Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten
8. Januar 2017
Obwohl proliferative polyploide Zellen notwendig sind, um die chromosomale Instabilität polyploider Zellen zu analysieren, ist es nicht einfach, solche Zellen aus nicht transformierten menschlichen Zellen zu erzeugen. Der vorliegende Bericht beschreibt relativ einfache Verfahren zur Etablierung proliferativer tetraploider Zellen, die frei von einer diploiden Population aus normalen humanen Fibroblasten sind.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, proliferative tetraploide Zellen aus normalen menschlichen Fibroblasten zu etablieren, die frei von einer diploiden Population sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Karzinogeneseforschung zu beantworten, etwa wie sich aneuploide Zellen in den frühen Stadien der Karzinogenese entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass proliferative tetraploide Zellen, die frei von einer diploiden Population sind, mit relativ einfachen Verfahren etabliert werden können.
Während einige Stämme durch eine einfache Behandlung mit dem Spindelgift Demecolcin vollständig tetraploid werden, müssen die meisten während dieser Behandlung mit der Shake-off-Methode behandelt werden, um eine diploide Population zu emulieren. Um die Induktion der Tetraploidie ohne die Shake-off-Methode zu beginnen, geben Sie etwa fünfmal 10 zu den 1/5 kultivierten Zellen in eine 100-Millimeter-Schale. Inkubieren Sie das Gericht 24 Stunden lang in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.
Behandeln Sie danach die exponentiell wachsenden Zellen mit einem Medium, das 0,1 Mikrogramm pro Milliliter DC enthält. Inkubieren Sie vier Tage lang in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie dann das DC-haltige Medium durch ein arzneimittelfreies Medium. Inkubieren Sie in 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, bis die Vermehrung wieder einsetzt.
Um Tetraploidie unter Verwendung der Shake-off-Methode zu induzieren, werden die kultivierten Zellen in T-75-Kolben geleitet, wobei darauf geachtet wird, dass jeder Kolben mindestens einmal 10 zu den 1/6-Zellen enthält. Inkubieren Sie die Kolben 24 Stunden lang in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag 16 bis 18 Stunden lang mit einem Medium, das DC enthält, um sie in der Mitose zu stoppen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Nach der Inkubation werden die Zellen in einem Kolben unter dem inversen Phasenkontrastmikroskop kontrolliert. Und dann schütteln Sie jeden Kolben vorsichtig, um mit der Sammlung locker anhaftender mitotischer Zellen zu beginnen. Unachtsame Handhabungen, wie z.B. heftiges Schütteln oder Berühren der Oberfläche des Kolbens mit der Pipettenspitze, sollten vermieden werden.
Kontaminieren Sie die mitotischen Zellen nicht mit anhaftenden Grenzflächenzellen. Waschen Sie die Kolben vorsichtig mit warmem Medium und geben Sie die Zellen in Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen atomaren Zellzähler, um die Zellzahl zu zählen.
Nach der Zellzählung fünf Minuten lang bei 300 mal g zentrifugieren. Säen Sie die gesammelten mitotischen Zellen wieder in 16-Millimeter-Kulturschalen aus. Behandeln Sie dann die plattierten Zellen mit einem Medium, das 0,1 Mikrogramm pro Milliliter DC enthält.Inkubieren Sie drei Tage lang in 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.
Ersetzen Sie danach das DC-haltige Medium durch ein arzneimittelfreies Medium. Inkubieren Sie in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre bei 37 Grad Celsius, bis die Vermehrung wieder einsetzt. Zur Analyse der DNA-Ploidie waschen Sie die Zellen mit PBS.
Geben Sie dann eine Lösung mit 0,05 % Trypsin und 0,02 % EDTA zu den Zellen. 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie danach die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
Und neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie Medium hinzufügen, das 10% fötales Rinderserum enthält. Die Zellen werden fünf Minuten lang in Medium bei 300-mal g zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern PBS.
Dann erneut bei 300 mal g für fünf Minuten zentrifugieren. Als nächstes resuspendieren Sie Zellen in einem Milliliter PBS. Fügen Sie beim Mischen tropfenweise vier Milliliter 100%iges Ethanol hinzu.
Lassen Sie die Suspension 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen, um die Zellen zu fixieren. Danach zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang in einer Fixierlösung bei 300-mal g. Und resuspendieren Sie Zellen in fünf Millilitern PBS.
Die Suspension wird fünf Minuten lang bei 300 mal g zentrifugiert. Behandeln Sie dann die Zellen mit 475 Mikrolitern 0,5 Milligramm pro Milliliter RNA-Lösung. Fügen Sie 25 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Propidiumjodlösung hinzu, um die Zellen zu färben.
Und dann mischen. Lassen Sie die Suspension 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Verwenden Sie anschließend ein Durchflusszytometer mit einem 488-Nanometer-Laser und einem Rotkanal-Emissionsfilter, um den DNA-Gehalt der Zellen zu analysieren.
Analysieren Sie auch eine Referenzprobe, die aus echten diploiden Zellen hergestellt wurde, um die Ploidie der Zielzellen zu beurteilen. Behandeln Sie zu Beginn exponentiell wachsende Zellen vier Stunden lang mit einem Medium mit 0,1 Mikrogramm pro Milliliter DC, um die Zellen in der Metaphase zu stoppen. Danach ernten Sie mindestens fünfmal 10 bis zu 1/5 Zellen durch Trypsinisierung.
Suspendieren Sie die geernteten Zellen in einem Medium, das FBS enthält. Die Suspension wird fünf Minuten lang bei 300 mal g zentrifugiert. Fügen Sie dann fünf Milliliter einer 0,075 molaren Kaliumchloridlösung hinzu.
Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach Beendigung der Inkubation zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 300-mal g. Resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern des Carnoy-Fixiermittels.
Und dann zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 300 mal g. Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern des Carnoy-Fixiermittels. Lassen Sie 30 Mikroliter der Zellsuspension auf einen Objektträger fallen.
Färben und analysieren Sie schließlich die Zellen entweder durch Chromosomenzählung oder Karyotypanalyse. In dieser Studie werden proliferative tetraploide Zellen, die frei von einer diploiden Population sind, aus normalen humanen Fibroblasten kultiviert. Obwohl einige Zellstämme durch kontinuierliche Behandlung mit DC vollständig tetraploid werden können, müssen die meisten Zellen im Verlauf der DC-Behandlung mit der Shake-off-Methode behandelt werden, um eine diploide Population zu eliminieren.
Die repräsentativen Ergebnisse für die Induktion von Tetraploidie in drei Fibroblastenstämmen sind hier dargestellt. Der Stamm TIG-1 wird durch einfache kontinuierliche Behandlung mit DC fast vollständig tetraploid, führt jedoch dazu, dass die BJ- und TIG-hT-Stämme zu einer Mischung aus diploiden und tetrapodischen Populationen werden. Daher ist die Isolierung der mitotischen Zellen durch die Shake-off-Methode während des Behandlungsprozesses erforderlich.
In den etablierten tetraploiden Zellen wird eine Chromosomenzählung durchgeführt. Wie zu sehen ist, beträgt die modale Chromosomenzahl sowohl für TIG-1- als auch für BJ-Zellen 92 und für TIG-hT-Zellen 91. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Kolben im Shake-off-Schritt vorsichtig zu schütteln, um keine Kontamination der mitotischen Zellen durch adhärente Grenzflächenzellen zu verursachen.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Herstellung proliferierender tetraploider Zellen aus normalen menschlichen Fibroblasten vorgestellt, die für die Untersuchung der chromosomalen Instabilität unerlässlich sind. Das Verfahren ermöglicht es den Forschern, diese Zellen ohne eine diploide Population zu erzeugen, und erleichtert so Untersuchungen zur frühen Karzinogenese.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Forschung zur Karzinogenese
- chromosomale Stabilität
Hintergrund
- Proliferierende polyploide Zellen sind entscheidend für die Analyse der chromosomalen Instabilität.
- Die Erzeugung solcher Zellen aus nicht transformierten menschlichen Zellen birgt Herausforderungen.
- Das Verständnis von Aneuploidie ist im Kontext der Krebsentstehung von großer Bedeutung.
- Diese Studie zielt darauf ab, das Verfahren zur Erzeugung tetraploider Zellen zu vereinfachen.
Zweck der Studie
- Herstellung proliferierender tetraploider Zellen ohne diploide Populationen.
- Unterstützung der Forschung zur Entstehung aneuploider Zellen bei der Karzinogenese.
- Bereitstellung einer einfachen Methode zur Generierung dieser Zellen.
Verwendete Methoden
- Passagieren kultivierter Zellen in eine 100-Millimeter-Schale.
- Inkubation der Zellen 24 Stunden lang in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C.
- Verwendung des Spindelgifts Demecolcin zur Induktion von Tetraploidie.
- Anwendung der Schüttelmethode bei bestimmten Stämmen, um diploide Populationen zu eliminieren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Etablierung proliferierender tetraploider Zellen.
- Nachweis der Wirksamkeit der beschriebenen einfachen Verfahren.
- Erkenntnisse über die Mechanismen der Aneuploidieentwicklung.
- Mögliche Anwendungen in der Krebsforschung und chromosomalen Untersuchungen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet eine zuverlässige Möglichkeit, tetraploide Zellen zu erzeugen.
- Diese Forschung vertieft das Verständnis der chromosomalen Instabilität.
- Zukünftige Studien können diese Zellen nutzen, um die Karzinogenese weiter zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die Herstellung proliferierender tetraploider Zellen aus nicht transformierten humanen Fibroblasten adressiert ein zentrales Bedürfnis nach robusten Modellen für chromosomale Instabilität in der frühen Karzinogenese. Diese Fähigkeit ermöglicht die mechanistische Absicherung und Zielvalidierung von Signalwegen, die an der durch Aneuploidie getriebenen Krankheitsprogression beteiligt sind. Die Einfachheit und Reproduzierbarkeit der Methode unterstützen translationsorientierte Forschung über das gesamte Portfolio hinweg sowie eine prädiktive Zuverlässigkeit bei der Auswahl präklinischer Modelle.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen der chromosomalen Instabilität, die für die onkogene Transformation relevant sind.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an Polyploidie und Aneuploidie beteiligt sind.
- Erleichtert die biologische Entschärfung von Risiken, indem tetraploide Populationen ohne diploide Kontamination isoliert werden.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die Analyse nachgeschalteter Signalwege und die Priorisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes System zur quantitativen Beurteilung des chromosomalen Gehalts mittels Durchflusszytometrie und Karyotypisierung.
- Standardisiert die Erzeugung tetraploider Zellpopulationen für die reproduzierbare Entwicklung von Assays.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Substanzen oder Interventionen, die auf polyploidieassoziierte Signalwege abzielen.
- Unterstützt Skalierbarkeit und die Wiederverwendung der Plattform über mehrere Fibroblastenstämme hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Untersuchung früher Ereignisse der Karzinogenese an krankheitsrelevanten Modellen.
- Stellt eine lückenlose Übertragung von mechanistischen Studien im Entdeckungsstadium bis hin zur präklinischen Validierung von Biomarkern für chromosomale Instabilität sicher.
- Verringert das Risiko beim Voranbringen von Kandidaten, die auf polyploidiegetriebene onkogene Prozesse abzielen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem sie die Erzeugung und Validierung von tetraploiden Zellmodellen für mechanistische und translationale Forschung ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu den Ursprüngen und Folgen der Tetraploidie in menschlichen Zellen.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative DNA-Gehaltsbestimmungen zur Standardisierung von Assays.
- Analytik: Stellt Durchflusszytometrie- und Karyotypauswertungen für eine robuste Vergleichbarkeit von Zellpopulationen bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe mechanistische Erkenntnisse mit der präklinischen Abstimmung von Biomarkern in Studien zur chromosomalen Instabilität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein breit anwendbares Protokoll zur Erzeugung polyploider Modelle über verschiedene Forschungs- und Entwicklungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Forschung zur chromosomalen Instabilität.
- Operationaler Wert: Vereinfacht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Erzeugung tetraploider Zellen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Weiterentwicklung von Onkologieprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Targets und Modellen in frühen Entdeckungsprozessen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Durchflusszytometrie und Karyotyp-Analyse.
- Benötigt Zugang zu Demecolcin, Zellzählern und Zytometrie-Ausrüstung.
- Erfordert eine sorgfältige Standardisierung der Shake-off- und Zellhandhabungsschritte, um Kontaminationen zu vermeiden.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Fibroblastenstämme oder Zelltypen notwendig.
- Zu den potenziellen Einschränkungen gehören stammspezifische Reaktionen auf Demecolcin sowie technische Variabilität bei der Isolierung mitotischer Zellen.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Induction and Establishment of Tetraploid Cells from Diploid Fibroblasts without the Shake-off Method
1:52
Induction and Establishment of Tetraploid Cells from Diploid Fibroblasts with the Shake-off Method
4:01
Examination of DNA Ploidy
6:30
Preparation for Chromosome Counts and Karyotype Analysis
8:04
Results: Establishment of Proliferative Tetraploid Cells
9:28
Conclusion
