Sammlung von Serum- und Feeder-freie Maus embryonale Zellen konditionierten Medium für eine zellfreie Ansatz Stem

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, konditioniertes Medium aus embryonalen Stammzellen der Maus unter serum- und feederfreien Kulturbedingungen zu gewinnen und die biologischen Funktionen dieses Mediums zu charakterisieren. Dieses Verfahren bietet Einblicke in die Anti-Seneszenz-Aktivität von löslichen Faktoren, die aus embryonalen Stammzellen der Maus sezerniert werden, um einen sicheren und zellfreien Therapieansatz für altersbedingte Erkrankungen zu entwickeln. Dieses Verfahren wird von Dr. Yun-Ui Bae, einem Forschungsprofessor meines Labors, demonstriert.

Behandeln Sie in einer biologischen Schutzhaube eine embryonale Fibroblasten- oder MEF-Zellkultur der Maus mit 20 Millilitern MEF-Medium, das mit Mitomycin C versetzt wurde, in einer 15 Zentimeter großen Zellkulturschale für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und lösen sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit drei Millilitern Trypsin-EDTA ab. Neutralisieren Sie das Trypsin mit sechs Millilitern frischem MEF-Medium, wenn sich die Zellen vom Boden der Platte abgehoben haben.

Nachdem Sie die Zellen durch Zentrifugation gesammelt haben, suspendieren Sie das Pellet erneut in fünf Millilitern MEF-Medium und plattieren Sie es zweimal 10 bis zum sechsten inaktivierten MEF pro 10-Zentimeter-Kulturschale in frischem MEF-Medium. Kultivieren Sie die Feederzellen 24 Stunden lang. Ersetzen Sie dann das MEF-Medium durch embryonales Stammzellmedium der Maus und säen Sie zwei mal 10 bis 10 bis sechste embryonale Stammzellen der Maus für mindestens 48 Stunden Co-Kultur in die Feeder.

Spülen Sie in einer biologischen Sicherheitshaube eine Platte mit embryonalen Stammzellen der Maus mit fünf Millilitern PBS und lösen Sie die Zellen mit Trypsin plus EDTA ab, wie gerade gezeigt. Nachdem Sie die Zellen durch Zentrifugation entnommen haben, suspendieren Sie das Stammzellpellet wieder in fünf Millilitern frischem Stammzellmedium und geben Sie einen Milliliter Zellen pro Schale in frischem embryonalem Stammzellmedium auf fünf mit Gelatine beschichtete Zellkulturschalen. Bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator, bis die Kulturen eine Konfluenz von 80-85 % erreicht haben.

Spülen Sie dann die Zellen in mindestens acht Millilitern PBS pro Platte für drei 10-minütige Wäschen, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation in reduziertem Serummedium. Nach nicht mehr als 24 Stunden wird der Überstand zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Gefolgt von der Filtration durch ein 0,2 Mikrometer großes Sieb mit Flaschenaufsatz.

Um die Wirkungen des embryonalen Stammzellkonditionierungsmediums durch einen Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase-Assay zu testen, säen humane dermale Fibroblasten in einer Sechs-Well-Platte in einem humanen dermalen Fibroblastenmedium. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid wird die Hälfte des Mediums durch frisches, embryonales Stammzellkonditioniertes Medium aus der Maus für weitere 72 Stunden ersetzt. Spülen Sie die Zellen am dritten Tag der Kultur in zwei Millilitern PBS pro Vertiefung für zwei 30-Sekunden-Wäschen.

Fixieren Sie dann die Zellen fünf Minuten lang in 3,7 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur in einem Abzug. Waschen Sie die Zellen nach dem Fixieren zweimal mit zwei Millilitern PBS, wie gerade gezeigt, und markieren Sie die Zellen 17 1/2 Milliliter SA-Beta-Gal-Lösung bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen am Ende der Färbeperiode zweimal, wie gerade gezeigt.

Behandeln Sie dann die Färbung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit Eosen. Nach einem weiteren Satz PBS-Waschungen bilden Sie die Zellen mit einer 100-fachen Vergrößerung durch Lichtmikroskopie ab. Für die Zellzyklusanalyse wird der vierte humane dermale Fibroblast pro Vertiefung in einer sechs Zentimeter großen Zellkulturschale in frischem humanen dermalen Fibroblastenmedium für eine Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ausgesät.

Ersetzen Sie am nächsten Morgen die Hälfte des Mediums durch ein mit embryonalen Stammzellen konditioniertes Medium der Maus und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator. Nach 24 Stunden werden die Zellen durch Trypsin-EDTA-Dissoziation geerntet, gefolgt von zwei Waschgängen in einem Milliliter PBS-Lösung. Suspendieren Sie das Pellet nach dem zweiten Waschen wieder in 100 Mikrolitern kalter PBS-Lösung.

Fixieren Sie dann die Zellen mit der tropfenweisen Anwendung bei 200 Mikrolitern kaltem Ethanol während des Vortexens. Lagern Sie die Zellen mindestens eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie sie dann in frischer PBS-Lösung.

Nach der zweiten Zentrifugation behandeln Sie das Pellet 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid mit 250 Mikrolitern Natriumcitratpuffer, ergänzt mit RNase. Am Ende der Inkubation markieren Sie die Zellen 20 Minuten lang mit 250 Mikrolitern Natriumcitratpuffer, der Propidiumiodid enthält. Beurteilen Sie dann die Zellzyklusstadien jeder Probe durch Durchflusszytometrie.

Für die quantitative Reverse-Transkriptase-PCR-Analyse verwenden Sie ein RNA-Extraktionskit, um die Gesamt-RNA aus embryonalen Stammzell-konditionierten Medium der Maus zu isolieren, die mit humanen dermalen Fibroblasten gemäß dem Protokoll des Herstellers behandelt wurden. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die gesamte extrahierte RNA zu quantifizieren. Formulieren Sie dann ein Reaktionsgemisch, das die Oligo-Desoxythymidin-Primer und die M-MLV-Reverse-Transkriptase gemäß dem Protokoll des Herstellers enthält.

Geben Sie dann ein Mikrogramm der Gesamt-RNA in das PCR-Röhrchen, das das Reaktionsgemisch enthält. Messen Sie abschließend die Amplifikation der CDNA mit einem Real-Time-PCR-Gerät unter Verwendung des grünen PCR-Mastermixes und der entsprechenden Genprimer. Embryonale Stammzellen der Maus, die unter normalen Bedingungen embryonaler Stammzellkulturen der Maus auf einer MEF-Feeder-Zellschicht gezüchtet wurden, weisen eine ovale Form und ein glänzendes Aussehen auf.

Während embryonale Stammzellen der Maus, die unter serum- und feederfreien Kulturbedingungen gezüchtet wurden, eine abgeflachte und unregelmäßige Morphologie aufweisen. Die Behandlung des seneszenten humanen dermalen Fibroblasten mit embryonalen Stammzellkonditionierungsmedium der Maus verringert die Anzahl der seneszenten assoziierten Betagalactosidase-positiven Zellen. Darüber hinaus zeigt die Zellzyklusanalyse dieser Zellen, dass die Behandlung mit embryonalen Stammzellen der Maus die Anzahl der Zellen in der S- und G2/M-Phase drastisch erhöht, während die Anzahl der Zellen in der G0/G1-Phase reduziert wird.

Darüber hinaus verringert die Behandlung mit embryonalen Stammzellen der Maus die Expression von Seneszenz-assoziierten Genen und von Sekretär-Zytokinen, die mit dem seneszenten Phänotyp assoziiert sind. Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, daran zu denken, das Serum und das Feeder-freie Medium nach 24 Stunden zu sammeln, da eine lange Inkubation die Möglichkeit einer Zellautolyse oder Apoptose durch Hungern erhöht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie serum- und feederfreies Medium für embryonale Stammzellen der Maus für einen zellfreien Ansatz sammeln können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien wie Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. der Umgang mit diesem Reagenz in einem Abzug.