Live-Imaging zur Untersuchung Mikrotubuli dynamische Instabilität in Taxan-resistenten Mammakarzinome
20. Februar 2017
In diesem Artikel berichten wir über ein Protokoll, das eine in vivo-Methode zur Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli in Docetaxel-resistenten Brustkrebszellen (MCF-7TXT) beschreibt. Bei dieser Methode wird ein Dekonvolutionsmikroskopie-Bildgebungssystem verwendet, um die Expression von GFP-Tubulin in Zielzellen nachzuweisen.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die dynamische Instabilität von Mikrotubuli in Docetaxel-resistenten Brustkrebszellen zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie über die dynamische Instabilität von Mikrotubuli unter physiologischen Bedingungen und nach verschiedenen medikamentösen Behandlungen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie ein einfaches, zuverlässiges und physiologisch anwendbares Protokoll für die Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik in lebenden Zellen bietet.
Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, züchten Sie die Brustkrebszellen in vollständigem Kulturmedium in 10-Zentimeter-Kulturschalen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis zum entsprechenden Grad der Konfluenz. Spülen Sie am Tag vor dem Experiment 24 Millimeter Poly-L-Lysin-beschichtete Glasabdeckfolien mit 70 % Alkohol ab und setzen Sie die Schlicker über Nacht UV-Licht aus. Legen Sie am nächsten Morgen einen Deckzettel in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen.
Waschen Sie dann die Kulturen mit PBS und lösen Sie die Zellen in jeder Schale mit 0,5 Millilitern Trypsin-EDTA ab. Wenn die Zellen begonnen haben, sich vom Plattenboden zu heben, neutralisieren Sie das Trypsin mit fünf Millilitern frischem Kulturmedium und zählen Sie die Zellen. Geben Sie dann etwa eins mal 10 fünfte Zellen auf jeden Deckglas, schütteln Sie die Platte vorsichtig und stellen Sie die Zellen für mindestens 36 Stunden wieder in den Inkubator.
Um die Mikrotubuli-Dynamik der Zellen zu testen, mischen Sie GFP-markierte Alpha-Tubulin-Stammlösung mehrmals durch Inversion, um eine homogene Lösung ohne Vortexing zu gewährleisten. Ersetzen Sie dann das Nährmedium in jeder Vertiefung durch zwei Milliliter frisches Medium, das 40 Mikroliter des markierten Tubulins enthält. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine vollständige Vermischung des Markers mit dem Nährmedium zu ermöglichen, und stellen Sie die Platte für weitere 24 Stunden in den Inkubator.
Ersetzen Sie am nächsten Tag den Nährboden durch frisches Medium, das Docetaxel enthält, und stellen Sie die Platte für 30 Minuten wieder in den Inkubator. Während die Zellen gehemmt werden, schalten Sie das inverse Fluoreszenzmikroskop ein und wärmen Sie den Probenhalter auf 37 Grad Celsius vor. Wählen Sie dann das 60X 1,42 NA Ölobjektiv aus und montieren Sie das erste Abdeckglas auf den Probenhalter.
Bedecken Sie die Probe mit einem Milliliter frischem, 37 Grad Celsius heißem Docetaxel-haltigem Medium und lokalisieren Sie einen Cluster flacher Zellen mit einer hohen GFP-markierten Alpha-Tubulin-Fluoreszenzintensität und deutlich sichtbaren Mikrotubuli-Strukturen. Fokussieren Sie sich auf den peripheren Bereich einer der Zellen im Cluster und stellen Sie die entsprechende Belichtungszeit in der Bildaufnahmefrequenz ein. Genau 50 Minuten nach der Zugabe des ersten Aliquots von Docetaxel beginnen Sie zwei Minuten lang mit der Aufzeichnung der Mikrotubuli-Dynamik und erhalten alle zwei Sekunden ein Foto.
Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, stellen Sie die nächste Zelle wie gerade gezeigt dar, bis Bilder für insgesamt fünf Zellen aus allen drei Vertiefungen jeder Docetaxel-Konzentration aufgenommen wurden. Wenn alle Bilder für jede Inhibitorkonzentration aufgenommen wurden, öffnen Sie das Dekonvolutionsprogramm im Mikroskopsystem und klicken Sie auf den Prozess. Wählen Sie als Nächstes Entflechtung und ziehen Sie die Bilddatei in das Eingabefenster.
Klicken Sie auf "Ausführen", um das Bild zu entfalten, und öffnen Sie die entfaltete Bilddatei in der Mikroskopsoftware. Klicken Sie auf Datei und als Film speichern. Legen Sie das Filmformat auf AV und den Animationsstil auf vorwärts fest.
Stellen Sie die Komprimierungsqualität auf 100 % und die Bildrate auf fünf pro Sekunde ein. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen "Durch Zeit animieren" und klicken Sie auf "Ausführen", um das Video zu generieren. In diesem repräsentativen Experiment wurden normale und Docetaxel-resistente Brustkrebszellen mit Docetaxel behandelt und wie gerade gezeigt dargestellt, aber die Auswirkungen der Behandlung auf das Wachstum und die Verkürzung der Mikrotubuli waren bei den nicht Docetaxel-resistenten Zellen am deutlichsten.
Tatsächlich zeigt die Messung der Wachstumsrate und der Verkürzung von Mikrotubuli unter 0,5 mikromolaren Docetaxel-Behandlungsbedingungen eine starke Hemmung der Tubulindynamik von elterlichen, aber nicht Docetaxel-resistenten Zellen. Einmal gemeistert, kann der gesamte Prozess innerhalb von 60 Stunden abgeschlossen werden, wenn die Techniken richtig ausgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, flache Zellen mit einer hohen GFP-Tubulin-Fluoreszenzintensität auszuwählen und sowohl die Intensität der Anregungsfluoreszenz als auch die Expositionsdauer zu reduzieren, um ein Verblassen der GFP-Fluoreszenz zu vermeiden.
Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik Forschern in der Zell- und Krebsbiologie den Weg geebnet, um die Auswirkungen verschiedener Mikrotubuli-Targeting-Wirkstoffe auf normale und krebsartige Zellen zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die dynamische Instabilität von Mikrotubuli in lebenden Zellen unter einer Vielzahl von Bedingungen gemessen werden kann.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli in docetaxelresistenten Brustkrebszellen mittels Entfaltungsmikroskopie vor. Die Methode konzentriert sich auf die Expression von GFP-Tubulin in lebenden Zellen und liefert Einblicke in das Verhalten der Mikrotubuli unter Wirkstoffbehandlung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Krebsforschung
- Mikroskopietechniken
Hintergrund
- Mikrotubuli spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellstruktur und -funktion.
- Die Resistenz gegen Docetaxel stellt eine erhebliche Herausforderung in der Brustkrebstherapie dar.
- Das Verständnis der Mikrotubulindynamik kann therapeutische Strategien beeinflussen.
- GFP-Tubulin ermöglicht die Echtzeitvisualisierung des Mikrotubulinverhaltens.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung der Mikrotubulusdynamik in lebenden Zellen.
- Untersuchung der Wirkung von Arzneimittelbehandlungen auf die Instabilität von Mikrotubuli.
- Verbesserung des Verständnisses der Biologie von Krebszellen.
Verwendete Methoden
- In-vivo-Bildgebung von Mikrotubuli mittels Entfaltungsmikroskopie.
- Kultur von Docetaxel-resistenten Brustkrebszellen (MCF-7 TXT).
- Expression von GFP-Tubulin zur Visualisierung.
- Herstellung von mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläsern für die Zelladhäsion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Mikrotubulusdynamik in lebenden Zellen.
- Nachweis der Mikrotubulusinstabilität als Reaktion auf eine Wirkstoffbehandlung.
- Entwicklung eines Protokolls, das auf verschiedene Zelltypen angewendet werden kann.
- Erkenntnisse über die Mechanismen der Arzneimittelresistenz in Krebszellen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Mikrotubulusdynamik dar.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis des Verhaltens von Krebszellen unter Behandlung bei.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf dieser Methode aufbauen, um andere therapeutische Strategien zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli in lebenden Krebszellen bietet einen physiologisch relevanten Test zur Bewertung von Resistenzmechanismen gegenüber Mikrotubuli-gerichteten Wirkstoffen (MTA). Dieser Ansatz ermöglicht die Zielvalidierung, indem er das Verhalten der Mikrotubuli mit der Wirkstoffantwort verknüpft und somit die Vorhersagegenauigkeit bei der präklinischen MTA-Screening unterstützt. Die Methode trägt dazu bei, taxanbasierte Therapien sicherer zu gestalten, indem sie Resistenzphänotypen frühzeitig im Entdeckungsprozess identifiziert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem Wachstums- und Verkürzungsrate von Mikrotubuli unter Docetaxel-Belastung quantifiziert werden.
- Operationaler Wert: Nutzt die Expression von GFP-markiertem Tubulin in lebenden Zellen, um eine Echtzeit-Bildgebung unter physiologisch relevanten Bedingungen ohne Fixierungsartefakte zu ermöglichen.
- Prädiktiver Wert: Unterscheidet docetaxel-empfindliche von resistenten Phänotypen anhand der Hemmung der Mikrotubuli-Dynamik und unterstützt damit die Beurteilung der Zielstrukturnachvollziehbarkeit.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Etabliert einen standardisierten Protokollablauf zur Messung der Mikrotubulusdynamik in adhärenten Brustkrebszellen mittels Entfaltungsmikroskopie.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt Zeitrafferaufnahmen, die die Bestimmung von Wachstums- und Verkürzungsrate der Mikrotubuli als funktionelle Endpunkte ermöglichen.
- Anwendung in der Screening-Technik: Ermöglicht die Bewertung der Auswirkungen von MTAs auf die Mikrotubulusinstabilität in lebenden Zellen und erleichtert dadurch die Untersuchung von Substanzen oder Genotypen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert die Taxan-Resistenz in von MCF-7 abgeleiteten Brustkrebszellen und spiegelt klinisch beobachtete Resistenzmechanismen wider.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Veränderungen der Mikrotubulusdynamik mit der durch Docetaxel induzierten mitotischen Arrestierung und Apoptose-Resistenz.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Ermöglicht die frühzeitige Identifizierung von Resistenzphänotypen und unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in Programmen zur Entwicklung von MTAs.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Evaluation ein, insbesondere für Wirkstoffe, die auf Mikrotubuli abzielen und deren Resistenzmechanismus mit veränderten Mikrotubuli-Dynamiken verknüpft ist.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zum Mikrotubulin-Verhalten als Determinante der Arzneimittelwirkung in lebenden Zellen.
- Screening: Stellt ein einsatzbereites Assay-System zur Quantifizierung von Veränderungen der Mikrotubulin-Instabilität nach Applikation von Verbindungen oder genetischen Störungen bereit.
- Analytik: Ermöglicht die Messung von Mikrotubulin-Wachstums- und -Verkürzungsraten als quantitative, zeitlich aufgelöste Parameter zum Vergleich verschiedener Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Messungen der dynamischen Instabilität mit funktionellen Endpunkten wie Mitosearrest und Apoptose in resistenten im Vergleich zu empfindlichen Zellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die auf verschiedene Klassen von Mikrotubulin-Agents und Zellmodelle über hinausgehend für Docetaxel-resistenten Brustkrebs anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem Mikrotubulusdynamik mit dem Arzneimittelphänotyp in einem physiologischen Kontext verknüpft wird.
- Operativer Wert: Stellt ein zuverlässiges, standardisiertes Protokoll für die Live-Cell-Bildgebung bereit, das nur minimale, über die Fluoreszenzmikroskopie hinausgehende spezialisierte Ausrüstung erfordert.
- Strategischer Wert: Verringert die mechanistische Uneindeutigkeit bei der MTA-Resistenz und ermöglicht eine frühere Risikominderung sowie eine verbesserte Kapitalnutzungseffizienz in Onkologieprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von MTA-Kandidaten, indem Resistenzmechanismen vor In-vivo-Studien identifiziert werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Live-Cell-Bildgebung, Fluoreszenzmikroskopie und Mikrotubuli-Biologie.
- Hängt vom Zugang zu einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit Öl-Objektiv, einer Umweltkammer und Entfaltungssoftware ab.
- Erfordert die Standardisierung der Zellaussaat, der GFP-Tubulin-Expression und des Zeitpunkts der Wirkstoffbehandlung über verschiedene Experimente hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Zelltypen, Mikrotubuli-Marker oder Bildgebungsmodalitäten.
- Ist durch das Risiko der Photobleiche begrenzt, was eine sorgfältige Kontrolle der Anregungsintensität und Belichtungsdauer erfordert, wie im Protokoll beschrieben.
