Name: MicroRNA-basierten Regulation der Picornavirus Tropism (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie die mikroRNA-basierte Regulation des Picornavirus-Tropismus durch Einbau komplementärer Sequenzen in das virale Genom. Diese Methode ermöglicht spezifische Kontrolle der viralen Replikation und erhöht die Sicherheit in der Virologieforschung.

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Al und Mary Agnes McQuinn, die Richard M. Schulze Foundation und ein NIH Relief Grant von der Mayo Clinic finanzierte repräsentative Arbeit, die hier beschrieben wird.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Design, die Zusammensetzung und die Lokalisierung der microRNA-Response-Elemente innerhalb des viralen Genoms wird diktieren, Wirksamkeit und Spezifität Targeting. Die Optimierung dieser wird Versuch und Irrtum erforderlich. Jedoch rationales Design basierend auf RNA Strukturanalyse und frühere Studien der viralen Replikation und mikroRNA Signaturen hilft bei der Durchführung dieser Technik mit minimalem Optimierungs 10, 11, <sup...

Die Entwicklung einer breit anwendbaren, einfache und effektive Methode, um einen Vektor mit eingeschränkten Tropismus Engineering bietet eine große Chance, um die Sicherheit, biologische Verständnis und therapeutischen Nutzen von Viren zu verbessern. Mehrere Mechanismen existieren viralen Tropismus einschließlich transductional, transkriptionale und translationale Gestützte Techniken zielen. Jedoch sind diese Verfahren nicht allgemein anwendbar auf alle Vektorsysteme, können defekte Signalwege in Zielzellen erfordern oder Insertion von großen codierenden Sequenzen in das Virusgenom erfordern. Zusätzlich können diese Verfahren in der Dämpfung des Virus führen, erheblich ihre therapeutische Aktivität zu behindern und einen Einblick in das unmodifizierte System zu begrenzen. MicroRNAs sind kleine (22-25 Nukleotide), nicht-kodierenden RNAs, die Gen-Silencing in eukaryotischen Zellen vermitteln. MicroRNAs Funktion durch komplementäre Zielsequenzen Bindung (Response-Elemente) in Boten-RNAs (mRNA) resulti<html> ng in Transkript Destabilisierung, Abbau oder translationale Repression. MicroRNAs normalerweise Response - Elemente mit partieller Komplementarität binden und kleine Veränderungen in der Genexpression 1, 2, 3, 4, 5 ergeben. Weitere signifikante Veränderungen in der Genexpression kann durch Erhöhen 6 Komplementarität des Antwortelements erreicht werden. Tausende von reifen microRNAs wurden in einer Vielzahl von Arten und viele weisen differentielle Expressionsmuster in einer Vielzahl von Zell- und Gewebetypen 7, 8, 9 identifiziert. Diese MikroRNA Signaturen können durch Einbeziehen perfekt komplementären Response - Elemente in das virale Genom 10 zur zellspezifischen Restriktions Virusamplifikation ausgenutzt werden ,= &quot;Xref&quot;&gt; 11, 12, 13. Das übergeordnete Ziel dieser microRNA-Targeting-Technik ist es, die Tropismus eines Vektorgenoms ohne zusätzliche Dämpfung zu steuern. Die Nützlichkeit dieses Verfahrens für die virale Tropismus regulierende wurde ursprünglich in lentiviralen Vektoren gezeigt Transgen - Expression in spezifischen Geweben 14, 15, 16 zu beschränken. Diese Technik hat in der Folge zu einer Vielzahl von replizierende und nicht-replizierende virale Vektoren für eine verbesserte Gentherapie als auch angewendet worden , wie die Sicherheitsprofile vieler onkolytischen Viren zu verbessern , indem eine unerwünschte Toxizitäten in normalen Geweben eliminiert 10, 11, 12, 13, 17 . Es ist auch sicher und e zu erzeugen, verwendet worden, umffective lebendes abgeschwächtes Impfstoffe sowie Virus und Impfstoffherstellung zu verbessern , Prozesse 18, 19, 20, 21. MicroRNA-Targeting eines Vektors kann für die Dämpfung in geimpften Hosts oder gezielt Systeme ermöglichen, während Wildtyp-Wachstumsraten in den Erzeugersystemen aufrechterhalten wird. MicroRNA-Targeting kann auch durch die Beschränkung Übertragung in einer Spezies (zB Menschen) , um die biologische Sicherheit von Viren zu Forschungszwecken zu verbessern verwendet werden , während 22 Übertragung in anderen Hosts zu halten. MicroRNA-Targeting Schließlich kann für viralen Lebensanalysen von Zyklen in-Tiefe ermöglichen und spezifische Rollen von Zelltypen in der Pathogenese und Immunität durch das virale Wachstum Aussortieren 23, 24, 25, 26. Diese Technik bietet ein alternative Verfahren Targeting, die leicht umgesetzt und gilt für alle Virus-Systemen. Darüber hinaus macht die ständig wachsende Sammlung von reifen microRNAs mit differentiellen Expressionsmuster in bestimmten Zelltypen diese Technik vielseitig einsetzbar. MicroRNA-basierten Targeting hat sich für eine Vielzahl von Virus-Systemen ohne Kompromisse bei der Systemfunktion wirksam erwiesen. Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik gehören Versuch und Irrtum-Optimierung, das Potenzial für Mutationen und mögliche Nebeneffekte auf endogenen Transkripte. Allerdings können diese Einschränkungen im Allgemeinen mit optimiertem und rational-Response-Element Design überwunden werden. Positive Sense-RNA-Viren sind in der Regel besonders als Reaktion auf microRNA-Targeting zu sein aufgrund der positiven Sense-Orientierung ihres Genoms und die Verfügbarkeit der Transkripte auf die microRNA Maschinen während des vollständig zytoplasmatischen Replikationszyklus. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung eines microRNA-bezogene picornavirus und die Experimental Methoden , um die Effizienz und Spezifität , dass Targeting in vitro zu überprüfen.

<table><tbody><tr><td>RE-kodierende Oligonukleotide</td><td>IDT</td><td>PAGE-gereinigte Ultramer-Sequenz</td><td>Entwickelt von Investigator</td></tr><tr><td>Oligonukleotide, die für die einzigartige Restriktionsstelle</td><td>IDT</td><td>25nM-Sequenz</td><td>kodieren Entwickelt von Investigator</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>Viele andere High Fidelity Polymerase PCR-Kits verfügbar</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase System</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>RNase-frei</td></tr><tr><td>5 M NH4 Acetat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Kommt im MEGAclear Kit</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020 Transfektionsreagenz</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA Transfektionsreagenz</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; m Spritzenfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Schraubverschluss-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA imitiert</td><td>Dharmacon</td><td>Variiert</td><td></td></tr><tr><td>MTT Zellproliferationsassay</td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Subklonierungseffizienz DH5&alpha; Kompetente Zellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Vektoren</td><td>Agilent Technologies</td><td>Variabel (z. B. 212205)</td><td>Es gibt verschiedene Plasmide mit T7- oder T3-Promotoren und variable Klonierungsstellen, um die Klonierung und RNA-Transkription zu ermöglichen.</td></tr></tbody></table>

microrna-basierten regulation der picornavirus tropism

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Zellspezifische Einschränkung der Virusreplikation ohne gleichzeitige Abschwächung kann der Impfstoffentwicklung, der Gentherapie, der onkolytischen Virotherapie und dem Verständnis der biologischen Eigenschaften von Viren zugute kommen. Es gibt mehrere Mechanismen zur Regulierung des viralen Tropismus, sie sind jedoch tendenziell virusklassenspezifisch und viele führen zu einer Virusabschwächung. Darüber hinaus weisen viele Viren, einschließlich Picornaviren, Größenbeschränkungen auf, die es nicht erlauben, große Mengen an fremdem genetischem Material einzubauen, die für einige Targeting-Methoden erforderlich sind. MicroRNAs sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression in eukaryotischen Zellen regulieren, indem sie komplementäre Zielsequenzen in Boten-RNAs binden, deren Translation verhindern oder ihren Abbau beschleunigen. Verschiedene Zellen weisen unterschiedliche microRNA-Signaturen auf und viele microRNAs dienen als Biomarker. Diese differentiellen Expressionsmuster können genutzt werden, um die Genexpression in Zellen einzuschränken, die spezifische microRNAs exprimieren, während die Expression in Zellen, die dies nicht tun, aufrechterhalten wird. In Bezug auf die Regulierung des viralen Tropismus werden Sequenzen, die zu spezifischen microRNAs komplementär sind, in das virale Genom eingebaut, im Allgemeinen in den 3' nicht-kodierenden Regionen, und zielen auf sie ab, um sie in Gegenwart der verwandten microRNAs zu zerstören und so die virale Genexpression und/oder Replikation zu verhindern. MicroRNA-Targeting ist eine Technik, die theoretisch auf alle viralen Vektoren angewendet werden kann, ohne die Wirksamkeit des Virus in Abwesenheit der entsprechenden microRNAs zu verändern. Hier beschreiben wir experimentelle Methoden, die mit der Generierung eines microRNA-gerichteten Picornavirus verbunden sind, und bewerten die Wirksamkeit und Spezifität dieses Ziels in vitro. Dieses Protokoll ist für ein sich schnell replizierendes Virus mit einem lytischen Replikationszyklus konzipiert, jedoch hilft die Änderung der analysierten Zeitpunkte und der verwendeten spezifischen Virustitrationswerte bei der Anpassung dieses Protokolls an viele verschiedene Viren.

Tabelle 1 zeigt Ergebnisse typisch für einen Titrationsassay für eine Picornavirus und beschreibt , wie die 50% Gewebekultur infektiöse Dosis zu berechnen. Eine schematische Darstellung des Gesamtkonzepts von microRNA-basierten Regulation der viralen in diesem Manuskript beschrieben Tropismus ist in Abbildung 1 die Orientierung der microRNA auf Response - Element während der intrazellulären Wechselwirkungen, die richtige Gestaltung von Response - Element...

Wir beschreiben hier eine Methode zur Regulierung des Picornavirus-Tropismus, indem Sequenzen, die zu spezifischen microRNAs komplementär sind, in das virale Genom eingebaut werden. Dieses Protokoll kann an alle verschiedenen Klassen von Viren angepasst werden, wobei es je nach Länge und Art ihres Lebenszyklus modifiziert wird.

MicroRNA-basierten Regulation der Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, die Effizienz und Spezifität der mikro-RNA-basierten Regulation der Picornavirus-Tropismus in vitro zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Picornaviren hergestellt werden, die mikro-RNA-Antwortelemente in ihrem Genom enthalten. Als zweiter Schritt werden die Viren verwendet, um Zellen zu infizieren, die die entsprechenden mikro-RNAs exprimieren oder nicht exprimieren.Danach sollten die Virusreplikationskinetik, die Vermehrung und die Toxizität evaluiert werden, um die Effizienz und Spezifität der gezielten Beeinflussung zu bestimmen. Diese gezielte Methode kann im Bereich der Virologie eingesetzt werden, um die Sicherheit, Herstellung und Anwendbarkeit von Viren zu verbessern oder um Forschungsarbeiten zu unterstützen, die auf das Verständnis der biologischen Prozesse während einer Virusinfektion abzielen. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen darin, dass nur minimale Modifikationen am viralen Genom erforderlich sind und dass sie äußerst vielseitig ist, da eine beträchtliche Anzahl zellulärer microRNA-Signaturen bereits identifiziert wurde.Um dieses Verfahren zu beginnen, impfen Sie die permissiven Zellen in e

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Ziel-ID-Bibliothek ist ein Plasmid-basierte, Genom-weiten Sammlung von klonierten cDNA verwendet werden, um miRNA-Targets zu identifizieren. Hier zeigen wir, ihre Nutzung und Anwendung.

Genomweiten Screen für miRNA-Targets mit dem Missionsziel ID-Bibliothek

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und haben gezeigt, dass eine Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Um besser zu verstehen miRNA-UTR-Interaktionen, haben wir eine genomweite Sammlung von 3 UTR Luciferase Reporter mit einem neuartigen Luciferase-Gen und Assay-Reagenz, das LightSwitch System gepaart erstellt.

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

Noroviren sind eine bedeutende Ursache von Gastroenteritis noch molekulare Techniken zu ihrer Charakterisierung sind noch relativ neu. Hier berichten wir über zwei verschiedene Ansätze der reversen Genetik für die effiziente Gewinnung von murinen Norovirus (MNV), das einzige Mitglied dieser Gattung, die in Zellkultur vermehrt werden kann.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Quelle: Ruiz, A. J. und Russell, S. J. Mikro-RNA-vermittelte Regulation der Picornavirus-Tropismus. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Verwendung synthetischer microRNA-Mimics zur selektiven Hemmung der viralen Replikation in kultivierten epithelartigen Zellen. Es zeigt, wie die durch microRNAs gesteuerte Genom-Silenzierung die Virusausbreitung blockieren und die Targeting-Spezifität durch nachgeschaltete Infektiositätsanalysen bestätigen kann.

Evaluierung der Hemmung der Virusausbreitung durch microRNA-Mimic-vermitteltes Genomsilencing

Hierin schlagen wir eine Strategie vor, um die Wirkung eines interessierenden Transkriptionsfaktors auf das microRNA-Transkriptom unter Verwendung öffentlich zugänglicher Daten, Rechenressourcen und Hochdurchsatzdaten von microRNA-Arrays nach der Transfektion von Zellen mit kleiner Haarnadel (sh)RNA zu untersuchen, die auf einen interessierenden Transkriptionsfaktor abzielt.

Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Erfahren Sie die mikroRNA-basierte Regulation des Picornavirus-Tropismus durch Einbau komplementärer Sequenzen in das virale Genom. Diese Methode ermöglicht spezifische Kontrolle der viralen Replikation und erhöht die Sicherheit in der Virologieforschung.

MicroRNA-basierten Regulation der Picornavirus Tropism

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