoff-Microloader, um die anästhesierten Larven entsprechend der interessierenden Region auszurichten.

Und legen Sie sie unter ein Stereomikroskop mit Fluoreszenzbeleuchtung. Wählen Sie die passende Vergrößerung aus und bilden Sie einzelne Abschnitte jeder Larve mit einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware ab, um die Bilder an den entsprechenden überlappenden Stellen zusammenzusetzen. Nachdem jede Larve abgebildet wurde, bringen Sie das Tier zur Erholung in seine Vertiefung in der 6-Well-Platte in frischem Fischmedium zurück.

Für die konfokale Live-Bildgebung geben Sie 0,5 bis 1 Milliliter 30 Grad Celsius 1,5 % flüssige, niedrigschmelzende Agarose in Fischmedium in eine Petrischale mit Glasboden. Bevor die Agarose erstarrt, übertragen Sie eine betäubte Larve auf die Agarose und schieben Sie die Larven mit einem Plastik-Mikrolader auf den Boden der Schale. Und verwenden Sie die Jochverlängerung, um die Larven entsprechend der interessierenden Region auszurichten.

Nachdem der Agar erstarrt ist, bilden Sie die Larven durch konfokale Mikroskopie ab. Verwenden Sie dann ein Paar feine Spritzennadeln, um die Larven von der Agarose zu befreien. Und überführen Sie jede Larve und die daran gebundene Agarose in eine neue Petrischale mit frischem Fischmedium zur Erholung.

In diesen Bildern wurden dreifach transgene Larven zum gleichzeitigen Nachweis von vorzeitigen Osteoblasten und differenzierten Osteoklasten verwendet. Übersichtsbilder wurden mit einem Stereomikroskop aufgenommen, während die konfokale Mikroskopie verwendet wurde, um Prozesse auf zellulärer Ebene sichtbar zu machen. Die ALC-gefärbte Knochenmatrix entlang der Neuralbögen und der Wache wurde als Referenz für die Bestimmung der Position der fluoreszenzmarkierten Knochenzellen verwendet.

Die RankL-Induktion führte zu einer ausgedehnten Bildung von ektopischen Osteoklasten um die Wirbelkörper. Diese übermäßigen Osteoklasten verursachen einen osteoporoseähnlichen Phänotyp, der sich in Form von Hohlräumen in den mineralisierten Centra und als fehlende Mineralisierung in den Neuralbögen zeigt. Nach der Inkubation in Alendronat bildeten sich normal Osteoklasten, aber die Wirbelsäulen sind intakt, ohne Läsionen und vollständig mineralisierte Bögen, was auf eine effiziente Hemmung der Osteoklastenaktivität hindeutet.

Des Weiteren zeigt die sukzessive Färbung der Knochenmatrix mit ALC gefolgt von Calcein eine de novo mineralisierte Knochenmatrix, mit einer gleichzeitigen Visualisierung der Osteoklasten und Osteoblasten in denselben intakten Larven. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in 3 Tagen von der Induktion der osteoporotischen Läsionen bis zur Bildgebung der Arzneimittelwirkung abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die lebenden Larven mit äußerster Sorgfalt zu behandeln und die Larven richtig zu häufen, so dass sich der interessierende Bereich in einer Brennebene befindet.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die nicht-invasive Sulfatprüfung einzelner Knochenvorläuferstellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Knochenzellursprung, Aktivierung und Anziehung zu den Läsionsstellen für die anschließende Knochenreparatur zu beantworten. Nach der Entwicklung dieser Technik ebnete sie den Weg für Wissenschaftler auf dem Gebiet der Knochenforschung, um die Auswirkungen verschiedener chemischer Verbindungen oder genetischer Mutationen auf das dynamische Verhalten von Zellen während der Knochenhomöostase zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie transgene Knochenlinien von Medaka für das Wirkstoffscreening und die Live-Bildgebung des Knochenzellverhaltens verwenden können.